一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，對卷煙煙氣進(jìn)行樣品前處理，采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進(jìn)行定性定量分析，所述雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)包括有第一維液相色譜泵、第一分離柱、第二維液相色譜泵、第二分離柱、質(zhì)譜裝置。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)。本發(fā)明提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，樣品前處理簡單，檢測效率高，能有效地去除煙氣中干擾物質(zhì)，取得優(yōu)異的分離度、靈敏度，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【專利說明】
一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于卷煙主流煙氣中重要化學(xué)成分分析的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雙柱液相色 譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卷煙煙氣中的煙草特有亞硝胺（tobacco-specific N-nitrosamines TSNAs)為 Hoffmann清單和七種有害成分評價體系中的煙氣有害物質(zhì)，是煙氣中最重要的化合物之 一，一直以來都是煙草化學(xué)研究的熱點(diǎn)。煙草特有亞硝胺(TSNAs)主要包括4-(N-甲基亞硝 胺基)-1-(3_吡啶基)-1_ 丁酮(NNK)、N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0004] 由于煙氣TSNAs釋放量較低且由于煙氣成分背景復(fù)雜、基質(zhì)干擾嚴(yán)重，難以對其準(zhǔn) 確測定。值得注意的是同等焦油情況下烤煙型比混合型卷煙低一個數(shù)量級左右，因而對卷 煙特別是烤煙型卷煙TSNAs釋放量的準(zhǔn)確定量一直是煙草化學(xué)分析的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0005] 目前，TSNAs的分析方法主要有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)、氣相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜法GC-MS/MS、液質(zhì)聯(lián)用LC-MS/MS法。GC-TEA法存在前處理步驟煩瑣、樣品分析時間長、 檢測靈敏度較低等缺點(diǎn)，而LC-MS法有基質(zhì)干擾嚴(yán)重，方法的靈敏度、檢測限較低等問題。因 此，發(fā)展此類化合物適用的多維液相色譜技術(shù)進(jìn)行分離分析十分必要。
[0006] 多維液相色譜(MDLC)是將分離機(jī)理不同而又相互獨(dú)立的液相分離模式串聯(lián)起來 構(gòu)成的分離系統(tǒng)，樣品在第一根液相色譜柱的目標(biāo)餾分進(jìn)入后面的色譜柱進(jìn)行二次分離， 將其與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用是目前對復(fù)雜樣品分離分析最重要的手段之一。多維液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用系統(tǒng)用來分析煙草及煙氣樣品中各種復(fù)雜基質(zhì)樣品，雖然具有極高的選擇性和靈敏 度，但需綜合考慮流動相的兼容性、閥接口切換及目標(biāo)物的富集還有質(zhì)譜的兼容性，所以建 立在線檢測技術(shù)難度較大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì) 譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中由于卷煙主流煙氣煙草 特有亞硝胺(TSNAs)釋放量較低，基質(zhì)干擾相對嚴(yán)重、難以準(zhǔn)確測定的問題。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì) 譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，對卷煙煙氣進(jìn)行樣品前處理，采用雙柱液相 色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進(jìn)行定性定量分析，所述雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 系統(tǒng)包括有第一維液相色譜、第一分離柱、第二維液相色譜、第二分離柱、質(zhì)譜裝置。
[0009] 較佳地，所述卷煙煙氣中亞硝胺包括有N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝 基氨基比啶基）-1_ 丁酮（NNK)、N-亞硝基假木賊堿（NAB)和N-亞硝基新煙草堿 (NAT)〇
[0010] 較佳地，所述樣品前處理包括以下步驟：
[0011] 1)選取卷煙煙支，點(diǎn)燃后進(jìn)行抽吸，采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣；
[0012] 2)將濾片進(jìn)行超聲萃取后過膜，即得待測樣品。
[0013] 優(yōu)選地，在步驟1)中，所述抽吸采用多孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)進(jìn)行。更優(yōu)選地，所述多 孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)為20孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)。所述20孔道轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)可以一次性抽吸20支 卷煙的煙氣。
[0014] 優(yōu)選地，在步驟1)中，所述濾片為劍橋?yàn)V片。所述劍橋?yàn)V片的直徑為44_。
[0015] 優(yōu)選地，在步驟1)中，所述捕集卷煙煙氣按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19609-2004中規(guī)定方法 進(jìn)行捕集。
[0016] 優(yōu)選地，在步驟2)中，所述萃取溶液為醋酸銨(NH4Ac)水溶液，所述萃取溶液的加 入量為l〇-2〇mL 0. lmol/L的醋酸銨水溶液/20支卷煙煙氣。更優(yōu)選地，所述萃取溶液的加入 量為20mL 0. lmol/L的醋酸銨水溶液/20支卷煙煙氣。所述醋酸銨水溶液，通過稱取醋酸銨， 用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容得到。
[0017]優(yōu)選地，在步驟2)中，所述萃取溶液中還加入內(nèi)標(biāo)溶液，所述內(nèi)標(biāo)溶液的加入量為 l-2mL400ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液/20支卷煙煙氣。更優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液的加入量為lmL 400ng/ mL內(nèi)標(biāo)溶液/20支卷煙煙氣。
[0018] 更優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液通過分別稱取NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU，加入甲醇 定容后獲得。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液中順^(14、順1(-(14、嫩1'-(14、嫩8-(14的濃度均為400即/ mL〇
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述順^(14、順1(-(14、嫩1'-(14、嫩8-(14為氘代試劑。具體的，所述順^ (14、順1(-(14、財(cái)1'-(14、嫩8-(14分別為氘代^亞硝基去甲基煙堿、氘代4-(甲基亞硝基氨基)-1-(3-比啶基)-1_ 丁酮、氖代N-亞硝基新煙草堿、氖代N-亞硝基假木賊堿。
[0021] 所述NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU為商品化試劑，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適于作為內(nèi) 標(biāo)。
[0022]優(yōu)選地，在步驟2)中，所述超聲萃取的時間為10-50min。更優(yōu)選地，所述超聲萃取 的時間為40min。
[0023] 優(yōu)選地，在步驟2)中，所述過膜的方式為水相濾膜過濾方式。更優(yōu)選地，所述水相 濾膜的孔徑為0.22M1。
[0024] 較佳地，所述采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進(jìn)行定性定 量分析，包括以下步驟：
[0025] A)配制標(biāo)準(zhǔn)樣品:配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、內(nèi)標(biāo)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0026] A1)分別稱取嫩8、嫩!\順1^疆的標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；
[0027] 優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為1 Oμg/ml。
[0028] A2)分別稱取NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4，加入甲醇定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液；
