一種缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。通過對(duì)人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因 子進(jìn)行N末端的缺失，得到了缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。實(shí)驗(yàn)證 明，通過與全長人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行比較，該結(jié)構(gòu)具有更高的比活 性，有望被開發(fā)成為治療帕金森綜合癥的一種產(chǎn)品。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森?。≒arkinson disease，PD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)病變性疾病，其確切 的病因?qū)W機(jī)制至今未明，目前普遍認(rèn)為系遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。其中氧化（硝 化）應(yīng)激、小膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)的聚集與清除障礙、自噬 應(yīng)激等事件是其病理生理學(xué)機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前研究的結(jié)果，正常人黑質(zhì)致密部中大 約有50萬個(gè)特化的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)其被破壞75-80%時(shí)，患者將出現(xiàn)帕金森病的癥 狀。遺傳學(xué)方面，目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)基因連鎖位點(diǎn)與家族性的發(fā)病相關(guān)。除線粒體DNA突 變外，Parkin、PINK1、DJ-1等基因突變與常染色體隱性遺傳的家族性有關(guān)，而突觸核蛋 白、UCH-L1、LRRK2等基因與常染色體顯性遺傳的家族性有關(guān)，其中PINK1、Parkin、DJ-1 屬線粒體蛋白，與線粒體功能密切相關(guān)。
[0003] 帕金森疾病的臨床表現(xiàn)為震顫、強(qiáng)直、姿勢不穩(wěn)和無法或者遲緩運(yùn)動(dòng)，我國ro患 者已經(jīng)達(dá)到約300萬人，目前ro的治療主要以藥物為主，包括抗膽堿能藥、金剛烷胺、左旋 多巴及復(fù)方左旋多巴，這些藥物可暫時(shí)改善癥狀，但不能阻止病情發(fā)展。
[0004] 目前針對(duì)帕金森綜合癥，人們重點(diǎn)的研究重點(diǎn)在腦神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面，現(xiàn)在主要 集中在神經(jīng)營養(yǎng)因子上。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類小分子分泌蛋白，通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào) 節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、發(fā)育、成熟與存活，尤其在調(diào)控神經(jīng)元的數(shù)量、突起的分支、突觸的形成 和神經(jīng)細(xì)胞表型的成熟等發(fā)面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)營養(yǎng)因子還有促進(jìn)損傷后神經(jīng)元再生， 治療慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的功能。其中中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（mesencephalic astrocyte derived neurotrophic factor，MANF)是目前人們研究的重點(diǎn)，MANF是Petrova 等于2003年首次在體外傳代培養(yǎng)的大鼠中腦I型星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離到的一種 能促進(jìn)體外多巴胺神經(jīng)元存活的神經(jīng)營養(yǎng)因子，分子量為18kD。MANF具有促進(jìn)多巴胺神經(jīng) 元存活的作用，研究發(fā)現(xiàn)MANF基因缺失的果蠅會(huì)因多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量和多巴胺水平的 減少而死亡，給予人源性MANF可發(fā)揮替代功能。在大鼠中風(fēng)模型中，MANF可保護(hù)大腦皮層 神經(jīng)元，在6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-〇HDA)誘導(dǎo)的大鼠帕金森模型中，通過紋 狀體內(nèi)注射MANF不但能保護(hù)中腦多巴胺神經(jīng)元和紋狀體多巴胺神經(jīng)纖維，而且能加強(qiáng)存 活神經(jīng)元的功能、修復(fù)受損的黑質(zhì)-紋狀體多巴胺系統(tǒng)，減少帕金森大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，具有 預(yù)防和治療的雙重潛在作用。