一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其包括，采用硅膠柱層析對甘油三酯進行分離；利用脂肪酶Lipozyme RM IM結(jié)合微波輔助酯交換所述甘油三酯得到酯交換產(chǎn)物；所述酯交換產(chǎn)物直接進高溫氣相色譜，測定甘油三酯中sn?1,3位脂肪酸的組成及含量。本發(fā)明無需衍生化，直接檢測，時間大大縮短，操作步驟也十分簡易。
【專利說明】
一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及酶法酯交換產(chǎn)物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其指一種利用氣相色譜檢測魚油甘 油三酯中sn-1，3位脂肪酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Q-3PUFA( Q-3多不飽和脂肪酸）是第一個雙鍵位于脂肪酸碳鏈甲基端的第三個 碳原子上的一系列多不飽和脂肪酸，因其特殊的分子結(jié)構(gòu)使得它們在人體中發(fā)揮著許多特 殊的生理功能。其中，DHA是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在人體大腦皮層中含量高達 20%，在視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占60%以上，具有維持大腦和眼睛正常生理功能的作 用，促進胎嬰幼兒大腦和視力發(fā)育，預(yù)防老年癡呆;EPA具有抑制血栓，預(yù)防心肌梗塞和腦梗 塞，治療動脈粥樣硬化和輔助降血壓的功效；另外，EPA和DHA還具有抗癌、消炎及免疫調(diào)節(jié) 等作用。
[0003] 魚類是Q-3多不飽和脂肪酸的主要食物來源。魚油由95%以上的甘三酯組成，它 是中性脂的主要組分，如下結(jié)構(gòu)簡式所示，其由一分子的甘油和三分子的脂肪酸分別酯化 在甘油骨架的三個位置上生成的，?；晌挥趕n-2和sn-1，3:
[0005] 脂肪酸在甘三酯中的位置分布是評價其營養(yǎng)價值的重要指標，決定著甘三酯的消 化、吸收、代謝及其應(yīng)用價值。一方面，sn-2位的脂肪酸更利于人體的消化和吸收。 Christensen等人采用灌胃SD大鼠，考察sn-2-EPA+DHA和sn-1,3-EPA+DHA兩種M-n3-M結(jié)構(gòu) 脂的消化吸收，實驗發(fā)現(xiàn):攝取sn-2-EPA+DHA甘三酯比sn-1，3-EPA+DHA甘三酯，在淋巴轉(zhuǎn)運 過程中有更高的DHA積累量，說明位于sn-2位的EPA和DHA更容易被吸收利用，具有更高的營 養(yǎng)和功效價值。另一方面，sn-2位脂肪酸的氧化穩(wěn)定性更高。Wijesundera等人采用加速氧 化法和頂空微萃取的方法，分析pro和rop，00D和0D0兩組DHA分別位于sn-2位和sn-lor 3位 的結(jié)構(gòu)甘三酯的丙醛，反式二烯醛等二級氧化指標及過氧化值(PV)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):PPD和00D比 PDP和0D0更快產(chǎn)生以上二級氧化產(chǎn)物，過氧化值更高，說明位于sn-lor 3的DHA比sn-2位的 DHA更易被氧化。
[0006] 目前，常用的測定甘三酯中脂肪酸位置分布的方法有胰脂酶水解法和烯丙基溴化 鎂降解法。胰脂酶水解法是根據(jù)胰脂酶的sn-1，3特異性，通過水解甘三酯sn-1，3位上的脂 肪酸，對sn-2-單甘酯進行測定，分析脂肪酸的位置分布的一種常用的酶解方法。然而，研究 表明胰脂酶無法有效地水解長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，例如:EPA和DHA，因此，這種方 法對富含EPA和DHA的魚油存在局限性。另一種方法是烯丙基溴化鎂降解法，依據(jù)格氏降解 反應(yīng)將甘三酯sn-lor 3位酯化脂肪酸降解，對生成的sn-1，2or sn-2,3甘二酯進行測定，從 而計算出脂肪酸位置分布的一種化學(xué)方法。此方法可以避免胰脂酶對脂肪酸的選擇性水 解，但是，烯丙基溴化鎂遇水極易失活，且具有毒性。另外，?；D(zhuǎn)移也是影響結(jié)果準確性的 重要因素。因此，尋找一種適合測定富含LC-PUFA甘三酯的脂肪酸位置分布的綠色、高效、準 確的方法成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本部分的目的在于概述本發(fā)明的實施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實施 方式。在本部分以及本申請的說明書摘要和發(fā)明名稱中可能會做些簡化或者省略以避免本 部分、說明書摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。
