專利名稱：使用nanog將星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的制作方法
使用NANOG將星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞技術領域神經(jīng)干細胞(NSCs)是神經(jīng)系統(tǒng)的祖細胞的亞型，它具有分化為星形膠質(zhì)細胞、少突 膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元的能力。從中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)開始，神經(jīng)干細 胞形成多細胞神經(jīng)球，它們在各自的背景條件下分化為膠質(zhì)系和神經(jīng)系細胞(Sally Temple等人，2001)。這些神經(jīng)干細胞用于治療不治之癥，并且研究其作為用于細胞治 療的潛在方法。由于神經(jīng)干細胞是沒有存在太多倫理問題的成體干細胞，所以對其進行 了廣泛研究。近來活躍開展的去分化研究正在增強成體干細胞的重要性。成體干細胞比 胚胎干細胞更容易獲得，但是在其實際應用上仍有許多困難。此外，除非使用自身來源 的干細胞，否則免疫排斥反應也是一個問題。因此，使用病人自身的細胞誘導去分化可 以解決當前的問題。為了這個目的，必須誘導已經(jīng)分化了的細胞去分化。現(xiàn)在，正在進 行廣泛研究，使用例如細胞融合和核移植的方法來誘導去分化。在使用不同方法的另一 個研究組中，Alexis J.報道了分離自皮膚的細胞在神經(jīng)干細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時具有 神經(jīng)干細胞的特性aancet 2004)。此外，Toru L成功地將少突膠質(zhì)細胞前體去分化為 神經(jīng)干細胞(Genes & Development 2004)。這個研究組自2000年起已經(jīng)發(fā)表了關于此 問題的文章，并且在2004年的一篇文章中報道了各階段的基因表達與染色質(zhì)重塑和組 蛋白修飾有關。
背景技術：
在本發(fā)明中，提出了 一種前述介紹方法的問題的解決途徑，并且建立了 一種新的適 合的使用方法。在本發(fā)明中，選擇并過表達一種已知調(diào)控自我更新的胚胎干細胞特性的 轉錄因子來研究其分化為神經(jīng)千細胞。這個選擇的基因，鑒別為"Nanog"基因，與維 持胚胎干細胞的多能性(plurapotency)有關。作為同源結構域蛋白質(zhì)之一，Nanog蛋 白質(zhì)起轉錄激活子作用(Kaoru Mitsui, 2003)。 Nanog基因已知為調(diào)控干細胞的保持和 分化的關鍵因子。Nanog基因不僅在胚胎干細胞還在生殖細胞腫瘤中大量表達，但是如 上所述，由于表達量隨著分化過程降低，它不在終末分化期中表達(Ian Chambers等人， 2003)。由于Nanog基因2003年在Cell上第一次公開，隨后進行了大量其它研究?，F(xiàn) 在，發(fā)表了 Nanog基因調(diào)控的基因的結果(Paromita Deb-Rinker等人，2005, Guangin Pan等人，2005)。此外，近來BBRC上發(fā)表的一篇文章顯示NIH3T3細胞的生長率隨著 Nanog基因的過表達而增加(Jingyu Ahang等人，2005)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明者在此背景下進行了深入和徹底的研究，獲得的發(fā)現(xiàn)是其中 Nanog的過表達誘導已分化的星形膠質(zhì)細胞去分化為能夠自我更新并分化為星形膠質(zhì) 細月包、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的神經(jīng)干細胞樣的細胞。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的組合物，其包含 Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料。本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的方法，其 包含用Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料處理的步驟。本發(fā)明的又一個目的是提供使用此方法制備的神經(jīng)干細胞。本發(fā)明的再一個目的是提供一種分化去分化的神經(jīng)干細胞為星形膠質(zhì)細胞、少突膠 質(zhì)細力包和纟申經(jīng)元的方法。附圖簡述本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點將從以下附圖的詳迷中更清楚地理解， 其中