[0029] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)溶液中NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4的濃度均為400ng/ml。 [0030] 優(yōu)選地，所述順^(14、財(cái)1'-(14、財(cái)8-(14、順1(-(14為氘代試劑。具體的，所述順1(14、 NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4分別為氘代N-亞硝基去甲基煙堿、氘代4-(甲基亞硝基氨基)-1-( 3-比啶基)_1_ 丁酮、氘代N-亞硝基新煙草堿、氘代N-亞硝基假木賊堿。
[0031] 所述NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4、NNK-d4為商品化試劑，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適于作為內(nèi) 標(biāo)。
[0032] A3)分別移取不同體積的步驟A1中混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再分別加入一定體積的步 驟A2中內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容配制為一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0033]優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0-100ng/ml。
[0034] 優(yōu)選地，所述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)，順^(14、嫩1'-(14、嫩8-(14、順1(-(14的濃度均為1〇1^/ ml 〇
[0035] B)樣品定性檢測:分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測樣品進(jìn)行 雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，在第一維液相色譜作用下，通過第一分離柱進(jìn)行餾分后， 在第二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定，比較 保留時間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測樣品中4種亞硝胺成分；
[0036] C)樣品定量檢測:分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測樣品進(jìn)行 雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，在第一維液相色譜作用下，通過第一分離柱進(jìn)行餾分后， 在第二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定，采用 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測樣品中4種亞硝胺成分的含量。
[0037] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述在第一維液相色譜作用下，通過第一分離柱進(jìn)行 餾分是在第一維液相色譜作用下，將步驟A3配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和經(jīng)樣品前處理后待測樣 品溶液通過第一分離柱進(jìn)行餾分。
[0038] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述在第二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn) 行分離是在第二維液相色譜作用下，將步驟A3配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測樣品通過第二分 離柱進(jìn)行分離。
[0039]優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜的條件為:第一維液相色譜:正 相液相色譜；柱溫：25-35°C ;流速:0.5-1.5mL/min;進(jìn)樣量:5-15yl;第一維流動相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P04+80 -90%H20+10-20%CH3CN(pH=2-4);第一維流動相B 相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P〇4+0.1-1.0mol/L KCl+80-90%H20+10-20%CH3CN (pH=2-4);梯度洗脫。
[0040]更優(yōu)選地，所述第一維液相色譜的條件為：第一維液相色譜：Agilent Technologies 1260Infinity正相液相色譜;柱溫：30°C ;流速：lmL/min;進(jìn)樣量：lOyl;第一 維流動相A相：10mmol/L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);第一維流動 相B相：10mmol/L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+0.5mol/L KCl+85%H2〇+15%CH3CN(pH = 2.8);梯 度洗脫。
[0041] 上述百分比％為體積百分比。
[0042] 最優(yōu)選地，如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0043] 〇-5min，A相:B 相體積比為100:0-90:10;
[0044] 5-5 ? lmin，A相:B 相體積比為90:10-60:40;
[0045] 5 ? l-15min，A相:B 相體積比為60:40-0:100;
[0046] 15-15 ? lmin，A相:B相體積比為0:100-100:0;
[0047] 15. l-40min，A相:B相體積比為 100:0-100:0。
[0048]表1第一維液相色譜的梯度洗脫
[0050]優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一分離柱為強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX)。
[0051 ] 更優(yōu)選地，所述強(qiáng)陽離子交換色譜柱(30乂)為￥3七6^3口1161^8〇1^35 30乂柱(4.6* 150mm,5ym)〇
[0052]優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜的條件為:第二維液相色譜:反 相液相色譜(RPLC);柱溫:25-35 °C ;流速:0.2-0.3mL/min;進(jìn)樣量:5-15yl;第二維流動相A 相：l-10mmol/L NH4Ac+92-98%H2〇+2-8%CH3CN;第二維流動相B相：1-1〇111111〇1/1順4厶〇+92-98 % CH3CN+2-8 % H20;梯度洗脫。
[0053]更優(yōu)選地，所述第二維液相色譜的條件為：第二維液相色譜：A g i 1 e n t Technologies 1260Inf inity反相液相色譜(RPLC);柱溫：30°C ;流速:0? 25mL/min;進(jìn)樣量： l〇yl;第二維流動相A相：5謹(jǐn)〇1/1^冊44。+95%112〇+5%(：113〇1第二維流動相8相 ：5111111〇1/ LNH4Ac+95 % CH3CN+5 % H20;梯度洗脫。
[0054] 上述百分比％為體積百分比。
[0055] 最優(yōu)選地，如表2所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0056] 〇-l〇min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0;
[0057] 10-20min，A相:B 相體積比為 100:0-0:100;
[0058] 20-22min，A相:B 相體積比為0:100-0:100;
[0059] 22-22 ? lmin，A相:B 相體積比為0:100-100:0;
[0060] 22-25min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0。
[0061] 表2第二維液相色譜的梯度洗脫
[0063]優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二分離柱為Trap捕集柱。
[0064] 更優(yōu)選地，所述Trap捕集柱為Thermo scientificAcclaim PolarAdvantagell C18柱（4.6*50mm，3iim)。
[0065] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述質(zhì)譜裝置的條件為：
[0066] 質(zhì)譜:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四極桿質(zhì)譜；電離方式： 電噴霧離子源（ESI);掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);MRM條件：見表3;噴霧（IS)電壓為： 5000V;霧化氣(Gas 1)壓力為:482 ? 6kPa;氣簾氣(Curtain Gas)壓力為:206 ? 7kPa;輔助霧化 氣（Gas2)壓力為：482 ? 6kPa;離子源溫度（TEM)為：500°C ;清洗進(jìn)樣針程序:needle wash 30s;質(zhì)譜流路切換:從lOmin開始掃描，28min結(jié)束。
[0067] 表3 MRM條件
[0069] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一分離柱進(jìn)行餾分后將目標(biāo)物餾分的pH值調(diào) 節(jié)至中性，采用中心切割法，獲得4種亞硝胺成分的餾分。所述4種亞硝胺成分的餾分包括 NNK、NNN、NAT、NAB 餾分。
[0070] 更優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)至中性的pH值為6.8-7.2。
[0071] 所述中心切割法為多維色譜中常用的分離方法，在本發(fā)明的雙柱液相色譜中，即 將在第一維液相色譜作用下，第一分離柱分離出的目標(biāo)物餾分的色譜峰的切割完整，在第 二維液相色譜作用下，轉(zhuǎn)移至第二分離柱捕集保留，其它非目標(biāo)物餾分不進(jìn)第二分離柱。
