-單磷酸類脂a的制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種低毒含五條脂肪酸鏈的Kd〇2-單磷酸類脂A的制備與應(yīng)用，屬于 生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂多糖（LPS)，即細(xì)菌內(nèi)毒素，是構(gòu)成大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌外膜外層的主要成 分，主要由Kdo2-類脂A(Kdo2-LipidA)，核心多糖（Core)和0-抗原（O-antigen)三部分組 成；其中Kd〇2-類脂A是LPS的疏水端，其結(jié)構(gòu)非常保守，連接著親水的核心多糖和0-抗原 并協(xié)助二者粘附于細(xì)胞表面構(gòu)成完整細(xì)胞壁，核心多糖和0-抗原部分具有異構(gòu)性，不同的 革蘭氏陰性菌株甚至同一菌株內(nèi)糖基種類、個(gè)數(shù)、位置都有多種組合形式。革蘭氏陰性菌侵 入宿主后會(huì)釋放其表層的LPS，LPS可以被宿主免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TollLike Rec印tor4,TLR-4)識(shí)別，繼而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)，產(chǎn)生TNF-a、IL-6、 IL-8等多種炎性細(xì)胞因子。其中，Kd〇2-類脂A是與TLR-4受體結(jié)合的主要部分，尤其是類 脂A部分的精細(xì)結(jié)構(gòu)決定了LPS刺激細(xì)胞后釋放的細(xì)胞因子種類和數(shù)量。
[0003] 野生型大腸桿菌和沙門氏菌的LPS中，類脂A部分包含六條或七條脂肪酸鏈，并在C1位和C4'位有兩個(gè)磷酸基團(tuán)，具有較高的細(xì)胞毒性。某些特殊結(jié)構(gòu)、低毒性的類脂A可 作為疫苗佐劑，非特異性地增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高疫苗效率。但是，由于類 脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展現(xiàn)有效的生物活性，所以近幾十年至今，基礎(chǔ)科研 或者臨床上還是使用LPS粗樣來對(duì)相應(yīng)的類脂A衍生物生物活性進(jìn)行研宄。然而，LPS由 于分子量大、核心糖及〇抗原部分結(jié)構(gòu)多樣化，無法通過質(zhì)譜或核磁共振的方法進(jìn)行實(shí)時(shí) 檢測(cè)和快速鑒定，也暫無標(biāo)準(zhǔn)化的提取純化方法。且實(shí)際類脂A疫苗佐劑生產(chǎn)中，現(xiàn)用到的 沙門氏菌是致病菌，具有一定的安全隱患，且沙門氏菌同時(shí)生產(chǎn)多種不同結(jié)構(gòu)的類脂A，提 取過程繁瑣、能耗高。
[0004] 大腸桿菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含0-抗原，只有Kd〇2-類脂A與核心 多糖，且其Kd〇2-類脂A部分結(jié)構(gòu)單一，是優(yōu)于沙門氏菌的工業(yè)生產(chǎn)出發(fā)菌株。本發(fā)明改造 大腸桿菌，合成了一種具有特殊結(jié)構(gòu)、低毒的Kd〇2-類脂A，這種Kd〇2-類脂A不連接核心多 糖長(zhǎng)鏈、僅由兩個(gè)2-酮-3-脫氧辛酸、五條脂肪酸鏈和C4'位單個(gè)磷酸構(gòu)成。這種特別的 Kd〇2-類脂A具有雙親性質(zhì)，便于分離提取和純化，能夠被實(shí)施檢測(cè)和直接鑒定，且保持了類 脂A部分的生物活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是優(yōu)于類脂A和LPS分 子的、極具發(fā)展?jié)摿Φ囊呙缱魟?。同時(shí)，本發(fā)明提供一種提取和純化Kd〇2-類脂A的標(biāo)準(zhǔn)化 方法，步驟簡(jiǎn)單明了，易于操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種具有特殊結(jié)構(gòu)、低毒的、五脂肪酸鏈Kd〇2-單磷酸類脂A，其化學(xué)式為C96H175N2035P，分子質(zhì)量為1947. 17,其結(jié)構(gòu)包含2個(gè)a-酮 基-3-脫氧-D-甘露辛酸（Kdo)、2個(gè)氨基葡萄糖、1個(gè)磷酸基團(tuán)和5條脂肪酸鏈，是以 0_(1' -6)連接的D-葡萄糖胺二糖為骨架，6'位連接二a-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸 (Kd〇2)，4'位被磷酸化，2'位氨基連接（R)-3-(十二烷氧基）十四烷基，3'位、3位和2位氨 基分別連接十四烷氧基而構(gòu)成，具體結(jié)構(gòu)式如式I所示。該化合物具雙親性，能夠被有機(jī)體 系直接提取同時(shí)可被ESI質(zhì)譜直接檢測(cè)鑒定；在水相體系有較好溶解度，能特異性地通過 TLR4/MD2受體激活先天性免疫系統(tǒng)，但同時(shí)展現(xiàn)出低細(xì)胞毒性，具有作為免疫佐劑的潛力。 [0006]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種低毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A，其特征在于，化學(xué)式為 C96H175N2O35P,其結(jié)構(gòu)包含2個(gè)a-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸、2個(gè)氨基葡萄糖、1個(gè)磷酸基 團(tuán)和5條脂肪酸鏈，是以0-(1' -6)連接的D-葡萄糖胺二糖為骨架，6'位連接二a-酮 基_3_脫氧-D-甘露辛酸，4'位被磷酸化，2'位氨基連接（R) _3_(十二烷氧基）十四烷基， 3'位、3位和2位氨基分別連接十四烷氧基而構(gòu)成。
