專利名稱：制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。具體地，本發(fā)明涉及來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，生產(chǎn)所述條件培養(yǎng)基的方法，使用所述的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，通過(guò)所述培養(yǎng)神經(jīng)元的方法所培養(yǎng)的神經(jīng)元，使用所述的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，以及在存在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞的分化所制備的神經(jīng)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
為了培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，一直使用合成培養(yǎng)基，其是補(bǔ)充了一些神經(jīng)細(xì)胞生存所必須的因子(例如，神經(jīng)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子)或者化學(xué)成分確定的組分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或者含有星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。與合成培養(yǎng)基相比，含有星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基能將神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物穩(wěn)定地維持更長(zhǎng)的時(shí)間。
還已知，通過(guò)在含有星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中使胚胎干細(xì)胞分化，可從胚胎干細(xì)胞有效誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞(見(jiàn)，非專利文件1和2)。
作為星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基，一直使用下述的條件培養(yǎng)基，其是通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)從動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、小牛、馬、豬、猴、兔或雞)的神經(jīng)組織中獲得的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞所制備的培養(yǎng)上清液(見(jiàn)，專利文件1和2)。
然而，使用原代星形膠質(zhì)細(xì)胞可能導(dǎo)致一些問(wèn)題。即，可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的活(神經(jīng))組織是有限的。從活組織中獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞花費(fèi)很多的時(shí)間和努力。另外，很難在培養(yǎng)容器中維持原代細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)物，它們的傳代培養(yǎng)限于幾代。因此，為了根據(jù)上述常規(guī)方法制備大量星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基，需要巨大的努力和時(shí)間重復(fù)制備的過(guò)程以及獲得足夠量的活組織。
另外，所培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的特性隨活體的成熟階段或者作為星形膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的活組織的區(qū)域而變化。此外，當(dāng)它們是從活體中獲得時(shí)，非期望的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞污染不可避免。因此，一直很難制備具有基本上均一質(zhì)量的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的穩(wěn)定制劑。
已經(jīng)報(bào)道了許多用于維持神經(jīng)培養(yǎng)物(神経細(xì)胞)的培養(yǎng)基，包括補(bǔ)充了各種細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基(見(jiàn)非專利文件3和4)。然而，通常使用在所述文獻(xiàn)中所公開(kāi)的培養(yǎng)體系不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定維持神經(jīng)培養(yǎng)物。如果這些培養(yǎng)基之一對(duì)維持神經(jīng)生存有效，那么其常常促進(jìn)另外神經(jīng)膠質(zhì)增殖，這產(chǎn)生了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)物。因此，這種培養(yǎng)體系不適合制備用于，例如，檢驗(yàn)受試化合物對(duì)神經(jīng)元的藥理學(xué)效應(yīng)的均一的神經(jīng)元培養(yǎng)物。
很久以前，已知原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以用于培養(yǎng)神經(jīng)元。然而，在神經(jīng)元的長(zhǎng)期培養(yǎng)方面，已表明單獨(dú)應(yīng)用的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的效率要低于相關(guān)報(bào)道的情況。據(jù)報(bào)道，僅僅通過(guò)向原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中添加各種添加劑(因子)，可制備適于神經(jīng)元的長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)的培養(yǎng)基(見(jiàn)專利文件1和2)。
日本專利申請(qǐng)No.JP-A-9-289891[專利文件1]日本專利申請(qǐng)No.JP-A-9-322765[非專利文件1]Takashi Nakayama等，Neuroreport.2004 Mar1；15(3)487-91.″Efficient production of neural stem cells and neuronsfrom embryonic stem cells″[非專利文件2]Takashi Nakayama等，Neurosci Res.2003Jun；46(2)241-9.″Astrocyte-derived factors instruct differentiation ofembryonic stem cell into neurons″[非專利文件3]Bottenstein JE等，Proc Natl Acad Sci USA.1979Jan；76(1)514-7.″Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-freesupplemented medium″[非專利文件4]Brewer GJ等，Brain Res.1989 Aug 7；494(1)65-74.″Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at lowdensityadvantages，technique or low oxgen″
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明將解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法。該方法有效地達(dá)到至少下列效果之一穩(wěn)定地提供基本上均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；通過(guò)簡(jiǎn)單的方法提供大量星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；提供基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的細(xì)胞成分的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(例如提供基本上不含非人細(xì)胞成分的人星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)；提供可用于有效地將胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基；提供可用于長(zhǎng)時(shí)間維持所分離神經(jīng)元的穩(wěn)定、健康的培養(yǎng)物的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，等等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)上述方法所制備的星形膠質(zhì)樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其對(duì)至少下列之一有用有效地誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定、健康的神經(jīng)培養(yǎng)物(神経細(xì)胞)，等等。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，其可達(dá)到至少下列之一長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定、健康的神經(jīng)培養(yǎng)物；在基本上不存在來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的條件下培養(yǎng)來(lái)自靶動(dòng)物的神經(jīng)元，等等。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種將胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其可達(dá)到至少下列之一有效地誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞；在基本上不存在來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的條件下，有效地誘導(dǎo)來(lái)自靶動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，等等。