[0072] 更優(yōu)選地，所述4種亞硝胺成分的餾分是通過第二分離柱分離，并經(jīng)質(zhì)譜裝置通過 質(zhì)譜檢測質(zhì)荷比確定每個色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)。所述4種亞硝胺成分的質(zhì)荷比數(shù)值見表3。所 述NNK餾分的母離子質(zhì)荷比為208.1，子離子質(zhì)荷比為122.1;所述NAB餾分的母離子質(zhì)荷比 為192.1，子離子質(zhì)荷比為162.1;所述NAT餾分的母離子質(zhì)荷比為190.1，子離子質(zhì)荷比為 160.1;所述NNN餾分的母離子質(zhì)荷比為178.1，子離子質(zhì)荷比為148.1。
[0073] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜與第一分離柱之間設(shè)有進(jìn)樣閥。 [0074]更優(yōu)選地，所述進(jìn)樣閥為二位六通閥，所述進(jìn)樣閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第3接口為排廢口，所述第1接 口經(jīng)管線與第一維液相色譜相連通，所述第6接口經(jīng)管線與第一分離柱相連通。
[0075] 優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一分離柱與第二維液相色譜之間設(shè)有連通閥， 所述連通閥與第一分離柱之間設(shè)有混合器，所述混合器分別與所述第一分離柱、連通閥相 連通。
[0076] 更優(yōu)選地，所述連通閥為二位六通閥，所述連通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口經(jīng)管線與第二分離柱的進(jìn)樣端相連通，所述第 4接口經(jīng)管線與第二分離柱的出樣端相連通，所述第2接口經(jīng)管線與第二維液相色譜相連 通，所述第3接口經(jīng)管線與質(zhì)譜裝置相連，所述第5接口為排廢口，所述第6接口經(jīng)管線與混 合器相連通。
[0077] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述第5接口還連接有紫外檢測器，所述紫外檢測器經(jīng)管線與第5 接口相連通。
[0078]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述紫外檢測器的檢測波長為220-240nm。
[0079]最優(yōu)選地，所述紫外檢測器的檢測波長為230nm。
[0080] 更優(yōu)選地，所述混合器還連接有補(bǔ)償栗，所述補(bǔ)償栗經(jīng)管線與混合器相連通。所述 補(bǔ)償栗用于調(diào)節(jié)一維流動相的pH值并稀釋一維流動相中乙腈濃度，所述補(bǔ)償栗可添加也可 不添加。
[0081 ]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗為一元栗。
[0082]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗的條件為：補(bǔ)償流動相為：l-10mmol/L K2HPO4;流速： 0?6_1?0mL/min〇
[0083] 最優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗的條件為：補(bǔ)償流動相為：5mmol/L K2HP〇4;流速：0.8mL/ min〇
[0084] 優(yōu)選地，所述步驟C)中，所述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法包括以下步驟：
[0085] 所述內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是指在標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，進(jìn)行儀器測定，獲得標(biāo)準(zhǔn) 工作曲線，進(jìn)而測定含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的實(shí)際樣品濃度的方法。
[0086] i、將步驟A)的A3中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜 聯(lián)用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比與4種亞硝 胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別計(jì)算得到4 種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程。
[0087] 進(jìn)一步的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面 積比為縱坐標(biāo)(Y軸），其4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸）。
[0088] ii、將經(jīng)樣品前處理后待測樣品溶液，進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測，將獲 得的待測液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比，代入步驟i中相應(yīng)的4 種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得 到待測樣品溶液中4種亞硝胺成分的質(zhì)量濃度。
[0089] 本發(fā)明第二方面提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，包括有第一維液相色譜、 進(jìn)樣閥、第一分離柱、混合器、連通閥、第二維液相色譜、第二分離柱、質(zhì)譜裝置、紫外檢測 器，所述進(jìn)樣閥分別經(jīng)管線與所述第一維液相色譜、第一分離柱的進(jìn)樣端相連通，所述連通 閥分別經(jīng)管線與所述混合器、第二維液相色譜、第二分離柱、質(zhì)譜裝置、紫外檢測器相連通， 所述混合器還經(jīng)管線與所述第一分離柱的出樣端相連通。
[0090]較佳地，所述進(jìn)樣閥為二位六通閥，所述進(jìn)樣閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、 第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第3接口為排廢口，所述第1接口經(jīng) 管線與第一維液相色譜相連通，所述第6接口經(jīng)管線與第一分離柱的進(jìn)樣端相連通。
[0091 ]較佳地，所述連通閥為二位六通閥，所述連通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接口、 第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口經(jīng)管線與第二分離柱的進(jìn)樣端相連通，所述第4接 口經(jīng)管線與第二分離柱的出樣端相連通，所述第2接口經(jīng)管線與第二維液相色譜相連通，所 述第3接口經(jīng)管線與質(zhì)譜裝置相連，所述第5接口為排廢口，所述第5接口經(jīng)管線與紫外檢測 器相連通，所述第6接口經(jīng)管線與混合器相連通。
[0092]較佳地，所述紫外檢測器的檢測波長為220-240nm。優(yōu)選地，所述紫外檢測器的檢 測波長為230nm〇
[0093] 較佳地，所述混合器還連接有補(bǔ)償栗，所述補(bǔ)償栗經(jīng)管線與混合器相連通。
[0094]優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗為一元栗。
[0095] 優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗的條件為：補(bǔ)償流動相為：l-10mm〇l/L K2HP〇4;流速：0.6-1?0mL/min〇
[0096] 更優(yōu)選地，所述補(bǔ)償栗的條件為：補(bǔ)償流動相為：5mmol/L K2HP〇4;流速：0.8mL/ min〇
[0097]所述雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)中的第一維液相色譜、進(jìn)樣閥、第一分離柱、混合 器、連通閥、第二維液相色譜、第二分離柱、質(zhì)譜裝置、紫外檢測器、補(bǔ)償栗要相匹配。所述匹 配是指上述各部件經(jīng)連通后作為一個整體使用時，能夠有效運(yùn)行。
[0098]本發(fā)明第三方面提供一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的使用方法，包括以下步 驟：
[0099] 1)打開第一維液相色譜和進(jìn)樣閥，第一維流動相由進(jìn)樣閥的第1接口進(jìn)入，同時待 測樣品溶液由進(jìn)樣閥的第4接口進(jìn)入，經(jīng)第5接口，與第一維流動相在第6接口混合后，經(jīng)管 線進(jìn)入第一分離柱進(jìn)行餾分；
[0100] 2)多余的第一維流動相，由進(jìn)樣閥的第1接口切換經(jīng)第2接口至第3接口經(jīng)管線排 出；
[0101] 3)打開連通閥，將在步驟1)中第一分離柱進(jìn)行餾分后不含待測成分的溶液，經(jīng)管 線由連通閥的第6接口進(jìn)入，流到第5接口，經(jīng)管線進(jìn)入紫外檢測器進(jìn)行測定后排出；
[0102] 4)切換連通閥至捕集位置，將在步驟1)中第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶 液，由連通閥的第6接口進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線進(jìn)入第二分離柱進(jìn)行分離捕集；
[0103] 5)切換連通閥位置，然后打開第二維液相色譜，同時切斷連通閥的第6接口與第1 接口的連通，第二維流動相由連通閥的第2接口反相進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線將第二分 離柱中分離出的待測成分沖洗出；
[0104] 6)步驟5)中沖洗出的待測成分，切換依次經(jīng)連通閥的第4接口、第3接口，經(jīng)管線進(jìn) 入質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定。
[0105] 優(yōu)選地，步驟4)中，打開補(bǔ)償栗，補(bǔ)償流動相與所述第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測 成分的溶液，經(jīng)管線進(jìn)入混合器后混合，再進(jìn)入連通閥的第6接口。