同時(shí)，研究還證明與目前廣泛研究的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子（GDNF)相比，MANF對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)親和力低，擴(kuò)散范圍較大；選擇性作用于多巴胺神經(jīng) 元，對(duì)周圍運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元無影響，副作用??；在低、中藥物濃度時(shí)的選擇性 較⑶NF高。因此，MANF作為一種強(qiáng)效神經(jīng)保護(hù)因子，被認(rèn)為是治療某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病 的潛在候選因子，對(duì)于帕金森綜合癥的治療有較大的應(yīng)用前景。本發(fā)明對(duì)天然人MANF進(jìn)行 了缺失突變，得到的突變體具有活性更高的特點(diǎn)。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及缺失型人MANF的制備。
[0006] 全長人MANF由179個(gè)氨基酸組成，成熟的人MANF切去了 N末端的21個(gè)氨基酸， 是由158個(gè)氨基酸組成的分子量約為17kD，研究表明，分子結(jié)構(gòu)主要是由2個(gè)α螺旋組成 的功能區(qū)，Ν末端1-3位氨基酸處于無規(guī)卷曲形態(tài)，不是功能所必須的，而且暴露在溶液外， 推測對(duì)分子在溶液中的穩(wěn)定性具有不利的影響。據(jù)此，本發(fā)明將MANF的Ν末端3個(gè)氨基酸 去除，得到了缺失型MANF (dMANF)。
[0007] 經(jīng)測試，本發(fā)明的缺失型MANF的生物學(xué)活性明顯高于天然型人MANF，具有潛在的 治療帕金森綜合癥的作用。 四、
【具體實(shí)施方式】
[0008] 以下實(shí)例僅是對(duì)本發(fā)明的說明，而不會(huì)對(duì)本發(fā)明產(chǎn)生任何限制。
[0009](一）質(zhì)粒構(gòu)建和工程菌獲得
[0010] 1.天然人MANF和dMANF表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0011] 分別按照Seq ID Nol和Seq ID No2氨基酸序列，采用大腸桿菌喜好的密碼子，化 學(xué)合成天然人MANF和缺失型MANF的基因序列。
[0012] 采用PGEX-4T-1載體作為MANF的表達(dá)載體，其含有GST伴侶蛋白序列，能夠 有效地增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá)，并且利于目的蛋白的下游純化。采用BamHI-Sall雙酶切 PGEX-4T-1載體，并回收大片段，T4連接酶將目的基因和載體大片段連接后，轉(zhuǎn)化至克隆菌 株JM109中，再對(duì)經(jīng)篩選的單克隆重組質(zhì)粒進(jìn)行目的基因測序，目的基因測序結(jié)果與理論 序列一致，完成PGEX-4T-1-MANF和pGEX-4T-1-dMANF的重組表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0013] 2.轉(zhuǎn)化和工程菌構(gòu)建
[0014] 用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布在含有50ug/ml氨芐青霉素的LB平板，挑選 陽性菌落在LK中培養(yǎng)至0D6。。為0. 6-0. 8時(shí)加入IPTG 0.1 mM誘導(dǎo)3-4小時(shí)離心收集菌體， 8M尿素破菌后15% SDS-PAGE電泳時(shí)出現(xiàn)一條約18kD左右的蛋白帶，表達(dá)量約為30%。獲 得工程菌株 PGEX-4T-1-MANF/BL21 和 pGEX-4T-1-dMANF/BL21。
[0015] (二）目的蛋白獲得
[0016] 1.發(fā)酵
[0017] 1)培養(yǎng)基：
[0018] ⑴種子液培養(yǎng)基（LK):
[0019] 胰蛋白胨：1〇克/升、酵母粉：5克/升、氯化鈉：10克/升、卡那霉素：50微克/ 毫升。
[0020] (2)上罐培養(yǎng)基（15升）：
[0021] 磷酸氫二鈉：315克、磷酸二氫鉀：100克、氯化鈉：10. 05克、氯化銨：50克、胰蛋白 胨：90克。
[0022] 以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨(dú)滅菌后加入發(fā)酵罐。
[0023] 硫酸鎂：15克、葡萄糖：450克、補(bǔ)料（500克/升）：葡萄糖。
[0024] 2)發(fā)酵過程：
[0025] (1)種子培養(yǎng)：
[0026] 從已鑒定的平皿上劃取菌種，接種到50毫升（250毫升的三角瓶）LC中，36度、200 轉(zhuǎn)/分、8小時(shí)后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LC中，36度、200轉(zhuǎn)/分，過夜。
[0027] (2)發(fā)酵過程：
[0028] 將培養(yǎng)好的種子液（0D600 = 3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，36度、150轉(zhuǎn)、溶氧 100%，開始發(fā)酵；5小時(shí)后開始以2. 5mL/min的速度流加2小時(shí)，約加入800毫升補(bǔ)料，加 入1克IPTG誘導(dǎo)（4小時(shí)）。
[0029] 3)收集菌體
[0030] 離心6000rpm，15min，收集菌體，冷凍保存。
[0031] 2.純化
[0032] 1)親和層析