此外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞。通過(guò)使用所述的神經(jīng)細(xì)胞，可達(dá)到至少下列之一基本上無(wú)源自非靶動(dòng)物(作為靶動(dòng)物例如，人)的成分污染的條件下進(jìn)行細(xì)胞移植處理；提供與靶動(dòng)物(例如，人)的活體具有高度相容性的細(xì)胞，等等。
本發(fā)明的其它目的根據(jù)說(shuō)明書結(jié)合常規(guī)技術(shù)顯而易見(jiàn)。
解決問(wèn)題的方法本發(fā)明是根據(jù)上述目的完成的并且涉及下列[1]一種制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法，其中所述的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞來(lái)源于胚胎干細(xì)胞，其特征在于，培養(yǎng)通過(guò)胚胎干細(xì)胞分化所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞；[2][1]的方法，其中所述的胚胎干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞；[3][2]的方法，其中所述的哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類動(dòng)物；[4][3]的方法，其中所述的靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人；[5]權(quán)利要求[1]-[4]中任何一項(xiàng)的方法，包括步驟(A)由胚胎干細(xì)胞制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，和(B)培養(yǎng)通過(guò)所述步驟(A)制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞以產(chǎn)生培養(yǎng)上清液；[6][5]的方法，在該方法的步驟(A)中，通過(guò)使用星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、初步制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，或初步制備的功能上等同于所述星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基來(lái)使胚胎干細(xì)胞分化。
一種來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，其是通過(guò)[1]-[6]中的任何一項(xiàng)制備的；[8]一種培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，其特征在于，在根據(jù)[7]的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元；[9]通過(guò)根據(jù)[8]的方法培養(yǎng)的神經(jīng)元；[10]一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于，在根據(jù)[7]的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下，將胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞和[11]通過(guò)使用根據(jù)[7]的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來(lái)使胚胎干細(xì)胞分化所獲得的神經(jīng)細(xì)胞。
發(fā)明效果本發(fā)明的用于制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法可很容易地和穩(wěn)定地提供大量具有基本上均一質(zhì)量的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。另外，本發(fā)明的方法可提供基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的動(dòng)物成分的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，例如，基本上不含非人成分的人星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
進(jìn)一步，本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的有益性質(zhì)在于其性質(zhì)是基本上相同的。另外，本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可有效地誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞并且其也可長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定、健康地維持神經(jīng)元。此外，通過(guò)使用本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可制備神經(jīng)細(xì)胞并在基本上不存在任何來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的條件下維持。例如，可使用本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用于制備含有基本上不存在非人細(xì)胞成分的人神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物(ヒト神経系細(xì)胞)(例如，神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞，等等)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，在基本上不存在任何來(lái)自非靶動(dòng)物的動(dòng)物成分的條件下可長(zhǎng)期穩(wěn)定、健康地培養(yǎng)神經(jīng)元。例如，根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，可在基本上不存在任何非人成分的條件下維持人神經(jīng)培養(yǎng)物(ヒト神経細(xì)胞)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于將胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，可有效地由胚胎干細(xì)胞制備基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的動(dòng)物成分的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物。因此，通過(guò)本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法所制備的神經(jīng)細(xì)胞將可用于藥物開(kāi)發(fā)，例如，制備用于再生治療的細(xì)胞移植材料，制備用于新藥開(kāi)發(fā)的測(cè)定系統(tǒng)(例如，毒性評(píng)估、效能評(píng)估，等等)。
此外，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞可用于在基本上無(wú)來(lái)自非靶動(dòng)物的動(dòng)物的成分的共轉(zhuǎn)染的情況下進(jìn)行細(xì)胞移植。另外，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞顯示與待治療的動(dòng)物(例如，人)活體的高度相容性。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞可以用于篩選新藥的試驗(yàn)系統(tǒng)，以開(kāi)發(fā)適于待治療的動(dòng)物(例如人)的藥物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代神經(jīng)元在來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或N2培養(yǎng)基(DMEMF-12+N2添加劑)中培養(yǎng)2天所制備的細(xì)胞的形態(tài)照片。A和B板顯示了使用N2培養(yǎng)基的情況，和C和D板顯示了使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況。在圖中，圖解比例尺表示50μm。
圖2顯示了免疫染色分別檢測(cè)GFAP(膠質(zhì)原纖維酸性蛋白)和MAP2(微管相關(guān)蛋白2)表達(dá)的結(jié)果。A板顯示了使用N2培養(yǎng)基的情況，和B板顯示了使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況。MAP2的表達(dá)通過(guò)綠色熒光檢測(cè)到，GFAP的表達(dá)通過(guò)紅色熒光探測(cè)到。在圖中，圖解比例尺表示50μm。
圖3顯示了在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或含B-27的NeurobasalTM培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天的細(xì)胞的照片。A和B板顯示了在含B-27的NeurobasalTM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，和C和D板顯示了在來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。在圖中，圖解比例尺表示50μm。
