一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，屬于色氨酸的檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測方法通過特定的樣品前處理、HPLC分析準(zhǔn)備和色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，具有較高的靈敏度和精確度，檢測限低，重現(xiàn)性較好，快速，定性和定量準(zhǔn)確且回收率較高，能夠準(zhǔn)確分析飼料中的色氨酸，可用于大規(guī)模樣品檢測，適于標(biāo)準(zhǔn)化。
【專利說明】
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種飼料中氨基酸的檢測方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，屬于色氨酸的檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]色氨酸通常以游離或結(jié)合態(tài)廣泛存在于生物體中，是人類和動物必需的8種氨基酸之一，其作為一種功能性的氨基酸，在動物體組成、攝食、免疫、抗應(yīng)激等方面發(fā)揮著重要的作用。在對畜禽動物的研究中發(fā)現(xiàn)，低蛋白質(zhì)飼料中添加色氨酸，可以提高動物的攝食量、生長性能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，可獲得與高蛋白質(zhì)飼料相似的生長性能。色氨酸對生物的生長和氮平衡非常重要，可參與動物體內(nèi)血漿蛋白質(zhì)的更新，可促使核黃素發(fā)揮作用，還有助于煙酸及血紅素的合成，可顯著增加懷孕動物胎仔體內(nèi)抗體，對泌乳期的乳牛和母豬有促進(jìn)泌乳作用。色氨酸缺乏會引起一系列疾病，當(dāng)畜禽缺乏色氨酸時，生長停滯，體重下降，脂肪積累降低。而動物體本身不能合成色氨酸，因此飼料中色氨酸的平衡和補充就顯得十分重要。
[0003]現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15400-1994《飼料中色氨酸測定方法分光光度法》，分光光度法易受顏色較深或某些復(fù)雜組分的干擾，而隨著高效液相色譜儀的普及，液相色譜法越來越多被應(yīng)用于準(zhǔn)確定量。2000年頒布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246-2000《飼料中氨基酸的測定》附錄A中，將色氨酸的測定方法改為高效液相色譜法。然而，該標(biāo)準(zhǔn)使用的流動相是甲醇和乙酸鈉緩沖液(調(diào)節(jié)pH=4.0)，其主要的弊端有以下兩個:一是出峰較慢，分析時間長;二是色氨酸在220 nm和280 nm波長下有較強吸收，220 nm比280 nm的響應(yīng)高6倍，而乙酸鈉和甲醇在220 nm處有吸收，會干擾樣品測定，所以檢測波長一般都選用280 nm，對于低含量樣品，檢測靈敏度不高。同時，樣品前處理方法費時、耗力，水解過程不易控制，如中途停電，烘箱溫度控制失效等均給水解過程帶來麻煩。
[0004]隨著國內(nèi)外儀器配置水平的不斷提高，價格適中、準(zhǔn)確度較高的高效液相色譜方法日益受到重視。因此，建立一種可靠的飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，可為飼料配方調(diào)整提供理論依據(jù)，對于指導(dǎo)飼料企業(yè)生產(chǎn)、加強飼料產(chǎn)品控制具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有高效液相色譜法測定飼料中色氨酸的方法出峰較慢，分析時間長，測定會受到干擾，檢測靈敏度不高的問題，提供一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，具有較高的靈敏度和精確度，重現(xiàn)性較好，快速，定性和定量準(zhǔn)確且回收率較高，能夠準(zhǔn)確分析飼料中的色氨酸。
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:包括以下步驟:
A、樣品前處理
將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為600-1000 W，控制溫度為在10-30 min內(nèi)從常溫升至150-170 °C，然后保溫20-40 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測；
B、HPLC分析準(zhǔn)備
色譜柱:Syncronis Cis 色譜柱，250 X 4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm;流動相:等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)；
C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0007]上述步驟為本發(fā)明的基本技術(shù)方案。取不同的實際樣品，根據(jù)步驟A樣品前處理后(水解后的水解液處理為常規(guī)處理即可)，按步驟B中檢測條件進(jìn)行檢測，并利用步驟C中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中色氨酸的含量。
[0008]本發(fā)明在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品19-21 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.5-1 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5 mo I/L氫氧化鈉溶液120-150 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在600-1000 W功率條件下，在10-30 min內(nèi)從常溫升至150-170 °C，然后保溫20-40 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勾后，10000 !"/!^!!離心^) min，過0.22 μπι濾膜，待高效液相色譜檢測。
[0009]本發(fā)明在步驟A中，所述準(zhǔn)確稱取樣品19-21 mg精確至0.01 mg。
[0010]本發(fā)明在步驟C中，所述的色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制具體為:準(zhǔn)確稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(純度彡99.5%)，用適量水和數(shù)滴0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解，并用水定容至50 mL;分別準(zhǔn)確吸取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用水配制成濃度分別為0.2 pg/mL,2.0 pg/mL,4.0 pg/mL,20.0 pg/mL,40.0 yg/mL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，供上機使用;采用步驟B的條件進(jìn)行測定，以峰面積Y對濃度X(yg/mL)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過不斷降低標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，取信噪比為3時的濃度為檢出限，檢出限為0.02 yg/rnL。
[0011]本發(fā)明帶來的有益技術(shù)效果:
