本發(fā)明屬于涉及光電材料制備領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種用于pH檢測的共軛聚合物熒光傳感探針的制備方法。

背景技術(shù)：

共軛聚合物是一類具有特殊光、電性質(zhì)的高分子化合物，近年來受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。共軛聚合物是指在空聞結(jié)構(gòu)上有長程π鍵共軛探針的聚合物，在聚合物共軛探針中，長程π電子共軛不僅大大縮小了成鍵和反鍵能帶間的能隙(一般為1.5～3eV)，而且使兩個能帶增寬，能帶內(nèi)的軌道數(shù)增加，軌道間能隙減小，載流子(電子和空穴)在能帶內(nèi)可以自由移動，因此，共軛聚合物的共軛骨架允許電子或能量在整條鏈上自由流動，從而具有“分子導(dǎo)線”功能。即受激發(fā)產(chǎn)生的激子可以沿共軛主鏈迅速遷移。

共軛聚合物納米顆粒(CPNs)作為熒光探針展現(xiàn)出優(yōu)異的特性。但是表面沒有官能團的CPNs在化學(xué)/生物檢測的應(yīng)用中受到很大的限制，所以為了使CPNs在生物檢測及成像領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用首先要解決的問題是使CPNs表面帶有官能團來偶聯(lián)其它分子或基團。兩親聚合物共沉淀法是一種簡單有效功能化聚合物納米顆粒的方法。這種方法能夠制備出顆粒小、亮度高的熒光探針，在識別標(biāo)記目標(biāo)細胞或分子時效果尤其顯著。此種功能化共軛聚合物熒光材料，具有結(jié)構(gòu)多樣性、良好的生物相容性、熒光強度高、發(fā)光時間長和光化學(xué)穩(wěn)定性好等特性。

常見的用于pH檢測的方法包括電化學(xué)、核磁共振、吸收光譜法和熒光探針方法，測定pH值的傳統(tǒng)手段是應(yīng)用pH試紙和含玻璃電極的pH計。pH試紙不夠精確且不能對生物體的內(nèi)部進行測量，而玻璃電極的計有比較明顯的缺點：電化學(xué)干擾以及機械損傷，也不適于生物體內(nèi)監(jiān)測。相對于微電極，核磁共振以及吸收光譜法，熒光光譜法在對細胞內(nèi)時空分布上的檢測更具有優(yōu)勢。其中，熒光探針法因其高選擇性和靈敏度以及對細胞無損傷等優(yōu)點得到了廣泛的研究及應(yīng)用。因此，發(fā)展高選擇性和靈敏度以及可逆性的熒光探針是非常重要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

傳統(tǒng)探針操作復(fù)雜、所需設(shè)備復(fù)雜、熒光強度低、低靈敏度的問題，本發(fā)明提供了一種用于pH檢測的共軛聚合物熒光傳感探針的制備方法，它可以克服傳統(tǒng)熒光生物傳感器中熒光強度低、操作復(fù)雜、靈敏度低的問題。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。

用于pH檢測的共軛聚合物熒光傳感探針的制備方法，其特征在于，其步驟如下：

S1合成制備聚芴乙烯撐類共軛聚合物PFV；

S2共軛聚合物材料PFV與聚(苯乙烯-co-順丁烯二酸酐)(PSMA)共沉淀制備成納米粒子；

S3共軛聚合物納米粒子與多巴胺反應(yīng)，超濾離心后制備成探針；

S4將探針置于不同pH的緩沖溶液中，以435nm為激發(fā)波長，進行熒光檢測，根據(jù)熒光強度對pH進行檢測。

更進一步的，所述步驟S1中共軛聚合物PFV是利用Witting反應(yīng)合成得到，分子量為20139g/mol。

更進一步的，所述步驟S1中共軛聚合物PFV吸收波長為435nm，發(fā)射波長為480nm。

更進一步的，所述步驟S1中共軛聚合物PFV的結(jié)構(gòu)式為：

更進一步的，所述步驟S2中共沉淀法是取1mL 0.1mg/mL的PFV/THF和200uL 0.1mg/mL的PSMA/THF混合，加THF至6mL，分三次每次取2mL在超聲狀態(tài)下快速加入到10mL超純水中，超聲5min，三次合并一起旋蒸濃縮至5mL，0.22μm水系過濾頭過濾，得到PFV/PSMA共軛聚合物納米顆粒，避光4℃保存。

更進一步的，所述步驟S3中共軛聚合物納米粒子與多巴胺反應(yīng)的催化劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)。