[0106] 優(yōu)選地，步驟1)和步驟2)的運(yùn)行時間為0~7min;步驟3)和步驟4)的運(yùn)行時間為7 ~12.5min;步驟5)的運(yùn)行時間為12.5~20min;步驟6)的運(yùn)行時間為20~28min。所述步驟 1)和步驟2)的運(yùn)行時間為第一分離柱除雜時間。所述步驟3)和步驟4)的運(yùn)行時間為第二分 離柱分離捕集時間。所述步驟5)的運(yùn)行時間為第二分離柱沖洗時間。所述步驟6)的運(yùn)行時 間為質(zhì)譜測定時間。
[0107] 優(yōu)選地，步驟3)中，所述紫外檢測器用于防止待測成分損失。
[0108] 如上所述，本發(fā)明屬于卷煙主流煙氣中重要化學(xué)成分分析的技術(shù)領(lǐng)域，提供一種 雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，將煙氣樣品經(jīng)過提取后 上樣，采用SCX強(qiáng)陽離子交換柱分離除雜，將目標(biāo)物餾分pH值調(diào)節(jié)至中性，進(jìn)行中心切割，餾 分進(jìn)入捕集柱經(jīng)反相液相色譜分離后由質(zhì)譜進(jìn)行MRM掃描并定量。該方法具有以下有益效 果：
[0109] (1)本發(fā)明提供的一種分析方法，將離子交換和反相液相兩種不同的分離模式串 聯(lián)，根據(jù)兩根色譜柱分離原理正交，很大程度除去雜質(zhì)。其分離效果好且具有良好的兼容 性，能有效地去除煙氣中干擾物質(zhì)，基質(zhì)干擾效應(yīng)大大降低，使4種TSNAs全部實(shí)現(xiàn)基線分 離，取得了優(yōu)異的分離度、靈敏度。
[0110] (2)本發(fā)明提供的一種分析方法，與現(xiàn)有的單柱方法相比，本發(fā)明技術(shù)可顯著改善 卷煙主流煙氣亞硝胺釋放量測定的效果，樣品前處理簡單，溶劑提取后即可上樣。
[0111] (3)本發(fā)明提供的一種分析方法，儀器在線自動運(yùn)行，檢測效率高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確 可靠，適應(yīng)各種類型卷煙特別是低TSNAs釋放量卷煙煙氣測定。
【附圖說明】
[0112] 圖1顯示為本發(fā)明的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0113] 圖中，
[0114] 1、第一維液相色譜，
[0115] 2、進(jìn)樣閥，
[0116] 21、第 1 接口，
[0117] 22、第 2 接口，
[0118] 23、第 3 接口，
[0119] 24、第 4 接口，
[0120] 25、第 5 接口，
[0121] 26、第 6 接口，
[0122] 3、第一分離柱，
[0123] 4、混合器，
[0124] 5、第二分離柱，
[0125] 6、連通閥，
[0126] 61、第 1 接口，
[0127] 62、第 2 接口，
[0128] 63、第 3 接口，
[0129] 64、第 4 接口，
[0130] 65、第 5 接口，
[0131] 66、第 6 接口，
[0132] 7、紫外檢測器
[0133] 8、第二維液相色譜，
[0134] 9、質(zhì)譜裝置，
[0135] 10、補(bǔ)償栗。
[0136] 圖2顯示為傳統(tǒng)一維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析烤煙型卷煙煙氣TSNAs釋放量的MRM 譜圖 2&、213、2(：、2(1、26，其中：
[0137] 圖2a為4種TSNAs釋放量的總MRM譜圖；
[0138] 圖2b為4種TSNAs中NNN釋放量的MRM譜圖；
[0139] 圖2c為4種TSNAs中NAT釋放量的MRM譜圖；
[0140] 圖2d為4種TSNAs中NAB釋放量的MRM譜圖；
[0141] 圖2e為4種TSNAs中NNK釋放量的MRM譜圖。
[0142] 圖3顯示為本發(fā)明的雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析烤煙型卷煙煙氣TSNAs釋放量 的 MRM 譜圖 3&、313、3(：、3(1、36，其中：
[0143] 圖3a為4種TSNAs釋放量的總MRM譜圖；
[0144] 圖3b為4種TSNAs中NNN釋放量的MRM譜圖；
[0145] 圖3c為4種TSNAs中NAT釋放量的MRM譜圖；
[0146] 圖3d為4種TSNAs中NAB釋放量的MRM譜圖；
[0147] 圖3e為4種TSNAs中NNK釋放量的MRM譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0148] 下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0149] 以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí) 施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0150]以下實(shí)施例中使用的試劑及實(shí)驗(yàn)用具均為常規(guī)使用的試劑及實(shí)驗(yàn)用具，均可從市 場上購買獲得。具體使用試劑和儀器如下：
[0151] 1、試劑
[0152] 參比卷煙1R5F、3R4F購自肯塔基煙草發(fā)展研究中心(Kentucky Tobacco Research and Development Center,Lexington,USA);成品卷煙為市售商品；NNN，NNK，NAT，NAB，NNN_ d4，NNK-d4，NAT_d4和NAB_d4(純度^98%，加拿大Toronto Research chemicals公司）；乙 腈，甲醇(色譜純，德國Merk公司）；磷酸，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，醋酸銨(分析純，國藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），超純水(Mi 11 i-Q純水儀，美國Mi 1 lpore公司）。
[0153] 2、儀器
[0154] 第一維液相色譜、第二維液相色譜(Agilent Technologies 1260Infinity系統(tǒng)， Agilent公司）；紫外檢測器(包含在Agilent Technologies 1260Infinity系統(tǒng)中，Agilent 公司）；質(zhì)譜裝置(API4000三重四級桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司）；SCX色譜柱(Waters Spher i sorb S5SCX柱，4.6*150mm、5ym) ; Trap 捕集柱（Thermo scientificAcclaim Polar Advantage n C18,4.6*50mm、3iim);進(jìn)樣閥、連通閥（二位六通閥，美國Agilent 公司）； 補(bǔ)償栗(一元栗，美國Agilent公司）；電子天平(感量:0.0001g，瑞士Mettler Toledo公司）； SW12H超聲儀（瑞士Sono Swiss公司）；Milli-Q純水儀（美國Millpore公司）；RM200A型旋轉(zhuǎn) 式吸煙機(jī)(德國Borgwaldt公司）；混合器(80此三通混合器，Agilent公司）。
[0155] 如圖1所示，本發(fā)明中的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，包括有第一維液相色譜 (1)、進(jìn)樣閥（2)、第一分離柱(3)、混合器(4)、連通閥（6)、第二維液相色譜(8)、第二分離柱 (5)、質(zhì)譜裝置(9)、紫外檢測器(7)，所述進(jìn)樣閥（2)分別經(jīng)管線與所述第一維液相色譜（1)、 第一分離柱(3)的進(jìn)樣端相連通，所述連通閥(6)分別經(jīng)管線與所述混合器(4)、第二維液相 色譜(8)、第二分離柱(5)、質(zhì)譜裝置(9)、紫外檢測器(7)相連通，所述混合器(4)還經(jīng)管線與 所述第一分離柱(3)的出樣端相連通。
[0156] 實(shí)施例1
[0157] 1、樣品前處理
[0158]選取20支卷煙煙支，點(diǎn)燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，具體采用20孔道轉(zhuǎn) 盤式吸煙機(jī)抽吸卷煙，根據(jù)GB/T 19609-2004中規(guī)定方法捕集煙氣，使煙氣吸附于劍橋?yàn)V片 上。將劍橋?yàn)V片置于l〇〇mL錐形瓶中中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲萃取 30-50min，萃取溶液為10-20mL 0. lmol/L NH4Ac水溶液，NH4Ac水溶液是通過稱取乙酸銨，用 水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容得到。萃取溶液中還加入內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液通 過分別稱取NNN-cU、NNK-cU、NAT-d4、NAB-cU，加入甲醇定容后獲得。內(nèi)標(biāo)溶液的加入量為1-2mL 400ng/mL。然后經(jīng)0.22mi水相濾膜過濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測樣品溶液。
[0159] 2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0160] 分別移取10ml濃度為0.1mg/ml的財(cái)8、財(cái)1^順、順1(的標(biāo)準(zhǔn)品，置于10〇11^容量瓶 中，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度 均為l〇μg/ml。同時，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內(nèi)標(biāo)物，加入甲醇 定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為400ng/ml。
[0161] 分別準(zhǔn)確移取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于多個100mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確 加入一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液濃度為〇-l〇〇ng/ml，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為10ng/ml。