[0008] 鑒于現(xiàn)有魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法、制備方法和應(yīng)用中存在的問 題，提出了本發(fā)明。
[0009] 因此，本發(fā)明的目的是提供一種綠色、高效、準確的測定魚油甘油三酯脂肪酸位置 分布的方法。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:一種魚油甘油三酯脂肪酸 位置分布的測定方法，其包括，采用硅膠柱層析對甘油三酯進行分離;利用脂肪酶Lipozyme RM IM結(jié)合微波輔助酯交換所述甘油三酯得到酯交換產(chǎn)物;所述酯交換產(chǎn)物直接進高溫氣 相色譜，測定甘油三酯中sn-1，3位脂肪酸的組成及含量。
[0011] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述分離，按體積計柱層析洗脫液為石油醚：乙醚=80~90:10~15,吸取油樣，沿層析 柱壁加入，然后用3~25倍于所述油樣的洗脫液進行洗脫，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯， 氮吹除去有機溶劑。
[0012] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述石油醚的沸程30~60°C。
[0013] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述利用脂肪酶Lipozyme RM IM結(jié)合微波輔助酯交換所述甘油三酯得到酯交換產(chǎn)物 中，將所述甘油三酯溶于乙酸乙酯中，然后加入脂肪酶Lipozyme RM頂，微波功率450W，保 持反應(yīng)20~40min，再加入乙釀，4000~5000r/min離心2~5min分離。
[0014] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述甘油三酯與所述米黑根毛霉源固定化脂肪酶的質(zhì)量比為1:50~150。
[0015] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述脂肪酶Lipozyme RM IM為利用米黑根毛霉發(fā)酵產(chǎn)的sn-1,3特異性固定化脂肪酶。
[0016] 作為本發(fā)明所述一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法的優(yōu)選方案，其 中：所述高溫氣相色譜的測定條件為：初始溫度為80°C~100°C，保持lmin~3min，以5~15 °C/min升至320°C~380°C，保持lOmin~20min;載氣為純度>99.99%的氮氣，載氣流速為 0.8~1.4mL/min;分流比為50~100:1;氣化室溫度為320°C~380°C;FID檢測器溫度為320 ~38(TC〇
[0017]本發(fā)明的有益效果在于：
[0018]本發(fā)明先采用硅膠柱色譜對甘三酯進行分離，再進行酶法酯交換反應(yīng)和產(chǎn)物分析 檢測，排除雜質(zhì)干擾，提高了檢測的靈敏度，可以實現(xiàn)對甘三酯中sn-1，3位脂肪酸含量的高 效檢測；
[0019] 本方法采用酶法酯交換結(jié)合微波輔助，可以大大提高反應(yīng)效率，而且避免?；D(zhuǎn) 移造成的結(jié)果不準確性;傳統(tǒng)的薄層層析檢測法需要耗費數(shù)個小時，后期還需要分離、提取 等步驟，操作也十分繁瑣;本發(fā)明無需衍生化，直接檢測，時間大大縮短，操作步驟也十分簡 易。
【附圖說明】
[0020] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用 的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖。其中：
[0021] 圖1為采用本發(fā)明測定方法得到的脂肪酸乙酯標品氣相圖譜圖。
【具體實施方式】
[0022] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面通過本發(fā)明的具體 實施方式做詳細的說明。