更進一步的，所述步驟S3中所用反應(yīng)液為0.04mol/L，pH＝5.0的BR緩沖液，反應(yīng)條件為常溫避光。

更進一步的，所述步驟S3中超濾離心條件為80s，4500rpm，超濾離心三次后定容至250μL。

更進一步的，所述步驟S4中熒光檢測是用熒光分光光度計進行檢測，激發(fā)波長在共軛聚合物最大紫外-可見吸收峰435nm處，發(fā)射波長掃描范圍為440～650nm。

更進一步的，所述步驟S4中熒光檢測方法是將共軛聚合物傳感探針加入到不同pH的BR緩沖溶液中進行熒光發(fā)射光譜的掃描。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明選用可激發(fā)熒光的共軛聚合物作為敏感材料，以多巴胺作為分子識別元件，以熒光檢測為主要分析手段，通過多巴胺與共軛聚合物納米粒子之間的電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移，能夠有效快速的對pH值實現(xiàn)檢測；

(2)本發(fā)明利用PSMA與共軛聚合物共沉淀法制備得納米粒子，由于納米粒子中的PSMA具有雙親性，使其具有很好的生物相容性，可用于細胞內(nèi)檢測；

(3)本發(fā)明利用了共軛聚合物的分子導(dǎo)線、熒光特征及多巴胺對pH值的循環(huán)響應(yīng)的能力，可以克服傳統(tǒng)檢測方法中操作復(fù)雜、成本高的缺點；

(4)本發(fā)明選用的共軛聚合物具有雙光子吸收作用，相對于傳統(tǒng)的單光子吸收有重大優(yōu)勢，對樣品傷害較小，雙光子的輻射光源一般在可見-近紅外區(qū)，在介質(zhì)中的穿透性好，在雙光子熒光顯微技術(shù)、雙光子上轉(zhuǎn)換激光、光限幅、雙光子三維微加工、雙光子三維光學(xué)存儲、雙光子光動力學(xué)治療等方面展示出良好的應(yīng)用前景；

(5)本發(fā)明制備方法簡單，不需要復(fù)雜的設(shè)備，可廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物傳感器等領(lǐng)域，實現(xiàn)對生物分子，小分子，以及金屬離子的檢測。

附圖說明

圖1是共軛聚合物PFV的結(jié)構(gòu)式；

圖2是多巴胺的結(jié)構(gòu)式；

圖3是利用多巴胺對共軛聚合物猝滅作用pH檢測的工作原理圖；

圖4是基于共軛聚合物的熒光檢測方法對不同pH進行檢測的熒光光譜圖；

圖5是熒光強度與pH之間的線性關(guān)系；

圖6是不同多巴胺濃度對熒光的影響；

圖7是探針對pH響應(yīng)的循環(huán)測試圖，BR緩沖溶液分別在pH＝5.0和pH＝9.0之間循環(huán)調(diào)節(jié)。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體的實施例，對本發(fā)明作詳細描述。

實施例1

結(jié)合圖1、2和3，具體介紹共軛聚合物熒光傳感探針的制備及其對pH的檢測原理。

以共軛聚合物熒光納米粒子作為敏感材料，修飾小分子作為識別基團，通過小分子與共軛聚合物納米粒子之間的電子轉(zhuǎn)移和能量轉(zhuǎn)移，從而實現(xiàn)對pH的高靈敏檢測，如圖3所示，其流程如下：

1.制備共軛聚合物材料PFV，PFV的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，用四氫呋喃溶解到濃度為0.1mg/mL，避光待用。反應(yīng)步驟如下：

單體1(9,9-二辛基-2,7-二醛基芴)的制備：100mL兩口圓底燒瓶，加入磁子，原料9,9-二辛基-2,7-二溴基芴A(1.3g，2.37mmol)，加上橡膠塞，貼封口膜，抽真空插氣球鼓氮氣重復(fù)3～4次，注射打入20mL THF使原料溶解。另外在反應(yīng)鍋中加入丙酮，慢慢加入干冰，一直到不沸騰為止。把反應(yīng)瓶放入鍋中，攪拌。注射器逐滴加入2.5mL n-BuLi到反應(yīng)瓶中，反應(yīng)15min后，加入DMF(386μL，365mg)。繼續(xù)加干冰，維持-78℃2h，恢復(fù)室溫反應(yīng)過夜。處理：二氯甲烷萃取，PE：DCM＝2：1過柱子，得產(chǎn)物336mg。

單體2(1,4-二(磷酸二乙酯基)苯)的制備：100mL單口圓底燒瓶，加入磁子，原料1,4-二(溴甲基)苯B(1.5g，6.25mmol)，加入15mL亞磷酸三乙酯，120℃回流24h。處理：搭建減壓蒸餾裝置，減壓蒸餾大約3h后，得少量粘稠液體，用正己烷沉降，析出灰白色固體，烘干。