[0162] 3、樣品含量的測定
[0163] 分別將2配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和1中待測樣品溶液分別進(jìn)行雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系 統(tǒng)檢測，即將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和待測樣品溶液在第一維液相色譜作用下，通過第一分離 柱進(jìn)行餾分后，在第二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置 進(jìn)行測定，比較保留時間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測液中4種亞硝胺成分；同時采用內(nèi)標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測液中4種亞硝胺成分的含量。
[0164] 具體來說，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別 進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離 子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作 曲線，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸），其4種亞硝 胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸），分別計(jì)算得到4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作 曲線的回歸方程。再將上述1中待測液進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測，將獲得的待測 液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比，代入相應(yīng)的4種亞硝胺成分標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得到待測液中4種亞 硝胺成分的質(zhì)量濃度。
[0165] 其中，所述第一維液相色譜的條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜栗；柱溫： 25-35°C ;流速:0 ? 5-1 ? 5mL/min;進(jìn)樣量:5-15yl;流動相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/ L H3P〇4+8〇-90%H20+10-20%CH3CN(pH=2-4);流動相B相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3PO4+O ? 1 _ 1 ? Omo 1 /L KC1 +80-90 % H2O+10-20 % CH3CN(pH = 2-4);梯度洗脫。
[0166] 如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0167] 〇-5min，A相:B 相體積比為 100:0-90:10;
[0168] 5-5 ? lmin，A相:B 相體積比為90:10-60:40;
[0169] 5 ? l-15min，A相:B 相體積比為60:40-0:100;
[0170] 15-15 ? lmin，A相:B 相體積比為0:100-100:0;
[0171] 15 .l-40min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0。
[0172] 所述第一分離柱為強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX)。
[0173] 在第一維液相色譜作用下，第一分離柱進(jìn)行餾分后將目標(biāo)物餾分的pH值調(diào)節(jié)至中 性，采用中心切割法，獲得4種亞硝胺成分的餾分。第一分離柱分離出的目標(biāo)物餾分的色譜 峰的切割完整，在第二維液相色譜作用下，轉(zhuǎn)移至第二分離柱捕集保留，其它非目標(biāo)物餾分 不進(jìn)第二分離柱。
[0174]所述第二維液相色譜的條件為：第二維液相色譜栗：反相液相色譜栗(RPLC);柱 溫：25-35°C ;流速：0 ? 2-0 ? 3mL/min;進(jìn)樣量：5-15yl;流動相A相：1-1〇111111〇1/1順4六〇+92-98%H20+2-8%CH 3CN;流動相B相：l-10mmol/L NH4Ac+92-98%CH3CN+2-8%H20;梯度洗脫。
[0175] 如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0176] 〇-l〇min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0;
[0177] 10-20min，A相:B 相體積比為 100:0-0:100;
[0178] 20-22min，A相:B 相體積比為0:100-0:100;
[0179] 22-22 ? lmin，A相:B 相體積比為0:100-100:0;
[0180] 22-25min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0。
[0181]所述第二分離柱為Trap捕集柱。
[0182] 所述質(zhì)譜裝置的條件為：
[0183] 質(zhì)譜:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四極桿質(zhì)譜；電離方式： 電噴霧離子源（ESI);掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);MRM條件：見表3;噴霧（IS)電壓為： 5000V;霧化氣(Gas 1)壓力為:482 ? 6kPa;氣簾氣(Curtain Gas)壓力為:206 ? 7kPa;輔助霧化 氣（Gas2)壓力為：482 ? 6kPa;離子源溫度（TEM)為：500°C ;清洗進(jìn)樣針程序:needle wash 30s;質(zhì)譜流路切換:從lOmin開始掃描，28min結(jié)束。
[0184] 另外，本發(fā)明的雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)在具體測定時，如圖1所示，所述第一 維液相色譜與第一分離柱之間設(shè)有進(jìn)樣閥。
[0185] 如圖1所示，所述進(jìn)樣閥為二位六通閥，所述進(jìn)樣閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第3接口為排廢口，所述第1接 口經(jīng)管線與第一維液相色譜相連通，所述第6接口經(jīng)管線與第一分離柱相連通。
[0186] 如圖1所示，所述第一分離柱與第二維液相色譜之間設(shè)有連通閥，所述連通閥與第 一分離柱之間設(shè)有混合器，所述混合器分別與所述第一分離柱、連通閥相連通。
[0187] 如圖1所示，所述連通閥為二位六通閥，所述連通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口經(jīng)管線與第二分離柱的進(jìn)樣端相連通，所述第 4接口經(jīng)管線與第二分離柱的出樣端相連通，所述第2接口經(jīng)管線與第二維液相色譜相連 通，所述第3接口經(jīng)管線與質(zhì)譜裝置相連，所述第5接口為排廢口，所述第6接口經(jīng)管線與混 合器相連通。
[0188] 如圖1所示，所述第5接口還連接有紫外檢測器，所述紫外檢測器經(jīng)管線與第5接口 相連通。所述紫外檢測器的檢測波長為220-240nm。
[0189] 如圖1所示，所述混合器還連接有補(bǔ)償栗，所述補(bǔ)償栗經(jīng)管線與混合器相連通。所 述補(bǔ)償栗用于調(diào)節(jié)一維流動相的pH值并稀釋一維流動相中乙腈濃度。所述補(bǔ)償栗為一元 栗。所述補(bǔ)償栗的條件為:流動相為:1 -1 Ommo 1 /L K2HPO4;流速:0.6-1. OmL/min。
[0190] 如圖1所示，采用雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行測定時，打開第一維液相色譜和 進(jìn)樣閥，第一維流動相由進(jìn)樣閥的第1接口進(jìn)入，同時待測樣品溶液由進(jìn)樣閥的第4接口進(jìn) 入，經(jīng)第5接口，與第一維流動相在第6接口混合后，經(jīng)管線進(jìn)入第一分離柱進(jìn)行餾分;多余 的第一維流動相，由進(jìn)樣閥的第1接口切換經(jīng)第2接口至第3接口經(jīng)管線排出；上述運(yùn)行時間 為0~7min。打開連通閥，將在第一分離柱進(jìn)行餾分后不含待測成分的溶液，經(jīng)管線由連通 閥的第6接口進(jìn)入，流到第5接口，經(jīng)管線進(jìn)入紫外檢測器進(jìn)行測定后排出；切換連通閥至捕 集位置，將在第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液，由連通閥的第6接口進(jìn)入，切換經(jīng) 第1接口，經(jīng)管線進(jìn)入第二分離柱進(jìn)行分離捕集;上述運(yùn)行時間為7~12.5min。切換連通閥 位置，然后打開第二維液相色譜，同時切斷連通閥的第6接口與第1接口的連通，第二維流動 相由連通閥的第2接口反相進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線將第二分離柱中分離出的待測成 分沖洗出；上述運(yùn)行時間為12.5~20min。再將沖洗出的待測成分，切換依次經(jīng)連通閥的第4 接口、第3接口，經(jīng)管線進(jìn)入質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定;上述運(yùn)行時間為20~28min。還可以打開補(bǔ) 償栗，補(bǔ)償流動相與所述第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液，經(jīng)管線進(jìn)入混合器后 混合，再進(jìn)入連通閥的第6接口。
[0191] 實(shí)施例2
[0192] 1、樣品前處理