圖1顯示了免疫細胞化學分析的Nanog蛋白質(zhì)的過表達；圖2顯示了誘導去分化，其中顯示了球形成(A)和直接球形成(B)(左相差，右 GFP檢測)(當在適合于神經(jīng)干細胞的條件下培養(yǎng)單細胞時形成直接球，而僅在適合于星 形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)條件下后，在適合于神經(jīng)干細胞的條件下培養(yǎng)單細胞并穩(wěn)定12小時 時形成球)；圖3顯示了用免疫細胞化學分析的神經(jīng)干細胞標記物的表達，其中分化為神經(jīng)干細 胞(A至C)和神經(jīng)干細胞樣的細胞(Ink4a/Arf—星形膠質(zhì)細胞Nanog #2， #4， p53—/_星形 膠質(zhì)細胞Nanog #4， 6) (D至K);圖4顯示了生長曲線分析(A)和低密度接種檢測(B)測定的Nanog基因對細胞生長的 影響；和圖5顯示了神經(jīng)干細胞樣的細胞體外分化為星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞 (A-C:神經(jīng)干細胞、D-K:神經(jīng)干細胞樣的細胞、D-G: Ink4a/Arf+星形膠質(zhì)細胞Nanog GFP #2、 H-J: #4、 K: p53+星形月緩細胞Nanog GFP #4、 L-0: #6)。實現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明涉及一種能夠誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞 的組合物，其中包含Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料。如本文所用的術語"神經(jīng)干細胞樣的細胞"表示從體細胞去分化的能夠分化為神經(jīng) 元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的多能千細胞。在本發(fā)明中，神經(jīng)干細胞樣的細胞還 描述為神經(jīng)干細胞。本發(fā)明新近公開了當Nanog過表達時，雖然已經(jīng)分化，星形膠質(zhì)細胞仍可以去分化 為多能神經(jīng)干細胞樣的細胞。在本發(fā)明中，Nanog以蛋白質(zhì)或編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸形式提供。只要是來自于哺乳動物，例如人、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊和狗，任何 Nanog均可用于本發(fā)明的組合物。此外，本發(fā)明的用于去分化為神經(jīng)細胞的Nanog蛋白 質(zhì)可以是野生型或其變異體。術語"Nanog蛋白質(zhì)變異體"是指自然或人工產(chǎn)生的Nanog蛋白質(zhì)，其中Nanog蛋 白質(zhì)在氨基酸序列上由于氨基酸的缺失、插入、非保守取代或保守取代或它們的組合而 與野生型有一個或多個氨基酸不同。變異體是與天然蛋白質(zhì)具有相同生物活性的功能同 等物，盡管它們的物理和/或化學性質(zhì)被修飾。優(yōu)選地，變異體增強了對物理和化學環(huán) 境的結構穩(wěn)定性或生理活性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，Nanog是包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的 核酸材料的形式。編碼Nanog蛋白質(zhì)的核芬酸序列是編碼野生型或上述變異體類型的Nanog蛋白質(zhì)的 核苷酸序列，其中序列的一個或多個堿基可在堿基的缺失、插入、非保守取代或保守取 代或它們的組合上不同。此核苷酸序列可分離自天然產(chǎn)生的物質(zhì)或用化學方法合成。編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列既可以是單鏈也可以是雙鏈的DNA分子(基因組、 cDNA)或RNA分子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列包含在允許 Nanog蛋白質(zhì)表達的載體中。如本文所用的術語"載體"是指包含DNA序列的DNA構建體，該DNA序列被可操作 地連接于能夠影響所述DNA在適合的宿主細胞中表達的控制序列上。 如本文所用的術語"可操作地連接"是指核酸表達調(diào)控序列和編碼輩巴蛋白質(zhì)的第二 核酸序列間的功能性連接，以能完成一般的功能。重組載體的可操作地連接可使用本領 域眾所周知的基因重組技術制備，并且位點特異性DNA的斷裂和連接可使用本領域公知 的酶進行。適合于本發(fā)明使用的載體包括信號序列或用于膜靶向或分泌的前導序列或表達調(diào) 控元件，例如啟動子、操縱子、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苦酸化信號和增強子， 并且可根據(jù)它們的目的以多種形式構建。載體的啟動子可以是組成型的或是可誘導的。 此外，表達載體包括允許選擇包含載體的宿主細胞的選擇標記，并且當它們是復制的表 達載體時包括一個復制起點。此載體可以是自我復制的，或者可以是整合至宿主細胞的 DNA上。本發(fā)明中有用的載體可以是質(zhì)粒載體、粘粒載體或病毒載體，優(yōu)選病毒載體。病毒 載體的實例包括但是不限制于來源于逆轉錄病毒例如HIV (人類免疫缺陷病毒)、MLV (鼠 白血病病毒)、ASLV(禽類肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、函TV(小 鼠乳腺瘤病毒)等等、腺伴隨病毒和單純皰滲病毒的載體。包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苦酸序列的核酸材料可以載體的形式作為棵露DNA (Wolff等人，Science, 247: 1465-8， 1990; Wolff等人,J. Cell Sci. 103: 1249—59， 1992)，或在例如脂質(zhì)體或陽離子聚合物的幫助下引入細胞。為了在基因轉染中使用， 脂質(zhì)體是陽離子磷脂，例如DOTMA和DOTAP制成的磷脂膜。