Hplc 法測(cè)定復(fù)方小艾飛中黃酮類成分和胡椒堿的含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中黃酮類成分和胡椒堿的含量的方法，包括如下步驟：稱取復(fù)方小艾飛樣品，用甲醇提取，提取液過濾，得到的供試溶液上高效液相色譜儀，根據(jù)測(cè)得的色譜峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的含量，色譜條件為：C18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相：乙睛A?1%磷酸溶液B?甲醇C，梯度洗脫：0～12min，28%A∶52%B∶20%C，12～13min 28%A→30%A，52%B→50%B，20%C→20%C，13～45min 30%A∶50%B∶20%C。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
【專利說明】
HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中黃酮類成分和胡椒堿的含量的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中槲皮素等4 種黃酮類成分和胡椒堿的含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 復(fù)方小艾飛由維吾爾藥高良姜、干姜、胡椒、金錢白花蛇、蓽茇組成，是由維吾爾醫(yī) 學(xué)驗(yàn)證并長(zhǎng)期在我區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院使用的醫(yī)院復(fù)方制劑。目前臨床應(yīng)用時(shí)將復(fù)方中各藥味 共研細(xì)粉，加以煉蜜制成膏劑服用，具有抗腫瘤（胃癌)等功能，本課題組之前對(duì)復(fù)方小艾飛 蜜膏體外抗腫瘤活性篩選、體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)、抗炎活性實(shí)驗(yàn)、體外抗氧化活性篩選，對(duì) 其化學(xué)成分進(jìn)行分析、開展有效成分提取工藝研究，為該制劑二次開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理 論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。相關(guān)文獻(xiàn)已研究表明，高良姜、干姜中含有槲皮素、山柰素、喬松素、高 良姜素等黃酮類成分，而且有較強(qiáng)的抗?jié)儭⒖垢篂a、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗缺氧、抗凝、抗血 栓形成等作用;最近有研究發(fā)現(xiàn)，高良姜中的化學(xué)成分還有一定的預(yù)防皮膚癌的功能。黑胡 椒、蓽撥中含有胡椒堿等生物堿類成分，具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制作用;研究表明蓽茇中主要 化學(xué)成分胡椒堿抑制單胺氧化酶(MA0)發(fā)揮抗抑郁作用。
[0003]由于目前臨床應(yīng)用該劑型較為粗糙、用藥劑量難以控制，從而往往影響藥效。因 此，如何測(cè)定復(fù)方小艾飛中槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素等4種黃酮類成分及胡椒堿的 含量，為該藥的質(zhì)量控制提供有效的方法依據(jù)，以進(jìn)一步提高該藥的制劑科學(xué)性。其中，槲 皮素（a，Quercetin)、山柰素（13，1(&6111卩1^1'1(16)、喬松素（(3，？;[11006111131'；[11)、高良姜素（(1， Galangin)和胡椒堿(6，？1口61'；[116)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的提供一種HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜 素等4種黃酮類成分以及胡椒堿的含量的方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中黃酮類成分和胡椒堿的含量的方法，所述的黃酮類成分為 槲皮素、山柰素、喬松素和高良姜素，包括如下步驟： (1) 以槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿為對(duì)照品，對(duì)照品用甲醇溶解，配制 成混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液； (2) 混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液上高效液相色譜儀，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡 椒堿的色譜峰面積，從而得到槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的濃度與峰面積 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，色譜條件為:C 18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相:乙睛-lv%磷酸溶液-甲醇，梯 度洗脫：〇~12min，28%A: 52%B: 20%C，12~13min 28%A-30%A，52%B450%B，20%C-20%C， 13~45min 30%A:50%B:20%C，其中，A為乙睛，B為lv%磷酸溶液，C為甲醇； (3) 稱取復(fù)方小艾飛樣品，用甲醇提取，提取液過濾，得到供試溶液； (4) 供試溶液上高效液相色譜儀，色譜條件與步驟(2)相同，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松 素、高良姜素和胡椒堿的色譜峰面積，再根據(jù)步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出槲皮素、山柰素、喬 松素、高良姜素和胡椒堿的含量。
[0006] 進(jìn)一步，步驟(3)采用超聲波提取，料液比為1:100-200,超聲波功率為200-300W， 頻率為50-100沾^，時(shí)間為30-60111111。
[0007] 優(yōu)選地，超聲波提取時(shí)，料液比為1:130-140，超聲波功率為200-250W，頻率為50- 60 kHz，時(shí)間為40-45min。
【附圖說明】