圖4顯示了在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或含B-27的NeurobasalTM培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天的細(xì)胞的照片。A和B板顯示了在含B-27的NeurobasalTM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，和C和D板顯示了在來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。在圖中，圖解比例尺表示50μm。
圖5顯示了從猴胚胎干細(xì)胞制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。圖中顯示用抗GFAP抗體或抗MAP2抗體免疫染色；A板顯示了GFAP的表達(dá)(綠色熒光)，B板顯示了MAP2的表達(dá)(紅色熒光)和C板顯示了A和B板的融合圖像。在圖中，圖解比例尺表示100μm。
圖6顯示了使用來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，從猴胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)元(神經(jīng)細(xì)胞)的照片。A和D板顯示了免疫染色細(xì)胞(綠色熒光表示hrGFP的組成型表達(dá)，以及實(shí)驗(yàn)中使用的猴胚胎干細(xì)胞(CMK6-G4細(xì)胞系)和由它們分化的細(xì)胞的定位)，和B和E板分別顯示了βIII微管蛋白(紅色熒光，與A板相當(dāng))和MAP2(紅色熒光，與D板相當(dāng))的表達(dá)，和C和F板分別顯示了A和B板、D和E板的融合圖像。在圖中，圖解比例尺表示100μm。
圖7顯示了從人胚胎干細(xì)胞制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的照片。板中顯示了用抗GFAP抗體或抗MAP2抗體免疫染色，A板顯示了GFAP的表達(dá)(綠色熒光)，B板顯示了MAP2的表達(dá)(紅色熒光)，和C板顯示了A和B板的融合圖像。在圖中，圖解比例尺表示100μm。
圖8顯示了使用來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，從人胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)元(神經(jīng)細(xì)胞)的照片。A和D板顯示了免疫染色細(xì)胞(綠色熒光表示hrGFP的組成型表達(dá)，以及實(shí)驗(yàn)中使用的人胚胎干細(xì)胞(SA181hrG2細(xì)胞系)和來(lái)源于它們的細(xì)胞的定位)的照片，和B和E板分別顯示了βIII微管蛋白(紅色熒光，與A板相當(dāng))和MAP2(紅色熒光，與D板相當(dāng))的表達(dá)，和C和F板分別顯示了A和B板、D和E板的融合圖像。在圖中，圖解比例尺表示100μm。
圖9顯示了在細(xì)胞群中通過(guò)免疫染色檢測(cè)到的III類β微管蛋白-免疫陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞群是人神經(jīng)祖細(xì)胞在來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或N2培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天而制備的。A板表示使用N2培養(yǎng)基(N2)的情況和B板表示使用來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(hES-ACM)的情況。當(dāng)使用N2培養(yǎng)基時(shí)，在如A板所示的培養(yǎng)容器中稀稀拉拉地顯示出如B板中觀察到的區(qū)域，使用hES-ACM時(shí)，如B板中觀察到的，在培養(yǎng)容器整個(gè)表面都可以看到神經(jīng)元。在圖中，圖解比例尺表示100μm。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式本發(fā)明是基于以下出乎意料的現(xiàn)象通過(guò)培養(yǎng)來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞所制備的條件培養(yǎng)基，可以用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或使胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，以及該培養(yǎng)基維持神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或誘導(dǎo)神經(jīng)分化的能力等于或大于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的能力。
本文使用的“星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞”定義為從胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)的表達(dá)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的細(xì)胞群。另一方面，“原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞”是指表達(dá)GFAP的細(xì)胞群，它是通過(guò)用解離劑如胰蛋白酶處理從活體提取的組織后，解離單個(gè)細(xì)胞獲得的。因此，組成該組織的各種類型細(xì)胞污染于這種原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。
除非另作說(shuō)明，本文使用的“星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”是指上述原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
本發(fā)明的通過(guò)使胚胎干細(xì)胞分化制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在本文中表述為“星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”或“來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”。
有時(shí)，上述“星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”、本發(fā)明的“星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”和本發(fā)明的“來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基”一般稱作“條件培養(yǎng)基”或“本發(fā)明的條件培養(yǎng)基”。
另外，本文使用的術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)細(xì)胞”包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元(神経細(xì)胞(ニュ一ロン))、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)等等。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是指所有支撐神經(jīng)元的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法，其特征在于培養(yǎng)通過(guò)胚胎干細(xì)胞分化所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以簡(jiǎn)單方法穩(wěn)定、大量提供具有高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的有益性質(zhì)的條件培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以以簡(jiǎn)單方法長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定、大量提供具有有益健康地維持神經(jīng)培養(yǎng)的有益性質(zhì)的條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明方法的一個(gè)特征是由胚胎干細(xì)胞分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞在制備該條件培養(yǎng)基中的用途。本發(fā)明方法制備的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力，類似于或大于使用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基的能力。此外，使用本發(fā)明制備的條件培養(yǎng)基，該技術(shù)可以避免使用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能引起的問(wèn)題，即，由于星形膠質(zhì)細(xì)胞所來(lái)源的活體的部分或年齡，不可避免的除星形膠質(zhì)細(xì)胞之外的細(xì)胞污染而引起的培養(yǎng)基性質(zhì)或條件的變異，并且可以制備具有基本上均質(zhì)的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明方法中使用的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞是通過(guò)使在某種條件下具有不確定增殖潛力的胚胎干細(xì)胞分化而制備的，因此具有優(yōu)越的生產(chǎn)能力和質(zhì)量穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的方法允許大量提供穩(wěn)定條件培養(yǎng)基，并且與使用原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的方法相比，在條件培養(yǎng)基的制備中使用更有效。