聚芴乙烯撐類聚合物PFV的制備：50mL的反應(yīng)瓶中加入M1(89.332mg，0.2mmol)，M2(75.668mg，0.2mmol)，叔丁醇鉀(89.6mg，0.8mmol)，貼封口膜，抽真空鼓氮氣重復(fù)3～4次，加入12mL蒸餾過的THF，反應(yīng)環(huán)境抽真空，然后氣球里鼓滿氮氣，插在反應(yīng)瓶的橡皮塞上，保持無水無氧的環(huán)境，常溫反應(yīng)4～6h。處理：反應(yīng)液倒入50mL稀鹽酸中淬滅，二氯甲烷萃取，旋濃，甲醇沉降，有大量黃色絮狀出現(xiàn)，過濾干燥。

反應(yīng)方程式如下：

1)

2)

3)

2.取1mL 0.1mg/mL的PFV/THF和200uL 0.1mg/mL的PSMA/THF混合，加THF至6mL，分三次每次取2mL在超聲狀態(tài)下快速加入到10mL超純水中，超聲5min，三次合并一起旋蒸濃縮至5mL，0.22μm水系過濾頭過濾，得到20μg/mL的PFV/PSMA CPNs，避光4℃保存。

3.分別加入340μL PBS，100μL PFV/PSMA CPNs，50μL多巴胺(DA)，10μL EDC常溫避光400rpm振蕩反應(yīng)過夜12～18h，多巴胺(DA)的結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

4.超濾離心(80s，4500rpm)三次除去小分子，定容至250μL，即得到熒光探針。

5.用0.04mol/L磷酸、硼酸和醋酸配置不同pH的BR緩沖溶液，使用時用0.2mol/L NaOH溶液在酸度計上調(diào)至所需pH值，pH范圍分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

6.分別向上述配置好的不同pH緩沖溶液中加入50μL探針溶液(10μg/μL)，并且混合均勻后檢測熒光光譜。

共軛聚合物熒光傳感探針的制備。

在離心管中分別加入100μL PFV/PSMA納米粒子，50μL多巴胺(DA)，10μL EDC，340μL PBS，常溫避光400rpm振蕩反應(yīng)過夜12～18h。然后超濾離心(80s，4500rpm)三次除去小分子，定容至250μL，即得熒光傳感探針。

檢測不同pH值的緩沖溶液。

用0.04mol/L磷酸、硼酸和醋酸準(zhǔn)確配置不同pH的BR緩沖溶液，使用時用0.2mol/L NaOH溶液在酸度計上調(diào)至所需pH值，pH范圍分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。

取50μL制備好的探針溶液(8μg/mL)分別加入到不同pH值的BR緩沖溶液中，混合均勻后測熒光光譜，結(jié)果如圖4所示，從圖4中可以看出隨著pH的增大，480nm處的熒光逐漸減弱，這是由于在堿性條件下，多巴胺變成多巴醌，多巴醌對共軛聚合物納米粒子有猝滅作用，導(dǎo)致480nm處的熒光減弱。圖5中可以看出不同pH的熒光探針最大發(fā)射波長具有很好的線性關(guān)系。

不同濃度多巴胺對熒光強度的影響。

分別制備偶聯(lián)不同濃度多巴胺的探針，多巴胺濃度分別是0μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、120μmol/L、240μmol/L、480μmol/L、960μmol/L，制得溶液避光4℃保存。

取50μL制備好的不同多巴胺濃度探針分別加入到pH＝7.0的BR緩沖溶液中，混合均勻后測熒光光譜，結(jié)果如圖6所示，隨著多巴胺濃度的逐漸增大，480nm處的熒光逐漸減弱，說明連接的多巴胺越多，對共軛聚合物納米粒子的猝滅效果越明顯。

共軛聚合物傳感探針對pH的循環(huán)響應(yīng)。

準(zhǔn)確配置pH＝9.0的BR緩沖溶液，取50μL制備好的探針加入到pH＝9.0的BR緩沖溶液中，混合均勻后測熒光光譜。

用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH＝5.0，混合均勻后測熒光光譜。

用稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH＝9.0，混合均勻后測熒光光譜，如此循環(huán)反復(fù)5次。從圖7中可以看出隨著pH的變化，480nm處的熒光也隨之循環(huán)變化，并且熒光強度沒有發(fā)生變化，因此具有很好的循環(huán)效果。

以上示意性地對本發(fā)明創(chuàng)造及其實施方式進行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所示的也只是本發(fā)明創(chuàng)造的實施方式之一，實際的結(jié)構(gòu)并不局限于此。所以，如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示，在不脫離本創(chuàng)造宗旨的情況下，不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計出與該技術(shù)方案相似的結(jié)構(gòu)方式及實施例，均應(yīng)屬于本專利的保護范圍。