[0023] 在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以 采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的 情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
[0024] 實施例1
[0025]步驟1鳳尾魚油中甘油三酯的分離提取
[0026]采用硅膠柱層析的方法分離獲取甘油三酯。柱層析洗脫液為石油醚：乙醚（80~ 90:10~15，V/V)。稱取油脂樣品約1~5g，轉(zhuǎn)移至10~50ml容量瓶中，用洗脫液定容。取層析 柱(尺寸規(guī)格1~3cmX 30~50cm)，在底部放少許玻璃棉或海砂，將洗脫液和硅膠攪拌均勻 混合，加入裝柱。吸取油樣20~30ml，沿層析柱壁緩緩加入，然后用100~500ml洗脫液進行 洗脫，速度約為1~3ml/min，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除去有機溶劑。
[0027] 步驟2脂肪酶Lipozyme RM IM微波輔助酯交換
[0028]稱取分離所得甘油三酯0.2g于10mL具塞試管中，加入2mL乙酸乙酯震蕩混合均勻， 再加入Lipozyme RM頂脂肪酶10mg，蓋上塞子小心搖動，微波功率450W，保持反應(yīng)25min，取 出，加入lmL乙醚，5000r/min離心2min分離，吸取乙醚層，用0.45M1濾膜過濾到樣品瓶中； [0029] 步驟3GC法測定sn-1，3位脂肪酸組成及含量
[0030]采用氣相色譜分析sn-1，3位脂肪酸組成，分析條件為:安捷倫GC-7820A氣相色譜 儀，色譜柱DB-3ht (0 ? 32mm X 0 ? 1M X 50m; Agi lent)毛細管柱，采用程序升溫，初始溫度80 。(：，保持2min，以10°C/min升至360°C，保持lOmin;載氣為高純氮氣（彡99.99% );載氣流速 為2. OmL/min;分流比100~50:1;氣化室溫度360°C ;FID檢測器溫度為360°C ;進樣體積1.0y L。通過保留時間來鑒定脂肪酸種類，相對含量表示為mol%。
[0031] 實施例2
[0032]步驟1金槍魚油中甘油三酯的分離提取
[0033]采用硅膠柱層析的方法分離獲取甘油三酯。柱層析洗脫液為石油醚：乙醚（80~ 90:10~15，V/V)。稱取油脂樣品約1~5g，轉(zhuǎn)移至10~50ml容量瓶中，用洗脫液定容。取層析 柱(尺寸規(guī)格1~3cmX 30~50cm)，在底部放少許玻璃棉或海砂，將洗脫液和硅膠攪拌均勻 混合，加入裝柱。吸取油樣20~30ml，沿層析柱壁緩緩加入，然后用100~500ml洗脫液進行 洗脫，速度約為1~3ml/min，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除去有機溶劑。
[0034] 步驟2脂肪酶Lipozyme RM IM微波輔助酯交換
[0035]稱取分離所得甘油三酯0.2g于10mL具塞試管中，加入2mL乙酸乙酯震蕩混合均勻， 再加入Lipozyme RM頂脂肪酶20mg，蓋上塞子小心搖動，微波功率600W，保持反應(yīng)30min，取 出，加入2mL乙醚，5000r/min離心2min分離，吸取乙醚層，用0.45M1濾膜過濾到樣品瓶中； [0036] 步驟3GC法測定sn-1，3位脂肪酸組成及含量
[0037]采用氣相色譜分析sn-1，3位脂肪酸組成，分析條件為:安捷倫GC-7820A氣相色譜 儀，色譜柱DB-3ht (0 ? 32mm X 0 ? 1M X 50m; Agi lent)毛細管柱，采用程序升溫，初始溫度80 。(：，保持2min，以10°C/min升至360°C，保持lOmin;載氣為高純氮氣（彡99.99% );載氣流速 為2. OmL/min;分流比100~50:1;氣化室溫度360°C ;FID檢測器溫度為360°C ;進樣體積1.0y L。通過保留時間來鑒定脂肪酸種類，相對含量表示為mol%。
[0038] 實施例3
[0039]步驟1三文魚油中甘油三酯的分離提取
[0040]采用硅膠柱層析的方法分離獲取甘油三酯。柱層析洗脫液為石油醚：乙醚(80~ 90:10~15，V/V)。稱取油脂樣品約1~5g，轉(zhuǎn)移至10~50ml容量瓶中，用洗脫液定容。取層析 柱(尺寸規(guī)格1~3cmX 30~50cm)，在底部放少許玻璃棉或海砂，將洗脫液和硅膠攪拌均勻 混合，加入裝柱。吸取油樣20~30ml，沿層析柱壁緩緩加入，然后用100~500ml洗脫液進行 洗脫，速度約為1~3ml/min，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除去有機溶劑。