還有，因?yàn)楸景l(fā)明的方法不使用原代培養(yǎng)的來(lái)源于活體的星形膠質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的方法可以提供基本上不含來(lái)源于除靶動(dòng)物外的動(dòng)物的細(xì)胞成分的、來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法提供的基本上不含非人細(xì)胞成分、來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。因此，例如，使用來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可以用基本上不存在非人細(xì)胞成分的方法從人胚胎干細(xì)胞制備人神經(jīng)細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于制備用于細(xì)胞移植治療的更新再生醫(yī)療用藥物和利用靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞開(kāi)發(fā)新藥。本發(fā)明的方法能夠提供基本上純的靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尤其是人的神經(jīng)培養(yǎng)物，以及長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)純神經(jīng)細(xì)胞。
本發(fā)明方法中，根據(jù)目的不同使用的胚胎干細(xì)胞可以來(lái)源于任何動(dòng)物。具體而言，優(yōu)選使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞。更具體地說(shuō)，哺乳動(dòng)物的實(shí)例可以包括小鼠、大鼠、貂、倉(cāng)鼠、豬、猴(例如狨、恒河猴、獼猴等等)和人。根據(jù)本發(fā)明的方法，為了制備用于制備或維持待用于細(xì)胞移植治療的神經(jīng)元的條件培養(yǎng)基，從組織相容性的角度而言，該方法中使用的胚胎干細(xì)胞可以優(yōu)選來(lái)源于移植受體的細(xì)胞。也就是說(shuō)，當(dāng)為制備或維持用于向人患者移植的神經(jīng)細(xì)胞的目的制備條件培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選在該方法中使用來(lái)源于受體的胚胎干細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中包含下述方法，其包括步驟(A)由胚胎干細(xì)胞制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，和(B)培養(yǎng)由步驟(A)制備的所述星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，以提供培養(yǎng)上清液。
更具體地說(shuō)，所述步驟(A)可以包括但不限于下述步驟1)使用星形膠質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基使胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞，2)使所述神經(jīng)干細(xì)胞增殖，和3)誘導(dǎo)所述增殖的神經(jīng)干細(xì)胞選擇性分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
上述步驟1)中，胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞可以同時(shí)伴有例如在星形膠質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞。任選，上述步驟1)中，包含補(bǔ)充一些因子，如生長(zhǎng)因素和細(xì)胞因子或化學(xué)性質(zhì)上確定的組分的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基可以與所述星形膠質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基或等同于所述星形膠質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基混合。
在本發(fā)明的方法中，一旦建立了來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，通過(guò)培養(yǎng)所述來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞-條件培養(yǎng)基就可以代替星形膠質(zhì)細(xì)胞-條件培養(yǎng)基來(lái)使用。本發(fā)明的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞-條件培養(yǎng)基可以使用如此獲得的本發(fā)明的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞-條件培養(yǎng)基連續(xù)制備。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用步驟1’)替代步驟1)
1′)使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基使胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞。
所述步驟1)和1′)中的分化可以通過(guò)例如，在懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)該細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)。
更具體地說(shuō)，在所述步驟1)或1′)中，在懸液中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的整個(gè)未分化菌落以產(chǎn)生細(xì)胞球(所謂的“神經(jīng)干球”；NSS)，其中優(yōu)選許多神經(jīng)干細(xì)胞位于所述NSS表面上。本文使用的“神經(jīng)干細(xì)胞”是指分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞并且可被鑒定為表達(dá)例如nestin和musashi等神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記，以及例如A2B5等神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞的前體細(xì)胞。
具有以細(xì)胞球(即NSS)不粘附于培養(yǎng)容器底部的方式維持穩(wěn)定連續(xù)懸浮培養(yǎng)物的適當(dāng)形狀和大小的任何培養(yǎng)容器均可以用在這個(gè)步驟中。這種培養(yǎng)容器的實(shí)例包括用于懸浮培養(yǎng)的皿和用于細(xì)菌培養(yǎng)的平皿。任選，所述培養(yǎng)容器可以涂布0.5重量％的瓊脂，防止細(xì)胞球粘附于底部。
懸浮培養(yǎng)的時(shí)間可以根據(jù)胚胎干細(xì)胞的類型決定。例如，可以根據(jù)NSS表面上出現(xiàn)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞的出現(xiàn)決定懸浮培養(yǎng)的時(shí)間?？梢岳绺鶕?jù)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記如nestin和musashi或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體標(biāo)記如A2B5的表達(dá)檢測(cè)所述神經(jīng)干細(xì)胞。此外，可以通過(guò)使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)不成熟神經(jīng)標(biāo)記，如βIII微管蛋白的表達(dá)來(lái)研究在懸浮培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的效力。培養(yǎng)時(shí)間的典型實(shí)例如下對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞，通常1-10天，優(yōu)選大約4天(例如3-5天)，對(duì)于靈長(zhǎng)類動(dòng)物(包括猴、人)胚胎干細(xì)胞，通常1-15天，優(yōu)選大約7天(例如5-8天)。
下一步是神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[步驟2]。在所述步驟2)中，在貼壁培養(yǎng)體系中培養(yǎng)由上述步驟1)制備的神經(jīng)干細(xì)胞本身或包括所述神經(jīng)干細(xì)胞的NSS。實(shí)施所述步驟2)使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。此外，當(dāng)以如上方式培養(yǎng)包括神經(jīng)干細(xì)胞的NSS時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞從所粘附的NSS遷移并圍繞NSS增殖。因此，通過(guò)實(shí)施所述步驟2)使大量神經(jīng)干細(xì)胞增殖，和從而在下列步驟3)中可以制備大量星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
適于在上述步驟2)中的NSS貼壁培養(yǎng)中使神經(jīng)干細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基例如，包括補(bǔ)充B27添加劑[Brewer，G.J.，F(xiàn)ocus，16，6-9(1994)；Brewer，G.J.，J.Neurosci.Res.，35，567-576(1993)][InvitrogenCorporation，Catalog No17504-044]和增殖/生長(zhǎng)因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的DMEM∶F-12(1∶1)和的neurobasalTM培養(yǎng)基(Invitogen Corporation)。具體而言，可以在貼壁培養(yǎng)體系中使用含有B27添加劑、bFGF以及任選EGF的Neurobasal培養(yǎng)基或含有N2添加劑、bFGF以及任選EGF的DMEM∶F-12(1∶1)使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