1、本發(fā)明解決了現(xiàn)有高效液相色譜法測定飼料中色氨酸的方法出峰較慢，分析時間長，測定會受到干擾，檢測靈敏度不高的問題，提供了一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法。該方法具有較高的靈敏度和精確度，檢測限低，重現(xiàn)性較好，快速，定性和定量準(zhǔn)確且回收率較高，能夠準(zhǔn)確分析飼料中的色氨酸，可用于大規(guī)模樣品檢測，適于標(biāo)準(zhǔn)化。
[0012]2、本發(fā)明采用特定的乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為流動相，結(jié)合特定的檢測條件，分離情況大為改觀，并且可以大大降低流動相的背景干擾，對低含量樣品有較高的靈敏度。另外能夠選用220nm作為檢測波長，降低了色氨酸的檢出限。
[0013]3、本發(fā)明采用微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備，結(jié)合特定的水解工藝參數(shù)，易于控制水解條件，重現(xiàn)性好，大大縮短了分析時間，提高了檢測效率，能夠適用于大規(guī)模樣品的快速檢測。
【附圖說明】
[OOM]圖1為色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖；
圖2為色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為色氨酸濃度，縱坐標(biāo)為色氨酸色譜峰峰面積。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟:
A、樣品前處理
將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為600 W，控制溫度為在10 min內(nèi)從常溫升至150 °C，然后保溫20 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測；
B、HPLC分析準(zhǔn)備
色譜柱:Syncronis Cis 色譜柱，250 X 4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm;流動相:等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)；
C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016]實施例2
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟:
A、樣品前處理
將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為1000 W，控制溫度為在30 min內(nèi)從常溫升至170 °C，然后保溫40 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測；
B、HPLC分析準(zhǔn)備
色譜柱:Syncronis Cis 色譜柱，250 X 4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm;流動相:等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)；
C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017]實施例3
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟:
A、樣品前處理
將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為800 W，控制溫度為在20 min內(nèi)從常溫升至160 °C，然后保溫30 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測；
B、HPLC分析準(zhǔn)備
色譜柱:Syncronis Cis 色譜柱，250 X 4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm;流動相:等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)；
C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]實施例4
一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟:
A、樣品前處理
將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為700 W，控制溫度為在15 min內(nèi)從常溫升至165 °C，然后保溫35 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測；
B、HPLC分析準(zhǔn)備
色譜柱:Syncronis Cis 色譜柱，250 X 4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm;流動相:等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)；
C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]實施例5
在實施例1-4的基礎(chǔ)上:
在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品19 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5mol/L氫氧化鈉溶液120 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在600 W功率條件下，在10 min內(nèi)從常溫升至150 °C，然后保溫20 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勾后，10000 r/min離心10 min，過
0.22 nm濾膜，待高效液相色譜檢測。
[0020]實施例6
在實施例1-4的基礎(chǔ)上:
在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品21 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液I mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5mol/L氫氧化鈉溶液150 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在1000 W功率條件下，在30 min內(nèi)從常溫升至170 °C，然后保溫40 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用
6mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勾后，10000 r/min離心10 min，過
0.22 nm濾膜，待高效液相色譜檢測。
[0021 ] 實施例7
在實施例1-4的基礎(chǔ)上:
在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品20 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.75 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5mol/L氫氧化鈉溶液135 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在800 W功率條件下，在20 min內(nèi)從常溫升至160 °C，然后保溫30 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用
6mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勾后，10000 r/min離心10 min，過
0.22 nm濾膜，待高效液相色譜檢測。
[0022]實施例8
在實施例1-4的基礎(chǔ)上:
在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品19.5 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.6 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5mol/L氫氧化鈉溶液125 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在700W功率條件下，在15 min內(nèi)從常溫升至165 °C，然后保溫35 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用6mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勾后，10000 r/min離心10 min，#0.22μπι濾膜，待高效液相色譜檢測。
[0023]實施例9
準(zhǔn)確稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(純度多99.5%)，用適量水和數(shù)滴0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解，并用水定容至50 mL。分別準(zhǔn)確吸取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用水配制成濃度分別為0.2 pg/mL,2.0 pg/mL,4.0 pg/mL,20.0 pg/mL,40.0 yg/mL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，供上機使用。按方案(2)的檢測條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對濃度X(yg/mL)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過不斷降低標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，取信噪比為3時的濃度為最低檢出限。
[0024]實施例10
準(zhǔn)確稱取6份飼料樣品，分別加入色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平下做3個平行試驗，根據(jù)步驟A進(jìn)行樣品前處理后，按步驟B中檢測條件進(jìn)行檢測，并利用步驟C中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算該方法的回收率與精密度。方法回收率在91 -98%之間，RSD < 5%。
[0025]實施例11
通過對不同類型的5種飼料進(jìn)行了色氨酸含量的檢測，根據(jù)步驟A進(jìn)行樣品前處理后，按步驟B中檢測條件進(jìn)行檢測，并利用步驟C中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中色氨酸的含量。
【主權(quán)項】
1.一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: A、樣品前處理 將飼料樣品粉碎，放入微波輔助蛋白質(zhì)水解設(shè)備中進(jìn)行微波輔助蛋白質(zhì)水解;其中控制微波功率為600-100 0W，控制溫度為在10-30 min內(nèi)從常溫升至150-170 °C，然后保溫20-40 min;保溫結(jié)束后，將水解液進(jìn)行處理，待高效液相色譜檢測； B、HPLC分析準(zhǔn)備 色譜柱:Syncronis Cis色譜柱，250 X4.6 mm,5 μπι;流速:1 mL/min;柱溫:30 °C;檢測器:DAD檢測器，檢測波長:220 nm；流動相:等度洗脫，0.0 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈=90+10CV+V)； C、色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)備色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用步驟B的條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:在步驟A中，所述的樣品前處理具體為:將飼料樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品19-21 mg于聚四氟乙烯管中，加入5 11101/1氫氧化鈉溶液0.5-1 mL，依次放置于水解槽中，微波水解罐內(nèi)加入5mol/L氫氧化鈉溶液120-150 mL，將水解槽放入微波水解罐，再將微波水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次，在600-1000 W功率條件下，在10-30 min內(nèi)從常溫升至150-170 °C，然后保溫20-40 min，保溫結(jié)束后，當(dāng)溫度冷卻至常溫，打開密封裝置，取出水解槽，將聚四氟乙烯管逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL;搖勻后，10000 r/min離心1 min，過0.22 μπι濾膜，待高效液相色譜檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:在步驟A中，所述準(zhǔn)確稱取樣品19-21 mg精確至0.01 mg。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種飼料中色氨酸的高效液相色譜檢測方法，其特征在于:在步驟C中，所述的色氨酸檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制具體為:準(zhǔn)確稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品各1.0mg，用適量水和數(shù)滴0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解，并用水定容至50 mL;分別準(zhǔn)確吸取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，用水配制成濃度分別為0.2 yg/mL，2.0 yg/mL，4.0 pg/mL,20.0 pg/mL，40.0 yg/mL的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，供上機使用;采用步驟B的條件進(jìn)行測定，以峰面積Y對濃度X進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過不斷降低標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，取信噪比為3時的濃度為最低檢出限，最低檢出限為0.02 pg/mLo
【文檔編號】G01N30/02GK106053676SQ201610627497
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月3日
【發(fā)明人】趙艷, 楊發(fā)樹, 宋軍, 張艷紅, 張鳳枰, 劉耀敏
【申請人】四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司