[00411 步驟2脂肪酶Lipozyme RM IM微波輔助酯交換
[0042]稱取分離所得甘油三酯0.2g于10mL具塞試管中，加入2mL乙酸乙酯震蕩混合均勻， 再加入Lipozyme RM IM脂肪酶5mg，蓋上塞子小心搖動，微波功率450W，保持反應(yīng)20min，取 出，加入2mL乙醚，5000r/min離心2min分離，吸取乙醚層，用0.45M1濾膜過濾到樣品瓶中； [0043] 步驟3GC法測定sn-1，3位脂肪酸組成及含量
[0044] 采用氣相色譜分析sn-1，3位脂肪酸組成，分析條件為:安捷倫GC-7820A氣相色譜 儀，色譜柱DB-3ht (0 ? 32mm X 0 ? 1M X 50m; Agi lent)毛細管柱，采用程序升溫，初始溫度80 。(：，保持2min，以10°C/min升至360°C，保持10min;載氣為高純氮氣（彡99.99% );載氣流速 為2. OmL/min;分流比100~50:1;氣化室溫度360°C ;FID檢測器溫度為360°C ;進樣體積1.0y L。通過保留時間來鑒定脂肪酸種類，相對含量表示為mol%。
[0045] 實施例4
[0046] 步驟1沙丁魚油中甘油三酯的分離提取
[0047]采用硅膠柱層析的方法分離獲取甘油三酯。柱層析洗脫液為石油醚：乙醚（80~ 90:10~15，V/V)。稱取油脂樣品約1~5g，轉(zhuǎn)移至10~50ml容量瓶中，用洗脫液定容。取層析 柱(尺寸規(guī)格1~3cmX 30~50cm)，在底部放少許玻璃棉或海砂，將洗脫液和硅膠攪拌均勻 混合，加入裝柱。吸取油樣20~30ml，沿層析柱壁緩緩加入，然后用100~500ml洗脫液進行 洗脫，速度約為1~3ml/min，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除去有機溶劑。
[0048] 步驟2脂肪酶Lipozyme RM IM微波輔助酯交換
[0049] 稱取分離所得甘油三酯0.2g于lOmL具塞試管中，加入2mL乙酸乙酯震蕩混合均勻， 再加入Lipozyme RM頂脂肪酶10mg，蓋上塞子小心搖動，微波功率500W，保持反應(yīng)30min，取 出，加入2mL乙醚，5000r/min離心2min分離，吸取乙醚層，用0.45M1濾膜過濾到樣品瓶中；
[0050] 步驟3GC法測定sn-1，3位脂肪酸組成及含量
[00511采用氣相色譜分析sn-1，3位脂肪酸組成，分析條件為:安捷倫GC-7820A氣相色譜 儀，色譜柱DB-3ht (0 ? 32mm X 0 ? 1M X 50m; Agi lent)毛細管柱，采用程序升溫，初始溫度80 。(：，保持2min，以10°C/min升至360°C，保持lOmin;載氣為高純氮氣（彡99.99% );載氣流速 為2. OmL/min;分流比100~50:1;氣化室溫度360°C ;FID檢測器溫度為360°C ;進樣體積1.0y L。通過保留時間來鑒定脂肪酸種類，相對含量表示為mol%。
[0052] 實施例5
[0053]步驟1鱈魚肝油中甘油三酯的分離提取
[0054]采用硅膠柱層析的方法分離獲取甘油三酯。柱層析洗脫液為石油醚：乙醚（80~ 90:10~15，V/V)。稱取油脂樣品約1~5g，轉(zhuǎn)移至10~50ml容量瓶中，用洗脫液定容。取層析 柱(尺寸規(guī)格1~3cmX 30~50cm)，在底部放少許玻璃棉或海砂，將洗脫液和硅膠攪拌均勻 混合，加入裝柱。吸取油樣20~30ml，沿層析柱壁緩緩加入，然后用100~500ml洗脫液進行 洗脫，速度約為1~3ml/min，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除去有機溶劑。
[0055] 步驟2脂肪酶Lipozyme RM IM微波輔助酯交換
[0056]稱取分離所得甘油三酯0.2g于10mL具塞試管中，加入2mL乙酸乙酯震蕩混合均勻， 再加入Lipozyme RM頂脂肪酶15mg，蓋上塞子小心搖動，微波功率550W，保持反應(yīng)20min，取 出，加入2mL乙醚，5000r/min離心2min分離，吸取乙醚層，用0.45M1濾膜過濾到樣品瓶中； [0057] 步驟3GC法測定sn-1，3位脂肪酸組成及含量
[0058]采用氣相色譜分析sn-1，3位脂肪酸組成，分析條件為：安捷倫GC-7820A氣相色譜 儀，色譜柱DB-3ht (0 ? 32mm X 0 ? 1M X 50m; Agi lent)毛細管柱，采用程序升溫，初始溫度80 。(：，保持2min，以10°C/min升至360°C，保持10min;載氣為高純氮氣（彡99.99% );載氣流速 為2. OmL/min;分流比100~50:1;氣化室溫度360°C ;FID檢測器溫度為360°C ;進樣體積1.0y L。通過保留時間來鑒定脂肪酸種類，相對含量表示為mol%。