優(yōu)選地，用于神經(jīng)干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)容器涂布了MatrigelTM(BD Bioscience生產(chǎn))、聚L-賴氨酸、層粘連蛋白等等，以便促進(jìn)NSS或在容器上移動(dòng)和增殖的神經(jīng)干細(xì)胞貼壁，以及維持神經(jīng)干細(xì)胞的條件穩(wěn)定。
當(dāng)使用MatrigelTM時(shí)，可以根據(jù)廠家的指導(dǎo)實(shí)施所述培養(yǎng)容器的涂布。當(dāng)使用另一種胞外基質(zhì)時(shí)，可以用常規(guī)方法施行涂布。例如，含有胞外基層的溶液可以應(yīng)用于容器，以便培養(yǎng)容器底部被很好覆蓋，然后使容器放置一段時(shí)間或在37℃孵育。
在使用所述增殖/生長(zhǎng)因子如bFGF和EGF的情況下，可以根據(jù)胚胎干細(xì)胞的類型等適當(dāng)?shù)貨Q定該因子的濃度。在bFGF的情況下，期望的濃度是1-200ng/ml，優(yōu)選20-40ng/ml。在EGF的情況下，期望的濃度是10-50ng/ml，優(yōu)選10-20ng/ml。可供選擇地，在bFGF和EGF混合使用的情況下，它們可以以10-20ng/ml bFGF和10-20ng/ml EGF混合。
上述貼壁培養(yǎng)的時(shí)間可以根據(jù)胚胎干細(xì)胞所來(lái)源的動(dòng)物種類、分化程度等等來(lái)決定。
在上述步驟2)中，神經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)一步增殖可以通過(guò)以下方法來(lái)完成，從培養(yǎng)容器分離移動(dòng)和增殖的神經(jīng)干細(xì)胞，使用細(xì)胞分散劑，例如酶如胰蛋白酶、分散酶、膠原酶木瓜蛋白酶等等，EDTA或細(xì)胞消化液[Gibco-Invitrogen]逐一解離細(xì)胞，然后在新鮮制備的培養(yǎng)體系中傳代培養(yǎng)解離的細(xì)胞。具體地說(shuō)，例如，可以使用0.05-0.35重量％的胰蛋白酶分離移動(dòng)和分化的神經(jīng)干細(xì)胞并將其逐一解離。由此，可以進(jìn)一步傳代培養(yǎng)和增殖解離細(xì)胞。
在該步驟中，可以任選從培養(yǎng)中除去位于細(xì)胞群中心的未分化胚胎干細(xì)胞，以減少除神經(jīng)干細(xì)胞以外的細(xì)胞，如未分化胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞污染，增加神經(jīng)干細(xì)胞的豐度比。
接下來(lái)是誘導(dǎo)步驟2)中增殖的神經(jīng)干細(xì)胞選擇性分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的步驟[步驟3]。
選擇性分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)條件可以根據(jù)起始胚胎干細(xì)胞的類型確定。例如，可以用不含如bFGF和EGF的增殖/生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基替換所述步驟2)中使用的培養(yǎng)基來(lái)完成。
來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞可以通過(guò)實(shí)施上述步驟(A)的步驟1)-3)被制備成包括表達(dá)GFAP的細(xì)胞的細(xì)胞群。
下一步是培養(yǎng)由步驟(A)制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的步驟，獲得培養(yǎng)上清液[步驟(B)]。
在步驟(B)中，培養(yǎng)來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件沒(méi)有限制，只要所述星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞能夠生存并且各種因子可以從所述星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞釋放即可。當(dāng)制備過(guò)程需要防止來(lái)源于其他動(dòng)物的細(xì)胞成分污染時(shí)，優(yōu)選使用無(wú)血清培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，例如，使用含N2添加劑(×15μg/ml胰島素、10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、63ng/ml孕酮、16.11μg/ml腐胺和2ng/ml亞硒酸鹽)的DMEM∶F-12培養(yǎng)基和在37℃、5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞。
為了將星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的各種因子充分釋放到培養(yǎng)基，步驟(B)的培養(yǎng)時(shí)間可以根據(jù)動(dòng)物種類、細(xì)胞數(shù)量等等決定。通常例如可以是大約1天。
培養(yǎng)后，收獲獲得的培養(yǎng)上清液以得到條件培養(yǎng)基。具體地說(shuō)，離心全部培養(yǎng)物或培養(yǎng)上清液的一部分，然后使它通過(guò)具有適當(dāng)孔徑大小的過(guò)濾器以除去細(xì)胞，可以獲得無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液形式的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
當(dāng)回收全部培養(yǎng)物且除去星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞從而得到條件培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)將步驟(B)使用的培養(yǎng)基和添加劑應(yīng)用于從培養(yǎng)物中除去的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，和重復(fù)相同條件下的一系列步驟，可以重復(fù)制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。可供選擇地，當(dāng)從培養(yǎng)物中回收一部分培養(yǎng)上清液時(shí)，通過(guò)將步驟(B)使用的培養(yǎng)基和添加劑應(yīng)用于培養(yǎng)殘余物，和重復(fù)相同條件下的一系列步驟，可以重復(fù)制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法還包括如上所述的具體實(shí)施方案。
本發(fā)明方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基可有效用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。此外，本發(fā)明方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定、健康地維持神經(jīng)培養(yǎng)物。
本發(fā)明方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以通過(guò)測(cè)定維持神經(jīng)培養(yǎng)物的能力和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力來(lái)評(píng)價(jià)。
所述維持培養(yǎng)神經(jīng)培養(yǎng)物的能力可以例如通過(guò)培養(yǎng)從活體獲得的原代神經(jīng)元或從胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)元，然后隨著時(shí)間的推移或每隔一定間隔分析所培養(yǎng)神經(jīng)元的情況(例如存活率和形態(tài))來(lái)研究。所述神經(jīng)培養(yǎng)物可以在例如Neuroscience labomanual″The method forneuronal cell culture″，editorial supervisorHachiro Nakagawa，editorHiroshi Hatanaka，publisher，Springer-Verlag Tokyo，page 347(35)(1997.4.24)描述的條件下制備。
為了評(píng)價(jià)維持神經(jīng)培養(yǎng)物的能力，可以在適當(dāng)條件下在待評(píng)價(jià)的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元。根據(jù)細(xì)胞體、樹(shù)突、軸突、生長(zhǎng)錐等等的存在或不存在評(píng)價(jià)神經(jīng)元的形態(tài)。此外，例如，使用免疫組織化學(xué)的探測(cè)來(lái)研究包括神經(jīng)遞質(zhì)的受體、神經(jīng)絲、酪氨酸羥化酶、谷氨酸脫羧酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記表達(dá)。如果檢測(cè)到那些標(biāo)記的表達(dá)和觀察到特定形態(tài)，則可以將所述條件培養(yǎng)基評(píng)價(jià)為能夠維持健康神經(jīng)元的培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明的方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基是從胚胎干細(xì)胞分化所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的培養(yǎng)上清液獲得的，因此，與原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相比，質(zhì)量可能更穩(wěn)定。此外，通過(guò)使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基連同胚胎干細(xì)胞，可以以基本上沒(méi)有來(lái)自非靶動(dòng)物的成分污染的方法制備神經(jīng)細(xì)胞。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可以提供基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的仍是高質(zhì)量的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)。由此提供的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物可以用于藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中的篩選或細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。此外，它還可以用于制備再生治療中用于移植的高度相容細(xì)胞。