[0008] 附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為復(fù)方小艾飛樣品的色譜圖，其中，A為對(duì)照品，B為復(fù)方小艾飛樣品，1為槲皮素，2 為山柰素，3為喬松素，4、高良姜素，5為胡椒堿。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0010] 槲皮素對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)多98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100081 - 200907)，山柰素對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)彡98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110861 - 201310)，喬松素對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)彡98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111829 - 201102)，高良姜素對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)多98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111699 一200501)，胡椒堿對(duì)照品（含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)彡98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110755 一 201405)，甲醇、乙腈（色譜純，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司），HPLC水（自 制），甲醇、磷酸(分析純，天津市永晟精細(xì)化工有限公司）。
[0011] 溶液的制備 1.1混合對(duì)照品洛液的制備 精密稱取對(duì)照品槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿各約l〇mg，用甲醇分別配 制成質(zhì)量濃度均約為〇. 〇4mg /ml的對(duì)照儲(chǔ)備溶液。精密量取上述槲皮素、山柰素對(duì)照儲(chǔ)備 液1.0 mL，喬松素對(duì)照儲(chǔ)備液2.0 mL，高良姜素、胡椒堿對(duì)照儲(chǔ)備液3.0 mL，置于同一 10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照儲(chǔ)備溶液。
[0012 ] 1.2供試品溶液制備 取復(fù)方小艾飛樣品約〇. 3 g，精密稱定。置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲提?。?50 W，59 kHz) 45 min，冷卻至室溫后，用甲醇補(bǔ)足減失的 質(zhì)量，搖勾。于10000 r.mirT1離心8 min，用0. 45 Ml微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即作為 供試溶液。
[0013] 1.3色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Hypersil BDS C18 色譜柱（4.6 mmX250mm，5 um)，流動(dòng)相：乙睛（A)_lv% 磷酸溶液 (B)-甲醇(C)，流速為1. 0 mL.min-S柱溫30 °C，進(jìn)樣量20uL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，梯度洗脫 (A\B\C的體積百分?jǐn)?shù)變化）：0~12min，28%A: 52%B: 20%C; 12~13min 28%A-30%A，52%B- 50%B，20%C-20%C; 13~45min 30%A: 50%B: 20%C，表示線性變化。
[0014] 1.4線性關(guān)系 分別精密量取混合對(duì)照儲(chǔ)備液〇.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.411^，分別置1〇11^量瓶 中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照溶液。分別取各系列質(zhì)量濃度混合對(duì)照溶 液上高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)樣分析，以峰面積（Y)為縱坐標(biāo)，溶液的質(zhì)量濃度（X，mg? I/ 1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到槲皮素的回歸方程為Y =357314X-88066 ( r = 0.9999)，山柰素的回歸方程為Y =442853X-74204 ( r =0.9999)，喬松素的回歸方程為Y =647926X-327436 ( r =0.9999)，高良姜素的回歸方程為 Y =471672X-256408 ( r = 0. 9999)，胡椒堿的回歸方程為Y =290000X-391906 ( r =0.9999)。結(jié)果表明：槲皮素、山 柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的質(zhì)量濃度分別在1.6~9.6 mg* I/1、！.6~9.6 mg* I/1、 3.2~19.2 mg. L'4.8~28.8 mg. L-\4.8~28.8 mg. L-1內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān) 系。
[0015] 1.5樣品的測(cè)定 取復(fù)方小艾飛按"1. 2"條方法制備供試溶液，在"1. 3"條色譜條件下，上高效液相色 譜儀進(jìn)行分析，用外標(biāo)法計(jì)算槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的含量，結(jié)果見表 1〇
[0016]表1樣品含量測(cè)定結(jié)果（n =3)
1.6精密度試驗(yàn) 在上述色譜條件下，取同一混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松 素、高良姜素和胡椒堿的峰面積的RSD(n= 6)分別為0.8%，0.6%，1.2%，1.2%，1.0%。
[0017] 1.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批復(fù)方小艾飛按" 2.2 "方法平行制備供試溶液6份，在"1. 3"條色譜條件下 分別進(jìn)樣分析，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿含量的RSD分別為2.8%、 2.7%、2.3%、1.9%和1.7%。表明方法重復(fù)性良好。