[0059]本檢測方法穩(wěn)定性高，利用其檢測魚油中甘油三酯的sn-1，3位脂肪酸含量，從而 計算sn-2位脂肪酸含量，重現(xiàn)性達到RSD彡5%，下表是同一樣品sn-2位EPA和DHA占總脂肪 酸的百分比10次檢測結(jié)果及RSD:

[0062] 對比實例:不同微波輔助Lipozyme RM IM催化酯交換反應(yīng)對比
[0063]
[0064] 由此可見，酶法sn_l，3特異性酯交換中酶專一性強，有效作用于LC-PUFA，可以避 免?；D(zhuǎn)移。同時結(jié)合微波輔助極大地提高酯交換反應(yīng)效率。微波照射到油脂分子，極性酰 基有較強的微波吸收能力，以極高的頻率振蕩，引起分子的電磁振蕩等作用，增加分子的運 動，提高分子活化能。洗脫液選擇特定沸程的石油醚，洗脫效果更好，而且酯交換反應(yīng)正是 發(fā)生在酯基位置，因此微波具有類似定向聚能作用，能夠極大地加速酯交換反應(yīng)。
[0065] 上述說明已經(jīng)充分揭露了本發(fā)明的【具體實施方式】。需要指出的是，熟悉該領(lǐng)域的 技術(shù)人員對本發(fā)明的【具體實施方式】所做的任何改動均不脫離本發(fā)明的權(quán)利要求書的范圍。 相應(yīng)地，本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍也并不僅僅局限于前述【具體實施方式】。
【主權(quán)項】
1. 一種魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在于:包括， 采用硅膠柱層析對甘油三酯進行分離； 利用脂肪酶Lipozyme RM頂結(jié)合微波輔助酯交換所述甘油三酯得到酯交換產(chǎn)物； 所述酯交換產(chǎn)物直接進高溫氣相色譜，測定甘油三酯中sn-l，3位脂肪酸的組成及含 量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在于:所述 分離，按體積計柱層析洗脫液為石油醚：乙醚=80~90:10~15,吸取油樣，沿層析柱壁加 入，然后用3~25倍于所述油樣的洗脫液進行洗脫，洗脫完畢，收集物即為甘油三酯，氮吹除 去有機溶劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在于:所述 石油醚的沸程30~60 °C。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在 于:所述利用脂肪酶Lipozyme RM IM結(jié)合微波輔助酯交換所述甘油三酯得到酯交換產(chǎn)物 中，將所述甘油三酯溶于乙酸乙酯中，然后加入脂肪酶Lipozyme RM頂，微波功率450W，保 持反應(yīng)20~40min，再加入乙釀，4000~5000r/min離心2~5min分離。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在于:所述 甘油三酯與所述米黑根毛霉源固定化脂肪酶的質(zhì)量比為1:50~150。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在于:所述 脂肪酶Lipozyme RM IM為利用米黑根毛霉發(fā)酵產(chǎn)的sn-1,3特異性固定化脂肪酶。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一所述的魚油甘油三酯脂肪酸位置分布的測定方法，其特征在 于:所述高溫氣相色譜的測定條件為：初始溫度為80°C~100°C，保持lmin~3min，以5~15 °C/min升至320°C~380°C，保持lOmin~20min;載氣為純度>99.99%的氮氣，載氣流速為 0.8~1.4mL/min;分流比為50~100:1;氣化室溫度為320°C~380°C;FID檢測器溫度為320 ~38(TC〇
【文檔編號】G01N30/02GK106053677SQ201610663840
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月12日 公開號201610663840.5, CN 106053677 A, CN 106053677A, CN 201610663840, CN-A-106053677, CN106053677 A, CN106053677A, CN201610663840, CN201610663840.5
【發(fā)明人】王興國, 張惠君, 金青哲, 黃健花, 劉睿杰, 常明
【申請人】江南大學(xué)