此外，使用本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可以將胚胎干細(xì)胞高效分化為神經(jīng)細(xì)胞。它還可以長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定、健康的神經(jīng)培養(yǎng)物。
本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以含有添加劑，包括N2添加劑[胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鹽、孕酮；參見(jiàn)例如Bottenstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，76514(1979)]、白蛋白、上述抗氧化劑等等。本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中所含添加劑的量可以根據(jù)使用目的、待培養(yǎng)的細(xì)胞類型如胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞，以及獲得細(xì)胞的動(dòng)物種類來(lái)決定。上述N2添加劑中所含成分的濃度可以是，但不限于胰島素終濃度1-100μg/ml，優(yōu)選3-20μg/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白終濃度1-100μg/ml，優(yōu)選3-20μg/ml，亞硒酸鹽終濃度1-100nM，優(yōu)選3-50nM，孕酮終濃度1-100nM，優(yōu)選20nM。
本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基還可以含有適于細(xì)胞培養(yǎng)的一些因子，并且可根據(jù)使用目的、待培養(yǎng)的細(xì)胞類型、獲得細(xì)胞的動(dòng)物種類等誘導(dǎo)所期望的分化。
此外，為了長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞的穩(wěn)定培養(yǎng)，以及誘導(dǎo)高效分化，所述本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以包含用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等細(xì)胞的常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基之間的比例可以根據(jù)使用目的、待培養(yǎng)的細(xì)胞類型、獲得所述細(xì)胞的動(dòng)物種類來(lái)決定。
來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以以冰凍或冷藏保存。為了長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，優(yōu)選將其在-10℃--80℃冰凍保存。當(dāng)冰凍保存本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)避免反復(fù)凍融，以防止負(fù)責(zé)所述培養(yǎng)基功能的各種蛋白因子的活性降低。此外，還優(yōu)選在冰箱中4-8℃保存培養(yǎng)基。
本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以單獨(dú)使用或作為試劑盒提供，該試劑盒包括該培養(yǎng)基，和例如，用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或各動(dòng)物種類細(xì)胞的合適因子或試劑、用于誘導(dǎo)細(xì)胞分化的合適因子或試劑、涂有細(xì)胞粘附分子的培養(yǎng)容器、適于懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)容器等等。
可以使用從本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中鑒定和分離的各種功能活性物質(zhì)(下文稱作“功能成分”)制備與本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有類似效果的培養(yǎng)基，以致該培養(yǎng)基含有有效量的功能成分。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括通過(guò)混合功能成分制備與本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相比，具有類似的培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力的功能培養(yǎng)基。在該方法中，可以逐一提供功能成分并在使用前逐一混合。本發(fā)明包括混合所述功能成分所制備的培養(yǎng)基。此外，所述功能成分包括單獨(dú)具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力的成分。功能成分的這種單獨(dú)用途也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。所述功能成分可以單獨(dú)或以它們中的至少2類的組合作為能夠培養(yǎng)和/或維持神經(jīng)細(xì)胞和/或誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的試劑提供。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，其特征在于使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。具體地說(shuō)，在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元。本發(fā)明的培養(yǎng)神經(jīng)元的方法可以維持基本上不含非來(lái)源于靶動(dòng)物成分的成分的穩(wěn)定、健康的神經(jīng)培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，用作神經(jīng)元來(lái)源的動(dòng)物種類可以包括但不限于哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、貂、倉(cāng)鼠、豬、狗、綿羊、山羊、猴和人。
根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，在所產(chǎn)生的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物用于細(xì)胞移植治療的情況下，考慮到好的相容性，優(yōu)選從來(lái)源于與待治療動(dòng)物相同物種的胚胎干細(xì)胞制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以應(yīng)用于培養(yǎng)神經(jīng)元的任何方法。
可以在神經(jīng)元培養(yǎng)的合適條件下，在本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元。除使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基之外的培養(yǎng)條件沒(méi)有特別的限制，可以在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下，以含1×N2添加劑[5μg/ml胰島素、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、63ng/ml孕酮、16.11μg/ml腐胺和2ng/ml亞硒酸鹽]的DMEM∶F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞所得的培養(yǎng)上清液，或在補(bǔ)充1×N2添加劑的本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，于大約37℃(例如37±0.2℃)和大約5％CO2包被聚L-賴氨酸、層粘連蛋白等等的培養(yǎng)容器中實(shí)施培養(yǎng)。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于使用本發(fā)明方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞例如是在本發(fā)明方法制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下誘導(dǎo)的。根據(jù)本發(fā)明的分化方法，可以制備不含來(lái)源于除靶動(dòng)物外的動(dòng)物種類的成分的神經(jīng)細(xì)胞。也就是說(shuō)，在制備本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，使用來(lái)源于與待培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞相同動(dòng)物種類的胚胎干細(xì)胞。因此，優(yōu)選由本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法制備的神經(jīng)細(xì)胞可以用于細(xì)胞移植治療。此外，本發(fā)明的誘導(dǎo)分化的方法在制備基本上不含非人成分，適于臨床應(yīng)用于人患者，用作如神經(jīng)細(xì)胞移植治療的神經(jīng)細(xì)胞具有優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法中使用的胚胎干細(xì)胞可以根據(jù)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞的使用目的方便地選擇。用作本發(fā)明誘導(dǎo)分化方法中所用胚胎干細(xì)胞的來(lái)源的動(dòng)物種類可以包括但不限于例如哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、貂、倉(cāng)鼠、豬、狗、綿羊、山羊、猴、人等等。