[0033] 采用GSH-Agrose層析介質(zhì)（Sigma公司），平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8,上樣 平衡后，裂菌的離心上清上Glutathione Sepharose層析柱，平衡后用含10mM還原型谷胱 甘肽（GSH)的洗脫液洗下融合蛋白。
[0034] 2)酶解
[0035] 上一步的洗脫液加入凝血酶（5NIHU/mL) 37°C酶切2小時(shí)。
[0036] 3)陰離子交換層析
[0037] 采用Q Sepharose HP層析介質(zhì)，平衡液為25mM Tris-HCl，pH8,上一步得到的樣 品用平衡液稀釋3倍進(jìn)行上樣，平衡后采用25mM PB，pH7,0-0. 5M NaCl的梯度洗脫，收集目 的蛋白洗脫峰。
[0038] (三）檢測
[0039] 1.純度測定
[0040] 得到的MANF和dMANF通過SDS-PAGE電泳和反相HPLC檢測，純度均大于98 %。
[0041] 2.生物學(xué)活性檢測
[0042] 采用動(dòng)物試驗(yàn)法比較樣品生物學(xué)活性。
[0043] 取40只大鼠，10%水合氯醛（3ml/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠頭部固定于大鼠腦 立體定位儀上，常規(guī)消毒后從正中縱形切開頭皮，暴露顱骨表面，以前_為基準(zhǔn)點(diǎn)，參照大 鼠腦立體定位圖譜，選用兩點(diǎn)法注射6-OHDA(2. 5g/L，含0. 02%抗壞血酸無菌生理鹽水）至 大鼠紋狀體，各點(diǎn)注射劑量均為10 μ g，體積為4 μ L，留8只作為空白對(duì)照組，不給予任何藥 物，留空針停至相同的時(shí)間，縫合并消毒傷口，待大鼠清醒后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0044] 動(dòng)物分組及給藥造模3周后，將損傷后的大鼠腹腔注射阿撲嗎啡（0.5g/L，含 0. 02 %抗壞血酸的無菌生理鹽水），并置于安靜空曠地帶，5-10min后觀察并計(jì)數(shù)大鼠向健 側(cè)不對(duì)稱的旋轉(zhuǎn)行為，觀察30min，平均每分鐘旋轉(zhuǎn)超過7次視為成功的大鼠模型。將 成功的大鼠模型隨機(jī)分組，每組10只，分別為：PBS組，MANF 10 μ g組，dMANF 10 μ g組。 分別給于相應(yīng)藥物，PBS和MANF (5、10、20g，一次性注射），體積均為7 μ L，給藥14天。
[0045] 大鼠行為學(xué)檢測：損傷后第6周，各實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射阿撲嗎啡，觀察計(jì)數(shù)其旋 轉(zhuǎn)行為，每隔2周進(jìn)行1次行為學(xué)檢測，給藥后共進(jìn)行3次行為學(xué)檢測，記錄每次各組大鼠 的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。
[0046] 結(jié)果，給藥后各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均有不同程度減少，其中給藥組在給藥后旋轉(zhuǎn) 圈數(shù)明顯少于PBS組：MANF組與PBS組比較P = 0.00192, dMANF組與PBS組比較P = 0. 00099，P值均小于0. 01，并且dMANF組和MANF組比較其旋轉(zhuǎn)圈數(shù)也有減少P = 0. 03091(P < 0· 05) 〇
[0047] 表1. MANF和dMANF對(duì)大鼠累積旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的影響
[0049] 結(jié)果表明，同天然MANF比較，dMANF具有更高的體內(nèi)生物學(xué)活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，由155個(gè)氨基酸組成，其 氨基酸序列見SEQIDNo2。2. 權(quán)利要求1中缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子為缺失天然人中 腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的N末端3個(gè)氨基酸。3. 權(quán)利要求1中的缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是用基因工程 方法得到。4. 權(quán)利要求1中的缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，作為藥物組合 物主要成份，用于治療帕金森綜合癥。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于治療帕金森綜合癥的缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。通過對(duì)人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行N端部分缺失突變，得到的缺失型重組人中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子具有活性更高的特點(diǎn)。
【IPC分類】A61K38/18, A61P25/00, C07K14/475
【公開號(hào)】CN105315359
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410370506
【發(fā)明人】劉愛華, 王輝, 莘旭妮
【申請(qǐng)人】北京泳健生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2014年7月31日