[0193] 選取20支卷煙煙支，點(diǎn)燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，具體采用20孔道轉(zhuǎn) 盤式吸煙機(jī)抽吸卷煙，根據(jù)GB/T 19609-2004中規(guī)定方法捕集煙氣，使煙氣吸附于劍橋?yàn)V片 上。將劍橋?yàn)V片置于l〇〇mL錐形瓶中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲萃取 40min，萃取溶液為20ml 0.1mol/L NH4Ac水溶液，0.1mol/L NH4Ac水溶液是通過稱取3.85g 乙酸銨，用水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至500ml容量瓶中，加水定容得到。萃取溶液中還加入內(nèi)標(biāo)溶 液，內(nèi)標(biāo)溶液通過分別稱取NNN-cU、NNK-cU、NAT-cU、NAB-cU，加入甲醇定容后獲得。內(nèi)標(biāo)溶液 的加入量為lmL 400ng/mL。然后經(jīng)0.22M1水相濾膜過濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測樣 品溶液。
[0194] 2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0195] 分別移取10ml濃度為0.1mg/ml的財(cái)8、財(cái)1^順、順1(的標(biāo)準(zhǔn)品，置于10〇11^容量瓶 中，加入甲醇定容，配成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)儲備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度 均為lOμg/ml。同時，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內(nèi)標(biāo)物，加入甲醇 定容，配成內(nèi)標(biāo)溶液，內(nèi)標(biāo)溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為400ng/ml。
[0196] 分別準(zhǔn)確移取不同體積混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于多個100mL容量瓶中，再分別準(zhǔn)確 加入一定體積的內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液濃度為〇. 25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為10ng/ml。
[0197] 3、樣品含量的測定
[0198] 分別將2配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液和1中待測樣品溶液分別進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系 統(tǒng)檢測，即將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和待測樣品溶液在第一維液相色譜作用下，通過第一分離 柱進(jìn)行餾分后，在第二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置 進(jìn)行測定，比較保留時間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測液中4種亞硝胺成分；同時采用內(nèi)標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測液中4種亞硝胺成分的含量。
[0199] 具體來說，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別 進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離 子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比的線性關(guān)系，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作 曲線，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸），其4種亞硝 胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸），分別計(jì)算得到4種亞硝胺成分標(biāo)準(zhǔn)工作 曲線的回歸方程。再將上述1中待測液進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測，將獲得的待測 液中4種亞硝胺成分/相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比，代入相應(yīng)的4種亞硝胺成分標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線的回歸方程，并根據(jù)加入相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的已知質(zhì)量濃度，計(jì)算得到待測液中4種亞 硝胺成分的質(zhì)量濃度。
[0200] 其中，所述第一維液相色譜的條件為：第一維液相色譜:Agilent Technologies 1260Inf inity正相液相色譜;柱溫:30°C ;流速：lmL/min;進(jìn)樣量：lOyl;流動相A相：lOmmol/ L KH2P〇4+5mmol/L H3P〇4+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);流動相B相：10mmol/L KH2PO4+ 5mmol/L H3P〇4+0.5mol/L KCl+85%H2〇+15%CH3CN(pH=2.8);梯度洗脫。
[0201]如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0202] 〇-5min，A相:B 相體積比為100:0-90:10;
[0203] 5-5 ? lmin，A相:B 相體積比為90:10-60:40;
[0204] 5 ? l-15min，A相:B 相體積比為60:40-0:100;
[0205] 15-15 ? lmin，A相:B 相體積比為0:100-100:0;
[0206] 15. l-40min，A相:B相體積比為 100:0-100:0。
[0207] 所述第一分離柱為強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX)，所述強(qiáng)陽離子交換色譜柱(SCX)為 Waters Spherisorb S5SCX柱（4.6*150mm，5iim)〇
[0208] 在第一維液相色譜作用下，第一分離柱進(jìn)行餾分后將目標(biāo)物餾分的pH值調(diào)節(jié)至中 性，采用中心切割法，獲得4種亞硝胺成分的餾分。第一分離柱分離出的目標(biāo)物餾分的色譜 峰的切割完整，在第二維液相色譜作用下，轉(zhuǎn)移至第二分離柱捕集保留，其它非目標(biāo)物餾分 不進(jìn)第二分離柱。
[0209] 所述第二維液相色譜的條件為：第二維液相色譜：Agilent Technologies 12601]1；1^11；[丨7反相液相色譜(1^1^0;柱溫：30<€;流速:0.2511117111；[11 ;進(jìn)樣量：10111;流動相八 相：5mmol/L NH4Ac+95 %H20+5 %CH3CN;流動相B相：5mmol/L NH4Ac+95%CH3CN+5%H20;梯度 洗脫。
[0210] 如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0211] 〇-l〇min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0;
[0212] 10-20min，A相:B 相體積比為 100:0-0:100;
[0213] 20-22min，A相:B 相體積比為0:100-0:100;
[0214] 22-22 ? lmin，A相:B 相體積比為0:100-100:0;
[0215] 22-25min，A相:B 相體積比為 100:0-100:0。
[0216] 所述第二分離柱為Trap捕集柱，所述Trap捕集柱為Thermo scientificAcclaim Polar Advantage II Cl 8柱（4.6*50mm，3iim) 〇
[0217] 所述質(zhì)譜裝置的條件為：
[0218] 質(zhì)譜:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四極桿質(zhì)譜；電離方式： 電噴霧離子源（ESI);掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM);MRM條件：見表3;噴霧（IS)電壓為： 5000V;霧化氣(Gas 1)壓力為:482 ? 6kPa;氣簾氣(Curtain Gas)壓力為:206 ? 7kPa;輔助霧化 氣（Gas2)壓力為：482 ? 6kPa;離子源溫度（TEM)為：500°C ;清洗進(jìn)樣針程序:needle wash 30s;質(zhì)譜流路切換:從lOmin開始掃描，28min結(jié)束。
[0219] 另外，本發(fā)明的雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)在具體測定時，如圖1所示，所述第一 維液相色譜與第一分離柱之間設(shè)有進(jìn)樣閥。
[0220] 如圖1所示，所述進(jìn)樣閥為二位六通閥，所述進(jìn)樣閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進(jìn)樣口，所述第3接口為排廢口，所述第1接 口經(jīng)管線與第一維液相色譜相連通，所述第6接口經(jīng)管線與第一分離柱相連通。
[0221] 如圖1所示，所述第一分離柱與第二維液相色譜之間設(shè)有連通閥，所述連通閥與第 一分離柱之間設(shè)有混合器，所述混合器分別與所述第一分離柱、連通閥相連通。
[0222] 如圖1所示，所述連通閥為二位六通閥，所述連通閥設(shè)有第1接口、第2接口、第3接 口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第1接口經(jīng)管線與第二分離柱的進(jìn)樣端相連通，所述第 4接口經(jīng)管線與第二分離柱的出樣端相連通，所述第2接口經(jīng)管線與第二維液相色譜相連 通，所述第3接口經(jīng)管線與質(zhì)譜裝置相連，所述第5接口為排廢口，所述第6接口經(jīng)管線與混 合器相連通。