本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法可以根據(jù)上述制備條件培養(yǎng)基的方法的步驟(A)的步驟1′實(shí)施。
通過(guò)檢測(cè)分化為神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的能力、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)可以評(píng)價(jià)所制備的神經(jīng)干細(xì)胞。
根據(jù)本方法，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元可以如下完成在來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中實(shí)施胚胎干細(xì)胞菌落的懸浮培養(yǎng)，以得到包含核心(中心)的未分化胚胎干細(xì)胞層和表面上的許多神經(jīng)干細(xì)胞層的細(xì)胞球(NSS)；在本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下實(shí)施所述制備的NSS的貼壁培養(yǎng)；在本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下實(shí)施所述神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^(guò)神經(jīng)元標(biāo)記如神經(jīng)絲、酪氨酸羥化酶、谷氨酸脫羧酶和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)鑒定所制備神經(jīng)元。在該方法中可以使用的培養(yǎng)基，如本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，和所述條件培養(yǎng)基可以與任何一種培養(yǎng)基，如DMEM∶F-12、DMEM、F-12、MEM、NeurobasalTM等等混合，或補(bǔ)充更多的添加劑?？梢栽诩s5％CO2，如4.8-5.2％，100％濕度的空氣，約37℃，如37±0.2℃下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間可以根據(jù)胚胎干細(xì)胞所來(lái)源的動(dòng)物種類決定，在小鼠的情況下，期望它可以是1-7天，和在猴的情況下，是1-14天。
制備的細(xì)胞是否是神經(jīng)元可以通過(guò)研究例如細(xì)胞的形態(tài)特征，包括細(xì)胞體、樹(shù)突、軸突、生長(zhǎng)錐等等所證實(shí)。此外，可以通過(guò)研究標(biāo)記如神經(jīng)絲、酪氨酸羥化酶、谷氨酸脫羧酶、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶等等或其編碼基因的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)所制備的神經(jīng)元。
根據(jù)本發(fā)明方法誘導(dǎo)從胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)貼壁培養(yǎng)上述NSS或神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)完成?？梢杂糜谡麄€(gè)方法的培養(yǎng)基包括但不限于DMEM∶F-12+N2添加劑(N2培養(yǎng)基)等等。培養(yǎng)時(shí)間可以根據(jù)胚胎干細(xì)胞的類型決定，在小鼠胚胎干細(xì)胞的情況下，可以是1-4天，和在猴胚胎干細(xì)胞的情況下，可以是1-4天。此外，所制備的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)研究形態(tài)特征或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記如星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)來(lái)鑒定。
本發(fā)明誘導(dǎo)分化方法所制備的神經(jīng)細(xì)胞可以在不存在來(lái)自非靶動(dòng)物的任何成分的情況下制備，例如不存在非人成分。因此，所述基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的神經(jīng)細(xì)胞可以有效用于細(xì)胞移植治療。此外，根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)分化方法，使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基制備神經(jīng)細(xì)胞。使用來(lái)源于所述動(dòng)物例如人的胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的分化，可以提供與動(dòng)物活體具有高相容性和基本上不含來(lái)自非靶動(dòng)物的成分的神經(jīng)細(xì)胞。因此，本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞可以用于對(duì)靶動(dòng)物有用的藥物開(kāi)發(fā)的試驗(yàn)體系。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞可以應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的再生治療，對(duì)象是由神經(jīng)退行性變或神經(jīng)損害引起的疾病或病情，例如神經(jīng)退行性病變包括帕金森氏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化；腦缺血、脫髓鞘疾病、顱腦損傷、脊髓損傷、中風(fēng)等等；在再生治療中，將本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)入觀察到的神經(jīng)退行性變區(qū)域或神經(jīng)損害區(qū)域。這種神經(jīng)細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。
實(shí)施例現(xiàn)在參考下列實(shí)施例，其具體說(shuō)明本發(fā)明，但下列實(shí)施例決不限制本發(fā)明。在下列實(shí)施例中，“％”是指重量％，除非另作說(shuō)明，而有關(guān)CO2的“％”是指體積％。
實(shí)施例1小鼠胚胎干細(xì)胞系，以通常的方式培養(yǎng)129SV細(xì)胞并在細(xì)胞接種3天后，使用毛細(xì)管物理挑取細(xì)胞的整個(gè)菌落。所產(chǎn)生的菌落在懸液中、37℃、5％CO2、使用誘導(dǎo)神經(jīng)分化的培養(yǎng)基(其被用作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的替代品；產(chǎn)品編號(hào)MB-X9501、Sumitomo BakeliteCo.，Ltd.)培養(yǎng)4天。制備了神經(jīng)干球(NSS)，其包括3層中心的未分化胚胎干細(xì)胞層；表面的神經(jīng)干細(xì)胞層和兩層之間的夾層。
然后，所述NSS鋪在涂有聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上并使用含1×B27添加劑[目錄號(hào)17504-044，Invitrogen Corporation；由市場(chǎng)上可買到的X50產(chǎn)品調(diào)劑的]的NeurobasalTM培養(yǎng)基[目錄號(hào)21103-049，Invitrogen Corporation]，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)，每天不斷增加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)至終濃度20ng/ml以使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。上述涂有聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿是用10μg/ml層粘連蛋白[目錄號(hào)L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市場(chǎng)上可買到的涂有聚L-賴氨酸的皿3小時(shí)所制備的。
培養(yǎng)7天后，使用毛細(xì)吸管物理移除增殖細(xì)胞中心的未分化細(xì)胞以便增加移動(dòng)和增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的豐度比，然后，培養(yǎng)物在37℃、5％CO2再孵育7天以使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
此后，棄去培養(yǎng)基并用不含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，以便誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞選擇性分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，之后使用0.05重量％的胰蛋白酶-EDTA解離增殖細(xì)胞。所述解離細(xì)胞在含N2添加劑[5μg/ml胰島素、100μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.3ng/ml孕酮、16.11μg/ml腐胺、5.2ng/ml亞硒酸鹽，目錄號(hào)17502-048，Invitrogen Corporation]的DMEM∶F-12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
培養(yǎng)3天后，從所產(chǎn)生的培養(yǎng)物中除去上清液，通過(guò)22nm過(guò)濾器[商品名DISMIC-25CS，Advantech Co.，Ltd.]過(guò)濾，以提供來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。向制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中補(bǔ)充1％終濃度(由上述的100×的N2添加物配制)的N2添加劑，用于營(yíng)養(yǎng)。
