本發(fā)明涉及一種鑒定阿膠真?zhèn)蔚慕M合物及試劑盒，還包括使用該組合物或試劑盒進行阿膠真?zhèn)舞b定的方法，本發(fā)明屬于醫(yī)藥與食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

阿膠作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，已有數(shù)千年的食用歷史，具有補血滋陰，潤燥，止血的功效。中國藥典規(guī)定，阿膠為馬科動物驢Equus asinus L.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。純正的阿膠必需來自百分百的驢皮，方能保證產(chǎn)品的功效。從原料生物分類學上看，驢屬于奇蹄目馬科驢屬，包括非洲野驢、藏野驢、中亞野驢、家驢等品種。其中中國飼養(yǎng)的家驢包括關(guān)中驢、德州驢、廣靈驢、佳米驢、泌陽驢、淮陽驢、慶陽驢、華北驢、新疆驢、西南驢等眾多地方品種。由于驢的畜牧價值不斷下降，而其經(jīng)濟價值卻未見提高，驢的數(shù)量在世界范圍內(nèi)急劇下降，驢皮的供應(yīng)也逐年緊張，價格不斷上漲。市場上出現(xiàn)了很多不法分子，在生產(chǎn)阿膠時，部分甚至全部用各種其他動物皮包括馬皮、騾皮、牛皮、豬皮等來取代驢皮進行熬制，有的甚至直接摻入工業(yè)明膠。這些偽品的存在嚴重干擾了市場正常秩序，損害消費者利益，影響正規(guī)產(chǎn)品的信譽。

阿膠經(jīng)長時間高溫蒸煮濃縮而成，主要成分非常相近且不同廠家的生產(chǎn)工藝存有差異，采用紅外、近紅外、X-衍射、HPLC等方法對阿膠進行真?zhèn)舞b別常存在判斷不準確、缺乏足夠說服力等。目前已報道的鑒別阿膠真?zhèn)伪容^權(quán)威的方法主要是DNA分子鑒定方法和檢測特征性肽段的液質(zhì)聯(lián)用方法。已報道的這兩種方法都無法對阿膠中驢皮源成分進行比較準確的定量檢測，而是通過檢測阿膠中是否含有驢的成分，并排除其他動物源成分來判斷阿膠真?zhèn)危坏⒛z的摻假可能會五花八門，因此需要排除的動物源成分會是多種多樣，利用排除法來鑒別阿膠真?zhèn)未嬖谥匾毕?，其準確性和可靠性會大打折扣，這種情況非常不利于對市場阿膠產(chǎn)品的監(jiān)管。利用驢皮源成分含量來判斷阿膠真?zhèn)?，可從根本上限制阿膠的造假行為。已報道的文獻中，對驢皮源性成分檢測，基本都沒有排除馬皮源性成分，因此雖宣稱為驢皮源成分，實則為驢與馬共有。

因此，目前迫切需要提出一種能夠快速、準確檢測阿膠中阿膠含量的方法，進而實現(xiàn)對阿膠產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于，提供快速、準確鑒別阿膠真?zhèn)蔚慕M合物。

本發(fā)明的另一個目的在于，提供用于快速、準確鑒別阿膠真?zhèn)蔚脑噭┖小?/p>

本發(fā)明的再一個目的在于，提供快速、準確檢測鑒別阿膠真?zhèn)蔚臋z測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種用于阿膠真?zhèn)舞b定的組合物，其由多肽I、多肽II、多肽III以及對照品檢測基質(zhì)組成，其中，所述多肽I的氨基酸序列為Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Lys(SEQ ID NO.1所示)，多肽II的氨基酸序列為His-Gly-His-Arg(SEQ ID NO.2所示)，多肽III的氨基酸序列為Gly-Val-Val-Gly-Pro-Gln-Gly-Ala-Arg(SEQ ID NO.3所示)，對照品檢測基質(zhì)為魚皮膠。

含有所述的組合物的試劑盒也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

進一步的，本發(fā)明還提出了一種使用所述的組合物或試劑盒鑒定阿膠真?zhèn)蔚姆椒?，包括如下步驟：

1)對照品溶液的制備：

對照品檢測基質(zhì)粉碎后，稱取一定量的對照品檢測基質(zhì)于量瓶中，加入NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，得到基質(zhì)溶液，用配制得到的基質(zhì)溶液溶解稱量好的多肽I、多肽II和多肽III，搖勻，得到對照品母液，采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液中加胰蛋白酶溶液，酶解；