[0223] 如圖1所示，所述第5接口還連接有紫外檢測器，所述紫外檢測器經(jīng)管線與第5接口 相連通。所述紫外檢測器的檢測波長為230nm。
[0224] 如圖1所示，采用雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行測定時，打開第一維液相色譜和 進(jìn)樣閥，第一維流動相由進(jìn)樣閥的第1接口進(jìn)入，同時待測樣品溶液由進(jìn)樣閥的第4接口進(jìn) 入，經(jīng)第5接口，與第一維流動相在第6接口混合后，經(jīng)管線進(jìn)入第一分離柱進(jìn)行餾分;多余 的第一維流動相，由進(jìn)樣閥的第1接口切換經(jīng)第2接口至第3接口經(jīng)管線排出；上述運(yùn)行時間 為0~7min。打開連通閥，將在第一分離柱進(jìn)行餾分后不含待測成分的溶液，經(jīng)管線由連通 閥的第6接口進(jìn)入，流到第5接口，經(jīng)管線進(jìn)入紫外檢測器進(jìn)行測定后排出；切換連通閥至捕 集位置，將在第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液，由連通閥的第6接口進(jìn)入，切換經(jīng) 第1接口，經(jīng)管線進(jìn)入第二分離柱進(jìn)行分離捕集;上述運(yùn)行時間為7~12.5min。切換連通閥 位置，然后打開第二維液相色譜，同時切斷連通閥的第6接口與第1接口的連通，第二維流動 相由連通閥的第2接口反相進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線將第二分離柱中分離出的待測成 分沖洗出；上述運(yùn)行時間為12.5~20min。再將沖洗出的待測成分，切換依次經(jīng)連通閥的第4 接口、第3接口，經(jīng)管線進(jìn)入質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定;上述運(yùn)行時間為20~28min。還可以打開補(bǔ) 償栗，補(bǔ)償流動相與所述第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液，經(jīng)管線進(jìn)入混合器后 混合，再進(jìn)入連通閥的第6接口。
[0225] 實(shí)施例3
[0226] 如上述實(shí)施例2中2所示，分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，采用甲醇定容，配制濃 度為0.25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL的一系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為 10ng/ml〇
[0227] 將上述配制好的一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián) 用系統(tǒng)檢測，以4種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(biāo)(Y軸），其4 種亞硝胺成分與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)(X軸），進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程的 線性關(guān)系良好，在0.25~100.00ng/mL的線性濃度范圍內(nèi)，4種亞硝胺成分的回歸方程的相 關(guān)系數(shù)R均大于0.999。
[0228] 對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)信號，采用最低濃度標(biāo)樣重復(fù)進(jìn)樣10次，進(jìn)行雙 柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析，以3倍信噪比為方法的檢出限(L0D)，10倍信噪比為定量限 (L0Q)，換算為樣品含量后得出NNK的方法檢出限為0.77ng/cig，定量限為2.56ng/cig ;NAB 的方法檢出限為0.16ng/cig，定量限為0.55ng/cig;NAT的方法檢出限為0.57ng/cig，定量 限為1.89ng/cig;NNN的方法檢出限為0.46ng/cig，定量限為1.52ng/cig;具有較高的靈敏 度。
[0229] 實(shí)施例4
[0230]取相同烤煙型卷煙考察方法的回收率、日內(nèi)重復(fù)性、日間重復(fù)性，即選取已知亞硝 胺濃度樣品，加入已知濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行上述實(shí)施例2中1的前處理，并進(jìn)行雙 柱液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)分析，計(jì)算其回收率。同時對同一待測樣品溶液分別在1日內(nèi)、日 間進(jìn)行平行測定5次(n = 5)，得到4種亞硝胺成分的精密度測定數(shù)據(jù)，結(jié)果見表4。
[0231] 由表4可以看出，目標(biāo)物方法的回收率在93.5~106.2%之間，日內(nèi)重復(fù)性的相對 標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.7~4.9 %之間，日間重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.8~5.9 %之間， 說明本發(fā)明方法的回收率高、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可以滿足定量需要。
[0232] 表4 4種亞硝胺成分的回收率和精密度
[0233]
[0234] 實(shí)施例5
[0235] 采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法與傳統(tǒng)一維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法進(jìn)行比較，分 別選取llmg烤煙型卷煙。第一組采用傳統(tǒng)一維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法，參考標(biāo)準(zhǔn)YC/ T184-2004,具體結(jié)果見圖2。第二組采用上述實(shí)施例2中1的前處理，并進(jìn)行雙柱液相色譜質(zhì) 譜聯(lián)用系統(tǒng)分析，具體結(jié)果見圖3。
[0236] 通過對圖2中2a~2e和圖3中3a~3e所示，可以發(fā)現(xiàn)，采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 法使四種物質(zhì)分離度、檢測靈敏度上均有顯著提升，NNN、NAT和NNK在兩維液相分離基本完 全去除雜質(zhì)干擾，NAB與干擾峰實(shí)現(xiàn)基線分離。
[0237] 實(shí)施例6
[0238] 采用如實(shí)施例2中的本發(fā)明的分析方法測定3R4F卷煙主流煙氣中TSNAs的釋放量， 其順1順1(、嫩1'、嫩8含量分別為106、91、113和13.81^/(^8，與2011年(：01^514組織的19家實(shí) 驗(yàn)室共同實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值進(jìn)行了比較，采用本方法的測定結(jié)果與C0RESTA共同實(shí)驗(yàn)均值RSD 在5.5%以內(nèi)，表明雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法方法測卷煙煙氣TSNAs釋放量準(zhǔn)確可靠。
[0239] 另外，選取不同盒標(biāo)焦油的混合型和烤煙型卷煙，采用如實(shí)施例2中的本發(fā)明的分 析方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。由表5可知，混合型卷煙NNN釋放量范圍59.0~347ng/cig，NAT 釋放量范圍126~201ng/cig，NAB釋放量范圍16.5~25 . lng/cig，NNK釋放量范圍59.0~ 81 ? 5ng/cig。烤煙型卷煙NNN釋放量范圍4.6~8 ? 7ng/cig，NAT釋放量范圍14.6~29 ? 5ng/ cig，NAB釋放量范圍1.2~2.8ng/cig，NNK釋放量范圍4.4~5.4ng/cig。與傳統(tǒng)方法測定樣 品的含量水平一致，該方法具有較好的準(zhǔn)確性。其中，樣品的含量(ng/cig)是將本發(fā)明的分 析方法測定的樣品濃度(ng/mL) X 20mL/20cig后獲得。
[0240] 表5部分市售卷煙TSNAs釋放量
[0241]
[0242] 綜上所述，本發(fā)明表明，運(yùn)用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析卷煙主流煙氣亞硝胺 釋放量本，具有較好的效果，結(jié)果顯示：該方法靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，標(biāo)準(zhǔn)卷煙 3R4F定量結(jié)果與⑶RESTA共同實(shí)驗(yàn)均值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.5%以內(nèi)。因此，在線雙柱液相色 譜串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確可靠、檢測限低，適應(yīng)各種類型卷煙特別是低TSNAs釋放量卷煙煙氣測 定。所以，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。