當與負電荷核苷酸以一定比 例混合時，陽離子脂質(zhì)體形成核苷酸-脂質(zhì)體復合物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材 料可以是在表達其中的Nanog蛋白質(zhì)的病毒。如本文所用的術語"病毒"涉及用攜帶編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的病毒載體 轉化或轉染包裝細胞制備的Nanog表達病毒。根據(jù)本發(fā)明的Nanog表達病毒的制備中有用的病毒實例包括但是不限于逆轉錄病 毒、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰滲病毒。優(yōu)選逆轉錄病毒。在以下實施例中，Nanog 表達病毒通過轉化攜帶編碼Nanog蛋白質(zhì)(pBabe puro Nanog IRES EGFP)的核香酸序列 的重組pBabe puro載體至PT67包裝細胞中制備。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的方法，包 含用Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料處理的步驟。更詳細地，此方法包含步驟(i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞；(ii)用Nanog蛋白
質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料處理培養(yǎng)基；和(i ii)誘導星形膠 質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞。任何用于培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的常規(guī)培養(yǎng)基可以用作在步驟(i)中星形月交質(zhì)細胞的培養(yǎng) 基。培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源和微量元素組分。此外，培養(yǎng)基可包括抗生素，例如青 霉素、鏈霉素和慶大霉素。培養(yǎng)基優(yōu)選包含bFGF。步驟(ii)中用于處理細胞的Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的 核酸材料如上所述。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及如前所述方法制備的神經(jīng)干細胞。已證實通過根據(jù)本發(fā)明的去分化制備的神經(jīng)干細胞表達同樣水平的神經(jīng)干細胞特 異性標記物Nestin、 CD133和Sox2，并且具有與一般神經(jīng)干細胞相同的分化能力。通 過根據(jù)本發(fā)明的去分化制備的神經(jīng)干細胞還顯示了自我更新的特性。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及分化根據(jù)前述方法去分化的神經(jīng)干細胞為星形膠 質(zhì)細胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的方法。當使用本發(fā)明的組合物和方法去分化的神經(jīng)干細胞處于本領域眾所周知的用于星 形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的各自的分化條件下時，分化為各自細胞可通過檢 測特異于各自細胞的標記物的表達來監(jiān)測。本發(fā)明的更好理解可通過以下實施例獲得，它們用于理解而不用于限制本發(fā)明。實施例1:實驗方法1. Ink4a/Arf—〃星形膠質(zhì)細胞、p53_/—星形膠質(zhì)細胞和小鼠神經(jīng)干細胞的培養(yǎng) Ink4a/Arf+星形膠質(zhì)細胞和p53+星形膠質(zhì)細胞在補充10%FBS (HyClone) 、 1%青霉素/鏈霉素和1%L-谷氨酰胺(Catnbrex)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM (高糖， HyClone))中培養(yǎng)。用作對照的神經(jīng)干細胞分離自小鼠(E13. 5)且在包含胰島素(Sigma)、 轉鐵蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/鏈霉素(Cambrex)，補充B27無 血清(Gibco)、人重組堿性FGF和人重組EGF(R&D)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基 /F12(謹M /F12， Gibco) (N2)中培養(yǎng)。2. 逆轉錄病毒介導的感染pBabe puro Nanog IRES EGFP (來源于pIRES-EGFP載體的人Nanog (NCBI登記號: NM-024865)cDNA和IRES EGFP與pBabe puro連接以構建pBabe puro Nanog IRES EGFP) 或pBabe puro EGFP使用脂質(zhì)體轉染試劑(Lipofectamine ) (Invitrogen)轉染至PT67 包裝細胞抹(Clontech)中且在嘌呤霉素(3yg/ml) (BD science)存在下選擇。轉化細胞 林生長至90。/。或更高密度(confluency)后，上清液通過過濾器(0. 45 nm) (Millipore) 以除去細胞^E爭片，然后上清液兩次使用以感染星形膠質(zhì)細^0兩次間間隔10小時^f吏用 1， 5-二曱基-1， 5-二氮H"—亞曱基聚曱溴化物(polybrene) (Sigma)分離。