2. -種產(chǎn)低毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A的大腸桿菌基因工程菌， 其特征在于，所述基因工程菌的基因型為E.coliW3110AwaaCFAIacIAlpxMlacZ::Fnlp xE〇
3. -種構(gòu)建權(quán)利要求2所述的大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 將人工構(gòu)建的IacI敲除片段轉(zhuǎn)化入E.coliW3110/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，獲得突變 株E.coliW31101acl: :Pkan，通過Cre酶介導(dǎo)的IoxP位點(diǎn)特異性重組去除卡那霉素抗性基 因； 2. FnlpxE片段電轉(zhuǎn)入步驟1)制備的E.coliW3110AlacI/pKD46感受態(tài)細(xì)胞中，獲得 重組菌，其基因型為E.coliW3110AIacIlacZ: :FnlpxE-Fkan，通過FLP酶介導(dǎo)的FRT位點(diǎn) 的特異性重組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，構(gòu)建成中間菌株HWOOl; 3)在HWOOl突變株的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入人工構(gòu)建的IpxM敲除片段轉(zhuǎn)化入HW001/pKD46感受 態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌E. coli W3110 A IacIlacZ: :FnlpxE IpxM: :Pkan，再次通過Cre酶介 導(dǎo)的IoxP位點(diǎn)的特異性重組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，構(gòu)建成中間菌株HW002 ; 4) 在HW002突變株的基礎(chǔ)上將人工構(gòu)建的waaCF敲除片段轉(zhuǎn)化入HW002/pKD46感受態(tài) 細(xì)胞中，獲得重組菌E.coliHW002waaCF:Pkan，再次通過FLP酶介導(dǎo)的FRT位點(diǎn)的特異性重 組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，最終基因型為E.CoIiW3110AwaaCFAIpxMAIacI1 acZ: :FnlpxE，構(gòu)建成基因工程菌株BW002。
4. 一種應(yīng)用權(quán)利要求2所述大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)低毒的、含有五條脂肪酸鏈的 Kdo2-單磷酸類脂A的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)菌體，（2)收 集菌體，氯仿/甲醇/水混合相體系提取分離單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒Kdo2-類脂，（3) DEAE纖維柱純化單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒Kdo2-單磷酸類脂A。
5. 權(quán)利要求1所述單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2_單磷酸 類脂A的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2_單磷酸 類脂A在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求2所述大腸桿菌基因工程菌在在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種低毒含五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A的制備與應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明改造大腸桿菌，合成了一種具有特殊結(jié)構(gòu)、低毒的、五鏈Kdo2-單磷酸類脂A，這種Kdo2-類脂A分子不連有核心多糖長(zhǎng)鏈、僅由兩個(gè)2-酮-3-脫氧辛酸、五條脂肪酸鏈和C4’位單個(gè)磷酸構(gòu)成。該Kdo2-類脂A具有雙親性質(zhì)，便于分離提取和純化，能夠被實(shí)施檢測(cè)和直接鑒定，且保持了類脂A部分的生物免疫活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是極具發(fā)展?jié)摿Φ囊呙缱魟?。同時(shí)，本發(fā)明提供的提取和純化該Kdo2-類脂A的方法，步驟簡(jiǎn)單明了，易于操作。
【IPC分類】C12R1-19, C07H1-06, A61K39-39, C07H13-04, C12P19-26, C12N1-21
【公開號(hào)】CN104844665
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510282822
【發(fā)明人】王小元, 王碧雯, 韓亞寧, 李燁, 李顏顏
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月28日