[0018] 1.8穩(wěn)定性試驗(yàn) 在上述色譜條件下，取同一份供試品溶液分別于0,2,4,6,8，10，12,24 1!重復(fù)進(jìn)樣，測(cè) 得槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的峰面積的RSD(n=8)分別為2.2%、2.0%、 2.5%、2.0%、2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0019] 1.9加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的復(fù)方小艾飛9份，每份約0. 15 g。按低、中、高質(zhì)量濃度分別 精密加入質(zhì)量濃度為40 mg .I/1槲皮素0? 3、0. 6、0. 9 mL，質(zhì)量濃度為40 mg .I/1山柰 素0.1、0.2、0.3 11^、質(zhì)量濃度為80 11^.1/1喬松素0.1、0.2、0.3 1^、質(zhì)量濃度為120 mg*L-1高良姜素對(duì)照溶液0. 1、0. 2、0. 3 mL和質(zhì)量濃度為mg?L-1胡椒堿對(duì)照溶液0. 1、 0. 2、0. 3 mL，每一質(zhì)量濃度制備3份。按"1. 2"條方法制備所需溶液，分別進(jìn)樣分析， 加樣回收率計(jì)算結(jié)果見表2。
[0020] 表2回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)
流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相中加入適量乙腈能保證較短的分析時(shí)間，加入少量酸可抑制組 分解離、避免色譜峰拖尾。其次，槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿中，前四種均為 黃酮類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，呈弱酸性，采用甲醇作為流動(dòng)相可以提高分離的 效率與選擇性。并用梯度洗脫時(shí)，待測(cè)的5種成分的色譜峰峰形良好，分離效果好，故本實(shí)驗(yàn) 最終采用含乙腈、甲醇、磷酸水溶液的溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相。
[0021] 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇將混合對(duì)照儲(chǔ)備溶液進(jìn)樣分離后，利用DAD檢測(cè)器在波長(zhǎng)200 ~400 nm內(nèi)掃描其吸收光譜，槲皮素、山柰素、喬松素和高良姜素分別在280、270、290和 265 nm和處有最大吸收，胡椒堿，胡椒堿最佳吸收為340nm，在280nm處有吸收且共同吸收最 大。考慮到槲皮素、胡椒堿在280nm處均有最大吸收，而且槲皮素含量最低，故選擇波長(zhǎng)280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)，藥材中外源性物質(zhì)在此波長(zhǎng)下不干擾槲皮素的測(cè)定。
[0022] 供試品溶液制備方法的選擇比較了加熱回流提取超聲提取。但超聲提取方法簡(jiǎn) 單，容易操作，在超聲提取時(shí)間方面，考慮了 301^11、451^11、60111111，提取溶劑用量(30,40,50， 60 mL)進(jìn)行考察，結(jié)果表明在權(quán)衡之下，甲醇、40mL、40min/次提取率高。因此選擇甲醇為提 取溶劑，進(jìn)行超聲提取。
[0023] 測(cè)定結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)研究表明，在同一色譜條件下，可同時(shí)測(cè)得槲皮素、山柰素、 喬松素、尚良姜素和胡椒堿的含量。
[0024] 最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. HPLC法測(cè)定復(fù)方小艾飛中黃酮類成分和胡椒堿的含量的方法，所述的黃酮類成分 為槲皮素、山柰素、喬松素和高良姜素，包括如下步驟： (1) 以槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿為對(duì)照品，對(duì)照品用甲醇溶解，配制 成混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液； (2) 混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液上高效液相色譜儀，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡 椒堿的色譜峰面積，從而得到槲皮素、山柰素、喬松素、高良姜素和胡椒堿的濃度與峰面積 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，色譜條件為:C 18色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相:乙睛-lv%磷酸溶液-甲醇，梯 度洗脫：〇~12min，28%A: 52%B: 20%C，12~13min 28%A-30%A，52%B450%B，20%C-20%C， 13~45min 30%A:50%B:20%C，其中，A為乙睛，B為lv%磷酸溶液，C為甲醇； (3) 稱取復(fù)方小艾飛樣品，用甲醇提取，提取液過濾，得到供試溶液； (4) 供試溶液上高效液相色譜儀，色譜條件與步驟(2)相同，測(cè)得槲皮素、山柰素、喬松 素、高良姜素和胡椒堿的色譜峰面積，再根據(jù)步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出槲皮素、山柰素、喬 松素、高良姜素和胡椒堿的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)采用超聲波提取，料液比為1:100-200，超聲波功率為200-300W，頻率為50-100 kHz，時(shí)間為30-60min。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，超聲波提取時(shí)，料液比為1:130-140，超聲 波功率為200-250W，頻率為50-60 kHz，時(shí)間為40-45min。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK106053672SQ201610603976
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月28日
【發(fā)明人】熱娜·卡斯木, 張濤濤, 米仁沙·牙庫甫
【申請(qǐng)人】新疆醫(yī)科大學(xué)