[0243] 上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，對卷煙煙氣 進(jìn)行樣品前處理，采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進(jìn)行定性定量分 析，所述雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)包括有第一維液相色譜、第一分離柱、第二維液相色 譜、第二分離柱、質(zhì)譜裝置。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，所述卷煙煙氣中亞硝胺包括有N-亞硝基去甲基煙堿、4-(甲基亞硝 基氨基)-1-( 3-比啶基)-1 - 丁酮、N-亞硝基假木賊堿和N-亞硝基新煙草堿。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，所述樣品前處理包括以下步驟： 1) 選取卷煙煙支，點(diǎn)燃后進(jìn)行抽吸，采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣； 2) 將濾片進(jìn)行超聲萃取后過膜，即得待測樣品。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，所述采用雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進(jìn)行 定性定量分析，包括以下步驟： A) 配制標(biāo)準(zhǔn)樣品:配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、內(nèi)標(biāo)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液； B) 樣品定性檢測:分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測樣品進(jìn)行雙柱 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，在第一維液相色譜作用下，通過第一分離柱進(jìn)行餾分后，在第 二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定，比較保留 時間、質(zhì)譜掃描進(jìn)行定性，確定待測樣品中4種亞硝胺成分； C) 樣品定量檢測:分別將步驟A)配制的標(biāo)準(zhǔn)樣品和經(jīng)樣品前處理后待測樣品進(jìn)行雙柱 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，在第一維液相色譜作用下，通過第一分離柱進(jìn)行餾分后，在第 二維液相色譜作用下，由所述第二分離柱進(jìn)行分離，再由所述質(zhì)譜裝置進(jìn)行測定，采用內(nèi)標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行MRM定量，獲得待測樣品中4種亞硝胺成分的含量。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，步驟B)或C)中，所述第一分離柱為強(qiáng)陽離子交換色譜柱;所述第一 維液相色譜的條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜；柱溫：25-35°C ;流速:0.5-1.5mL/ min;進(jìn)樣量：5-15μ1;第一維流動相A相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L H3P〇4+8〇-90%H20 + 10-20%CH3CN，pH=2-4;第一維流動相B相：5-15mmol/L KH2P〇4+l_10mmol/L Η3Ρ〇4+0·1-1 · Omol/L KC1+80-90%H20+10-20 %CH3CN，pH=2-4;梯度洗脫。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?0-5min，A相:B相體積比為 100:0-90:10; 5-5 · lmin，A相:B相體積比為90:10-60:40; 5.1-1511^114相:8相體積比為60:40-0:100 ; 15-15 .lmin，A相:B相體積比為0:100-100:0; 15 .l-40min，A相:B相體積比為 100:0-100:0。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，步驟B)或C)中，所述第二分離柱為Trap捕集柱;所述第二維液相色 譜的條件為:第二維液相色譜:反相液相色譜;柱溫:25-35°C ;流速:0.2-0.3mL/min; 進(jìn)樣量：5-15μ1;第二維流動相A相：l-10mmol/L NH4AC+92-98%H20+2-8%CH3CN;第二 維流動相B相：1-1 Ommo 1/L NH4Ac+92-98 % CH3CN+2-8 % H20;梯度洗脫。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?0-10min，A相:B相體積比為 100:0-100:0; 10-20min，A相:B相體積比為 100:0-0:100; 20-22min，A相:B相體積比為0:100-0:100; 22-22 · lmin，A相:B相體積比為0:100-100:0; 22-25min，A相:B相體積比為 100:0-100:0。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的 分析方法，其特征在于，步驟B)或C)中，所述質(zhì)譜裝置的條件為： 質(zhì)譜:Agilent Technologies 6460Triple Quad MS三重四極桿質(zhì)譜；電離方式：電噴 霧離子源;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM;噴霧電壓為:5000V;霧化氣壓力為:482.6kPa;氣簾氣 壓力為：206 · 7kPa;輔助霧化氣壓力為:482 · 6kPa;離子源溫度為：500°C ;清洗進(jìn)樣針程序： needle wash 30s;質(zhì)譜流路切換:從10min開始掃描，28min結(jié)束。10. -種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，其特征在于，包括有第一維液相色譜（1)、進(jìn)樣閥 (2) 、第一分離柱(3)、混合器(4)、連通閥（6)、第二維液相色譜(8)、第二分離柱(5)、質(zhì)譜裝 置(9)、紫外檢測器(7)，所述進(jìn)樣閥（2)分別經(jīng)管線與所述第一維液相色譜（1)、第一分離柱 (3) 的進(jìn)樣端相連通，所述連通閥（6)分別經(jīng)管線與所述混合器(4)、第二維液相色譜(8)、第 二分離柱(5)、質(zhì)譜裝置(9)、紫外檢測器(7)相連通，所述混合器(4)還經(jīng)管線與所述第一分 離柱(3)的出樣端相連通。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，其特征在于，所述進(jìn)樣閥 (2)為二位六通閥，所述進(jìn)樣閥設(shè)有第1接口（21)、第2接口（22)、第3接口（23)、第4接口 (24 )、第5接口（ 25 )、第6接口（ 26 )，所述第4接口（ 24)為進(jìn)樣口，所述第3接口（ 23)為排廢口， 所述第1接口（21)經(jīng)管線與第一維液相色譜（1)相連通，所述第6接口（26)經(jīng)管線與第一分 離柱(3)的進(jìn)樣端相連通。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，其特征在于，所述連通閥 (6)為二位六通閥，所述連通閥設(shè)有第1接口（61 )、第2接口（62 )、第3接口（63 )、第4接口 (64) 、第5接口（65)、第6接口（66)，所述第1接口（61)經(jīng)管線與第二分離柱(5)的進(jìn)樣端相連 通，所述第4接口（64)經(jīng)管線與第二分離柱(5)的出樣端相連通，所述第2接口（62)經(jīng)管線與 第二維液相色譜（8)相連通，所述第3接口（63)經(jīng)管線與質(zhì)譜裝置（9)相連，所述第5接口 (65) 為排廢口，所述第5接口（65)經(jīng)管線與紫外檢測器(7)相連通，所述第6接口（66)經(jīng)管線 與混合器(4)相連通。13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，其特征在于，所述混合器 (4) 還連接有補(bǔ)償栗（10)，所述補(bǔ)償栗（10)經(jīng)管線與混合器(4)相連通。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，其特征在于，所述補(bǔ)償栗 (10)的條件為:補(bǔ)償流動相為：l_10mm〇l/L K2HPO4;流速:0.6-1 .OmL/min。15. -種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的使用方法，包括以下步驟： a)打開第一維液相色譜和進(jìn)樣閥，第一維流動相由進(jìn)樣閥的第1接口進(jìn)入，同時待測樣 品溶液由進(jìn)樣閥的第4接口進(jìn)入，經(jīng)第5接口，與第一維流動相在第6接口混合后，經(jīng)管線進(jìn) 入第一分離柱進(jìn)行餾分； b) 多余的第一維流動相，由進(jìn)樣閥的第1接口切換經(jīng)第2接口至第3接口經(jīng)管線排出； c) 打開連通閥，將在步驟a)中第一分離柱進(jìn)行餾分后不含待測成分的溶液，經(jīng)管線由 連通閥的第6接口進(jìn)入，流到第5接口，經(jīng)管線進(jìn)入紫外檢測器進(jìn)行測定后排出； d) 切換連通閥至捕集位置，將在步驟a)中第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液， 由連通閥的第6接口進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線進(jìn)入第二分離柱進(jìn)行分離捕集； e) 切換連通閥位置，然后打開第二維液相色譜，同時切斷連通閥的第6接口與第1接口 的連通，第二維流動相由連通閥的第2接口反相進(jìn)入，切換經(jīng)第1接口，經(jīng)管線將第二分離柱 中分離出的待測成分沖洗出； f) 步驟e)中沖洗出的待測成分，切換依次經(jīng)連通閥的第4接口、第3接口，經(jīng)管線進(jìn)入質(zhì) 譜裝置進(jìn)行測定。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的一種雙柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的使用方法，其特征在于， 步驟d)中，打開補(bǔ)償栗，補(bǔ)償流動相與所述第一分離柱進(jìn)行餾分后含待測成分的溶液，經(jīng)管 線進(jìn)入混合器后混合，再進(jìn)入連通閥的第6接口。
【文檔編號】G01N30/88GK106053675SQ201610625682
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月2日
【發(fā)明人】陳敏, 王磊君, 吳達(dá), 劉百戰(zhàn)
【申請人】上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司