本發(fā)明涉及醫(yī)療衛(wèi)生部門的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種人類精子線粒體功能檢測方法。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟的發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，不孕不育的發(fā)病率反而呈增長趨勢，已成為當(dāng)今影響人類生活和健康的一類主要疾病，其中在我國，不孕不育癥在育齡期夫婦中發(fā)病率達10％以上，并有逐漸增多的趨勢。男性因素和女性因素各占30％，雙方共同因素占40％。男性因素中精子原因居首位。世界衛(wèi)生組織(WHO)在25個國家9000對不育夫婦的多中心研究中發(fā)現(xiàn)，50％的男性不育癥是特發(fā)性精子異常。精子活力是衡量精液質(zhì)量和男性生育力的一個重要指標。男科學(xué)上把精子因活力不足而導(dǎo)致的男性生育能力低下，稱為弱精子癥或精子活力低下。在男性不育患者中弱精子癥約占19％，已成為影響男性生育力的常見病因。精子尾部中段主要由線粒體構(gòu)成，線粒體活性的改變會影響精子的能量供應(yīng)，精子持續(xù)運動能力，而且線粒體還是細胞凋亡的調(diào)控中樞。因此，線粒體的功能狀態(tài)是精子功能質(zhì)量的一個關(guān)鍵性指標。線粒體活性的評價主要通過檢測線粒體的跨膜電位變化來分析。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、結(jié)果易于判定、檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣的人類精子線粒體功能檢測方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種人類精子線粒體功能檢測方法，包括如下步驟：
(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個/mL，每個標本處理兩管，分別作為對照管和檢測管；
(2)將500μL稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中，同時加入5μL的JC-1染液，避光染色15分鐘，其中對照管置于85℃條件下2分鐘，滅活，檢測管置于37℃條件下保持活力；
(3)設(shè)定流式細胞儀的校準，對照管、檢測管按順序上機，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個細胞并使用MMP軟件統(tǒng)計分析；
(4)根據(jù)MMP軟件統(tǒng)計分析得出結(jié)果，將37℃正常處理樣本百分比減去85℃高溫處理后的空白樣本百分比，得到的MMP百分比差值即區(qū)分出正常人群百分比數(shù)值；
(5)測定后，分別用漂白劑、進樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細胞儀進樣線中的細胞碎片和熒光染料。
步驟(1)中所述的緩沖液為氯化鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、氯化鉀、酸鎂、氯化鈣、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二鈉鹽、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白和乳酸鈉的混合物。
步驟(2)中所述的JC-1染色液為JC-1和二甲基亞砜的混合物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明一種人類精子線粒體功能檢測方法，該方法采用對線粒體膜電位變化敏感的染料JC-1，親脂性陽離子熒光染料5,5′，6,6′-四氯-1,1′,3，3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide，JC-1)，是檢測精子線粒體膜電位△ψm最理想的染料。正常精子線粒體膜電位△ψm高，在膜內(nèi)JC-1以聚合體存在，發(fā)橙色光；異常精子線粒體膜電位△ψm降低，JC-1以單體形式存在，發(fā)綠色光，其采用流式細胞術(shù)進行分析，具有操作簡單、結(jié)果易于判定、檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、且易于臨床推廣的優(yōu)點。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
具體實施例
一種人類精子線粒體功能檢測方法，包括如下步驟：
(1)將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106個/mL，每個標本處理兩管，分別作為對照管和檢測管；
(2)將500μL稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中，同時加入5μL的JC-1染液，避光染色15分鐘，其中對照管置于85℃條件下2分鐘，滅活，檢測管置于37℃條件下保持活力；
(3)設(shè)定流式細胞儀的校準，對照管、檢測管按順序上機，每管樣本至少連續(xù)測定兩次，每管樣本至少記錄樣本主群5000個細胞并使用MMP軟件統(tǒng)計分析；
(4)根據(jù)MMP軟件統(tǒng)計分析得出結(jié)果，將37℃正常處理樣本百分比減去85℃高溫處理后的空白樣本百分比，得到的MMP百分比差值即區(qū)分出正常人群百分比數(shù)值；
(5)測定后，分別用漂白劑、進樣管清潔劑和除菌的雙蒸水徹底清除殘留于流式細胞儀進樣線中的細胞碎片和熒光染料。
上述漂白劑為50％的雙蒸水ddH2O和50％約含5％的次氯酸鈉的混合物，進樣管清潔劑為50％的乙醇、50％的漂白劑和0.5M NaCl的混合物。
當(dāng)然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護范圍。