2)待檢測樣品溶液的制備：

取待測純品膠樣品于量瓶中，加NH₄HCO₃溶液溶解，微孔濾膜過濾，續(xù)濾液加胰蛋白酶酶解；

3)將對照品溶液、待檢測樣品溶液分別放入液質(zhì)聯(lián)用儀，選擇m/z469.5→457.3、655.4，m/z253.8→312.2，369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃；

4)按下式計算出阿膠糕樣品中阿膠的含量：

阿膠中驢皮源成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的NH₄HCO₃溶液為1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的對照品溶液的制備包括以下步驟：

1)基質(zhì)溶液的制備：對照品檢測基質(zhì)粉碎后，稱取0.50g的對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

2)稱取0.05g對照品檢測基質(zhì)于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，分別加入18.3mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻；

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，分別將對照品母液稀釋500-10⁵倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟2)中所述的待檢測樣品溶液的制備包括以下步驟：取0.05g待測純品膠樣品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟3)中液質(zhì)聯(lián)用儀檢測的液相條件為：C₁₈反相色譜柱，流動相A為含有0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測。

更進一步的，本發(fā)明還提出了所述的組合物以及試劑盒在阿膠真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用。

直接對阿膠中驢皮源成分進行準確的含量檢測，首先要找出能標志驢皮源成分且在不同生產(chǎn)工藝的純品阿膠中含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)，尤其要去除與驢親緣關(guān)系較近的馬、騾等的偽品成分；其次阿膠中的成分非常復(fù)雜，檢測時信號不穩(wěn)定，因此該物質(zhì)要滿足在檢測時具有較高的信號響應(yīng)、較低的噪音及其他物質(zhì)干擾，還應(yīng)考慮檢測信號的穩(wěn)定性；第三需要設(shè)立合適的對照品等。對此，本發(fā)明通過選取驢皮源性特征性多肽，并采用多肽I的檢測值減去多肽II的檢測值，并利用多肽III的檢測值來修正檢測偏差，從而實現(xiàn)對阿膠中驢皮源成分的含量檢測。實驗證明，采用本發(fā)明的方法，能夠準確地檢測阿膠中驢皮源成分的含量，且操作簡單，在阿膠產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖；

圖2是各種純品膠MRM掃描模式下選擇離子對m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實例進行詳細描述。優(yōu)選實例中沒有注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進行。

實施例1純品膠的檢測

1材料和試劑

材料：各種純品膠，包括阿膠、馬皮膠、黃明膠、豬皮膠、羊皮膠，魚皮膠(對照品檢測基質(zhì))，分別用驢皮、馬皮、牛皮、豬皮、羊皮以及魚皮煎煮獲得。

多肽I(SEQ ID NO.1所示，純度99.2％)、多肽II(SEQ ID NO.2所示，純度99.5％)、多肽III(SEQ ID NO.3所示，純度99.2％)，交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：稱取0.05g對照品檢測基質(zhì)于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，分別加入18.3mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，將對照品母液稀釋1000倍，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)待檢測純品膠樣品溶液的制備：取0.05g待測純品膠樣品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

5)分別取對照品溶液、待檢測純品膠樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為含有0.1％(v/v)甲酸的水溶液，流動相B為含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z469.5→457.3、655.4，m/z253.8→312.2，369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對。待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃；

6)計算出樣品中阿膠的含量：

圖1是對照品溶液MRM掃描模式下選擇離子對m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖；圖2是各種純品膠MRM掃描模式下選擇離子對m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4監(jiān)測的質(zhì)譜圖。

通過將對照品與純品膠的質(zhì)譜圖峰面積比對，計算出純品膠中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計算出各樣品中驢皮源性成分的含量：

樣品中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％。

阿膠中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.2892/937.1–0/505.5)×840/0.2601×100％＝99.67％≈100％

馬皮膠中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.2786/937.1–0.1516/505.5)×840/0.2580×100％＝–0.85％≈0％

黃明膠中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0/937.1–0/505.5)×840/0.2593×100％＝0％

豬皮膠中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0/937.1–0/505.5)×840/0.2670×100％＝0％

羊皮膠中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0/937.1–0/505.5)×840/0.2606×100％＝0％

上述計算結(jié)果表明：阿膠中驢皮源成分的含量100％，馬皮膠、黃明膠、豬皮膠和羊皮膠中驢皮源成分的含量為0％。這與實際情況相符，表明該方法能從驢皮源成分含量的角度準確區(qū)分阿膠與偽品膠。