隨后在嘌 呤霉素(0. 5 u g/ml)存在下進行選擇。3. 生長曲線分析和低密度接種檢測以每孔1 x l(T個細胞接種至12孔板12小時后，每天用0. 01%結晶紫染色共六天。 醋酸提取后，使用分光光度計在600nm檢測密度以確定細胞生長率。對于低密度接種檢 測，每孔300個細胞接種于6孔板中，且兩周后用0. 01%結晶紫染色以監(jiān)測生長率。4. 誘導去分化在與用于神經(jīng)干細胞的相同的培養(yǎng)條件下誘導去分化。作為一個方法，細胞培養(yǎng)使 用兩種不同的方法來進行。細胞以1 x 105個細胞/孔的密度接種于6孔板上并在培養(yǎng)基 換為補充B27無血清(Gibco)、人重組堿性FGF和人重組EGF (R&D)、包含胰島素(Sigma)、 轉鐵蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/鏈霉素(Cambrex)的新鮮達爾伯 克改良伊格爾培養(yǎng)基/F12 (DMEM /F12, Gibco) (N2)時培養(yǎng)。細胞每天用bFGF處理， 且培養(yǎng)基每隔一天換為新鮮培養(yǎng)基?；蛘撸言谶m當條件下培養(yǎng)的細胞用胰蛋白酶作用， 然后以3 x 105個細胞的密度接種至60mm細菌培養(yǎng)平板上。補充B27無血清(Gibco)、 人重組堿性FGF和人重組EGF (R&D)、包含胰島素(Sigma)、轉鐵蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、 孕酮(Sigma)和青霉素/鏈霉素(Cambrex)的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基/F12 (DMEM /F12， Gibco)用作培養(yǎng)基。5. 通過免疫細胞化學測定過表達和各自的標記物用4°/。多聚曱醛(EMS)在4°C固定1小時后，在神經(jīng)球在4X^展動培養(yǎng)過夜前加入20% 蔗糖。然后，神經(jīng)球使用OCT化合物低溫冷藏于8孔小室載玻片(Nunc)中且在切成8 ~ 10pm后染色。用包含1(W正常羊血清(Jackson ImmunoResearch) + 0. 1%BSA (Sigma) + 0. 3°/。聚乙二醇辛基苯基醚X-100 (Sigma)的PBS封閉后，切片用抗-nestin (Chemicon)、抗-CD133 (MACS)、抗-Sox2 (Sigma)和抗-Nanog (R&D)在4。C培養(yǎng)過夜然 后與抗-小鼠-cy3 (Jackson ImmunoResearch)、抗-兔-FITC (分子探針)和抗-山羊-cy3 (Zymed)室溫反應，最后用DAPI (Sigma)核染色。蔡司共焦透鏡(Carl Zeiss)用于染色 后的檢查。分化的細胞以上述相同方式染色。在這方面，抗-GFAP(Dako)、抗-S100(3 (Zymed)、抗-p -微管蛋白III (Covance)、抗-Map2a (Sigma)、抗-TH (Sigma)、抗-04 (R&D) 和抗-CNP酶(Chemicon)用作抗體。 6.體外分化用PL0 (聚-L-鳥氨酸)(Sigma)和層粘連蛋白或纖維粘連蛋白(Sigma)包被后，細胞 在下面給出的分化條件下培養(yǎng)。為了分化為星形膠質(zhì)細胞，細胞培養(yǎng)在補充10。/。FBS(HyClone)的DMEM(HyClone,高 糖)中在人重組bFGF和EGF(R&D)或CNTF(重組大鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子)(Upstate)存在下 進行5 ~ 7天。通過在包含B27 (Gibco)無血清、補充人重組FGF的N2培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞4天并然 后在無FGF培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天誘導其分化為神經(jīng)元?；蛘?，細胞在1 ~ 10jum RA(維曱 酸，Sigma)存在下培養(yǎng)7 14天。作為其它選擇，細胞在1 ~ 10mM VPA (丙戊酸，Sigma) 和l-10fam RA(維甲酸，Sigma)的共存在下培養(yǎng)7 14天以20天誘導分化為神經(jīng)元。通過在補充B27無血清的N2培養(yǎng)基中在PDGF-AA(血小板衍生的生長因子-AA, R&D) 、 T3 (3, 3， 5-三碘-L-曱腺原氨酸，Sigma)、人重組堿性FGF和EGF (R&D)的存在下 培養(yǎng)誘導分化為少突膠質(zhì)細胞。當在前述分化條件下培養(yǎng)時，監(jiān)測細胞的形態(tài)學并使用特異于細胞的各自分化標記 物的抗體進行免疫細胞化學以檢測分化結果。 實施例2:結果人Nanog基因使用逆轉錄轉導系統(tǒng)在已分化的Ink4a/Arf—7—星形膠質(zhì)細胞和p53w— 星形膠質(zhì)細胞中過表達。使用Nanog抗體通過免疫細胞化學證實過表達并通過檢測正在 此基因下游定位的GFP的表達再次證實(圖1)。然后，使用用于神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)條件誘導去分化。星形膠質(zhì)細胞以每孔1 x 105 個細胞的密度接種于6孔板上，并且12小時后，細胞在適合于神經(jīng)干細胞的條件下培 養(yǎng)。培養(yǎng)3-4天內(nèi)，觀察到細胞具有神經(jīng)干細胞樣的形態(tài)。