實施例2混合膠樣品的檢測

1材料和試劑

材料：混合膠樣品由實施例1中的純品膠樣品分別加入不同質(zhì)量的阿膠制成，包括含15％(w/w)阿膠的黃明膠、含30％(w/w)阿膠的黃明膠、含60％(w/w)阿膠的黃明膠、含30％(w/w)阿膠的馬皮膠、含30％(w/w)阿膠的豬皮膠，分別作為樣品1-5。

多肽I(SEQ ID NO.1所示，純度99.2％)、多肽II(SEQ ID NO.2所示，純度99.5％)、多肽III(SEQ ID NO.3所示，純度99.2％)，交由生物公司合成。

試劑：碳酸氫銨(分析純)、胰蛋白酶(序列純)。

2檢測方法

1)基質(zhì)溶液的制備：稱取0.50g對照品檢測基質(zhì)于250ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

2)對照品母液的制備：稱取0.05g對照品檢測基質(zhì)于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，分別加入18.3mg的多肽I、9.9mg的多肽II和16.4mg的多肽III，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻。

3)對照品溶液的制備：采用分步稀釋的方法，以基質(zhì)溶液為溶劑，分別將對照品母液稀釋10³倍、10⁴倍、2×10⁴倍、4×10⁴倍、6×10⁴倍、微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

4)待檢測混合膠樣品溶液的制備：取0.05g待測純品膠樣品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)，超聲使樣品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒溫酶解12h。

5)分別取對照品溶液、待檢測純品膠樣品溶液各5μl放入液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測。液相條件：C₁₈反相色譜柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為0.1％甲酸的乙腈溶液，流速0.3ml/min；梯度洗脫：0→20min，流動相A 100％→25％，流動相B 0％→75％。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式(ESI⁺)進行多反應(yīng)監(jiān)測，選擇m/z469.5→457.3、655.4，m/z253.8→312.2，369.2，m/z421.0→684.4、528.3作為檢測離子對進行MRM掃描，其中選擇m/z469.5→457.3、m/z253.8→312.2、m/z421.0→684.4分別作為多肽I、多肽II和多肽III的定量離子對。

6)計算出樣品中阿膠的含量：

以對照品溶液的各多肽的含量為縱坐標、峰面積為橫坐標進行標準曲線的繪制，各多肽的線性相關(guān)系數(shù)R≥0.9993，由此計算出混合膠中多肽I、多肽II和多肽III的含量，待檢測阿膠樣品中多肽I的含量記為M₁、多肽II的含量記為M₂、多肽III的含量記為M₃，然后，按下式計算出各樣品中驢皮源性成分的含量：

樣品中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％。

樣品1中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.0438/937.1–0/505.5)×840/0.2598×100％＝15.11％

樣品2中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.0876/937.1–0/505.5)×840/0.2612×100％＝30.06％

樣品3中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.1752/937.1–0/505.5)×840/0.2608×100％＝60.22％

樣品4中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.2832/937.1–0.1071/505.5)×840/0.2585×100％＝29.36％樣品5中驢皮源性成分的含量(％)＝(M₁/937.1–M₂/505.5)×840/M₃×100％＝(0.0866/937.1–0/505.5)×840/0.2652×100％＝29.27％

上述計算結(jié)果表明：含15％阿膠的黃明膠樣品中驢皮源成分含量15.11％、含30％阿膠的黃明膠樣品中驢皮源成分含量30.06％、含60％阿膠的黃明膠樣品中驢皮源成分含量60.22％、含30％阿膠的馬皮膠樣品中驢皮源成分含量29.36％、含30％阿膠的豬皮膠樣品中驢皮源成分含量29.27％。這與實際情況相符，表明該方法能準確檢測阿膠中驢皮源成分的含量。

綜上所述，利用本發(fā)明公開的三個多肽以及對照品檢測基質(zhì)，采用液質(zhì)聯(lián)用儀，能準確檢測阿膠中驢皮源成分的含量。

需要說明的是，以上實施例僅用以說明發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作的各種改動或修改而不背離本發(fā)明的精神與范圍，這些等價形式同樣落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

序列表

<110> 東阿阿膠股份有限公司

<120> 一種用于阿膠真?zhèn)舞b定的組合物、試劑盒及其檢測方法

<130> KLPI161259

<160> 3

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 多肽I

<400> 1

Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Lys

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 多肽II

<400> 2

His Gly His Arg

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 多肽III

<400> 3

Gly Val Val Gly Pro Gln Gly Ala Arg