當細胞以3 x 105個細胞/板 的密度接種于60mm細菌平板上且在與神經(jīng)干細胞相同的條件下培養(yǎng)時，還觀察到它們 具有神經(jīng)干細胞的形態(tài)。相反，當培養(yǎng)根據(jù)前述方法用對照載體pBabe puro EGFP轉染 的細胞時，沒有形成神經(jīng)球。在后面的方法中，觀察神經(jīng)球，但是與表達Nanog基因的 細胞相比，其在尺寸上較小并且在數(shù)量上較少(圖2)。 一周后，觀察到神經(jīng)球具有與 當神經(jīng)干細胞轉移至新平板并在其上培養(yǎng)時相同的形態(tài)。為了檢測用Nanog基因去分化 的細胞是否能夠自我更新，進行子球(subsphere)形成檢測。結果是一周后在單細胞 中形成的球(數(shù)據(jù)未列出)。為了發(fā)現(xiàn)這些細胞是否具有與神經(jīng)干細胞相同的特性，使用各自的標記物進行免疫
細胞化學。在這方面，染色后，主要大量表達于神經(jīng)干細胞的標記物nestin、 CD133 和Sox2還以相同方式在神經(jīng)干細胞中觀察到。此外，因此形成的神經(jīng)球的冷凍切片確 證了 nestin、 CD133和Sox2的表達(圖3)。由此形成的神經(jīng)球細胞接種于PLO和層粘連蛋白包被的4孔板且在星形膠質(zhì)細胞的 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。結果獲得六個克隆。選擇比其它克隆顯示更快生長率的兩個克隆。當 Ink4a/Arf+星形膠質(zhì)細胞中Nanog基因過表達時，在#2和#4克隆中觀察到最快的生長 率，當p53+星形膠質(zhì)細胞中Nanog基因過表達時，在#4和#6克隆中觀察到最快的生長 率(圖4)。為了檢測神經(jīng)干細胞樣的細胞是否能像神經(jīng)干細胞一樣分化，以與上述相同的方式 誘導分化為星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。通過用針對各自標記物的特異性抗 體的分析，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞樣的細胞像神經(jīng)干細胞一樣分化為細胞的三種類型。分化為 星形膠質(zhì)細胞的鑒別用GFAP和S100的表達來進行，分化為神經(jīng)元的鑒別用|3-微管蛋 白III (Tujl)和Map2a的表達來進行。此外，用于分化為少突膠質(zhì)細胞的04和CNP0酶 的表達用其分化條件來鑒別(圖5)?？傊ㄟ^此研究獲得的數(shù)據(jù)說明Nanog基因在Ink4a/Arf—7—星形膠質(zhì)細胞和p53_/— 星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞樣的細胞中起著重要作用，并且這些去分化的神經(jīng)干 細胞樣的細胞可以分化回星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。工業(yè)應用性如前描述，Nanog在誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞中是有用的，并且去分 化的神經(jīng)干細胞可用于多種疾病的治療?，F(xiàn)有技術的文獻目錄1. Toru Kondo, Martin Raff. Chromatin remodeling and histone modification in the conversion of oligodendrocyte precursors to neural stem cells. Genes & Development 2004年；18: 2963-29722. Alexis Joannides, Phil Gaughwin, Chistof Shwiening, Henry Majed， Jane Sterling, Alastair Compston, Siddharthan Chandran. Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote neurogenesis from skin-derived stem cells. Lancet 2004年；363:172-1783.Sally Temple. The development of neural stem cells. Nature 2001 年；414: 112-1174. Hsieh J, Nakashima K, Kuwabara T， Mejia E， Gage FH. Histone deacetylase inhibitor—mediated neuronal differentiation of multipotent adult neural progenitor cells. PNAS 2004年；101:16659-166645. Tarasenko YI， Yu Y， Jordan PM， Bottenstein J， Wu P. Effect of growth factors on proliferation and phenotypic differentiation of human fetal neural stem cells. Journal of Neuroscience Research 2004年；78: 625-6366. Ping Wu, Yevgeniy Tarasenko, Ya叩ing Gu， Li-Yen M. Huang, Richard E. Coggeshall and Yongjia Yu. Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat. Nature neuroscience 2005年；5: 1271-12787. Hu X， Jin L， Feng Erkl/2 but not PI3K pathway is required for neurotrophin 3—induced oligodendrocyte differentiation of post-natal neural stem cells. Journal of Neurochemistry 2004年；90: 1339-13478. In-Kyung Park, Sean J. Morrison, and Michael F. Clarke. Bmil， stem cells, and senescence regulation, LClin. Invest. 2004年；113: 175-1799. Chambers, D. Colby， M. Robertson, J. Nichols, S. Lee， S. Tweedie and A. Smith, Functional expression cloning of Nanog， a pluripotency sustaining factor in embryonic stem ceils. Cell 2003年；113: 643-5510. L Mitsui， Y. Tokuzawa， H. Itoh， K. Segawa, M. Murakami, L Takahashi, M， Maruyama， M. Maeda and S， Yamanaka. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 113 (2003 年)，pp. 631-4211. T. Kuroda, M. Tada， H. Kubota， H. Kimura， S. Y. Hatano, H. Suemori， N. Nakatsuji and T. Tada. Octamer and Sox elements are required for transcriptional cis regulation of Nanog gene expression. Mol. Cell Biol. 2005年；25: 2475—48權利要求
1. 一種用于誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的組合物，其中星形膠質(zhì)細胞包含Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料。
2. 如權利要求l所述的組合物，其中所述包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸 材料是允許Nanog蛋白質(zhì)表達的載體。
3. 如權利要求l所述的組合物，其中所述包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸 材料是表達所述Nanog蛋白質(zhì)的病毒。
4. 如權利要求l所述的組合物，其中所述去分化的神經(jīng)干細胞具有分化為星形膠質(zhì) 細胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的能力。
5. —種用于誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的方法，所述方法包含用Nanog 蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料處理的步驟。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述去分化的神經(jīng)干細胞具有分化為星形膠質(zhì)細 胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的能力。
7. 如權利要求5所述的方法，所述方法包含以下步驟(i) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞；(ii) 用Nanog蛋白質(zhì)或包含編碼Nanog蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸材料處理；和 (i i i)誘導所述星形膠質(zhì)細胞分化為神經(jīng)干細胞。
8. 如權利要求7所述的方法，其中所述步驟(i)的培養(yǎng)基包含bFGF。
9. 一種使用權利要求5的方法制備的神經(jīng)干細胞。
10. —種將使用權利要求5的方法制備的神經(jīng)干細胞分化為星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和 少突膠^"細胞的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用Nanog誘導星形膠質(zhì)細胞去分化為神經(jīng)干細胞的組合物和方法。該去分化的神經(jīng)干細胞具有分化為星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的能力。
文檔編號C12N15/63GK101400791SQ200680053470
公開日2009年4月1日 申請日期2006年4月12日 優(yōu)先權日2006年2月27日
發(fā)明者全恩暻, 劉承權, 劉承駿, 孟薩克, 尹炳善, 文哉喜, 樸圭萬, 郭成植, 金淇東, 金甫那 申請人:銀怎株式會社