實(shí)施例2為了制備用于研究培養(yǎng)神經(jīng)元的能力的神經(jīng)元，在室溫下凍融冰凍的小鼠胎兒皮質(zhì)[神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)商品名[Sumitomo Bakelite制造]SHINKEISAIBOU CX(M)[目錄號(hào)MB-X0305]]于細(xì)胞分散液[[目錄號(hào)MB-X9901]包含在神經(jīng)元培養(yǎng)系統(tǒng)[Sumitomo Bakelite制造]中分散]，以提供含來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代神經(jīng)元的懸液。
然后，所述含來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代神經(jīng)元的懸液在300rpm離心1分鐘，使用himac CF702[Hitachi制造]洗滌原代神經(jīng)元。接著，來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代神經(jīng)元以1×105個(gè)細(xì)胞/ml懸浮于根據(jù)上述實(shí)施例1制備的來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，并以0.5ml/孔將細(xì)胞鋪在聚L-賴氨酸包被的24孔板[SumitomoBakelite Corporation制造]上，37℃、5％CO2下培養(yǎng)。每2天用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。對(duì)于對(duì)照，以與使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相同的方式，在N2培養(yǎng)基中培養(yǎng)來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代神經(jīng)元。圖1示出培養(yǎng)2天后細(xì)胞的形態(tài)。在圖1中，A和B板表明了使用N2培養(yǎng)基的情況，和C和D板表明了使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況。
如圖1的C和D板所示，在使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況下，觀察到神經(jīng)突的很好貼壁和延伸。另一方面，如A和B板所示，在使用N2培養(yǎng)基的情況下，觀察到神經(jīng)突的細(xì)胞貼壁不足且貼壁細(xì)胞很少延伸。
在培養(yǎng)第4天，從培養(yǎng)物中除去培養(yǎng)基。向培養(yǎng)細(xì)胞中添加4重量％的仲甲醛和細(xì)胞在室溫下孵育5分鐘。然后，向產(chǎn)生的混合物中添加1ml的0.1％TritonTM-X，混合物再孵育5分鐘。向產(chǎn)生的混合物中添加1重量％的正常山羊血清，混合物在室溫下再孵育30分鐘進(jìn)行封閉。
向封閉細(xì)胞中添加用1重量％的正常山羊血清稀釋的抗GFAP抗體[目錄號(hào)AB5804，CHEMICON]和抗MAP2抗體[目錄號(hào)442695，CALBIOCHEM]，混合物在4℃的孵育過(guò)夜以進(jìn)行反應(yīng)。然后，用無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，向細(xì)胞中添加二抗[商品名Alexa Fluor 488；Molecular Probe]并在室溫下孵育30分鐘以進(jìn)行反應(yīng)。接著，根據(jù)所述二抗的熒光分別檢測(cè)細(xì)胞中膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)和MAP2的表達(dá)。圖2提供了免疫染色結(jié)果。在該圖中，A板顯示了使用N2培養(yǎng)基的情況，和B板顯示了使用來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況。
如圖2所示，在使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況下，觀察到MAP2的高表達(dá)，而在細(xì)胞中幾乎觀察不到GFAP的表達(dá)。該結(jié)果表明使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，僅神經(jīng)元細(xì)胞很好增殖。另一方面，如圖2的A板所示，使用N2培養(yǎng)基的培養(yǎng)物既不產(chǎn)生GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，也不產(chǎn)生MAP2陽(yáng)性細(xì)胞。
此外，在培養(yǎng)第2天，用含1×B-27添加劑[Invitrogen Corporation]的NeurobasalTM培養(yǎng)基替換上述實(shí)施例1制備的一些培養(yǎng)物中的條件培養(yǎng)基，細(xì)胞在37℃、5％CO2再孵育10天以評(píng)價(jià)來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的效果。
該結(jié)果表明從培養(yǎng)開(kāi)始使用N2培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞在第5天死亡。
圖3顯示了使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和含B-27添加劑的NeurobasalTM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)第8天的情況，和圖4顯示了其第10天的情況。在每個(gè)圖中，A和B板顯示了在補(bǔ)充B-27添加劑的NeurobasalTM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，和C和D板顯示了在來(lái)源于小鼠胚胎干細(xì)胞的星形樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。
如每個(gè)圖C和D的C和D板所示，在第10天，源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在神經(jīng)元之間保持著密集的網(wǎng)絡(luò)。
另一方面，使用含B-27添加劑的NeurobasalTM培養(yǎng)基培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞從第7天開(kāi)始死亡，和如圖3的A和B板所示，大多數(shù)細(xì)胞在第8天死亡，如圖4的A和B板所示，所有細(xì)胞在第10天死亡。
這些結(jié)果表明使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，神經(jīng)元，如原代神經(jīng)元可以在體外長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定維持。過(guò)去，難以以健康的狀況長(zhǎng)時(shí)間維持神經(jīng)元。
實(shí)施例3如下研究上述實(shí)施例制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力。
使用常規(guī)方法培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞系129SV細(xì)胞3天，以便形成大且成熟菌落。使用毛細(xì)吸管挑取細(xì)胞菌落，和在37℃、5％CO2下，分別在上述實(shí)施例1制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和作為對(duì)照的N2培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4天。
此后，所產(chǎn)生的菌落在包被聚L-賴氨酸的皿(Asahi Techno GlassCorporation)上，37℃、5％CO2培養(yǎng)7天，使用各自培養(yǎng)基，以便菌落分化為神經(jīng)細(xì)胞。
用抗IIIβ微管蛋白(TuJ)抗體免疫染色研究所產(chǎn)生的細(xì)胞群中βIII類微管蛋白的表達(dá)，以研究從小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的程度(即神經(jīng)分化菌落的數(shù)量)。
結(jié)果如表1所示。在該表中，ESACM表示來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，N2表示N2培養(yǎng)基。在該表中，括號(hào)中的數(shù)值表示根據(jù)公式(陽(yáng)性菌落的總數(shù)/挑取菌落的數(shù)量)×100(％)計(jì)算的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的比例。


如表1所示，在使用根據(jù)實(shí)施例1制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的情況下，陽(yáng)性菌落的比例是51％。清楚地表明所述星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有足夠的能力誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。
此外，使用根據(jù)上述實(shí)施例1制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基分化的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力通過(guò)以下方法測(cè)定，即在37℃、5％CO2下在NeurobasalTM培養(yǎng)基[InvitrogenCorporation]中培養(yǎng)該細(xì)胞，并在顯微鏡[Nikon Corporation，商品名ECLIPSE TE2000-U]下觀察所產(chǎn)生的細(xì)胞。
該結(jié)果表明使用根據(jù)實(shí)施例1的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基而分化的神經(jīng)干細(xì)胞具有良好增殖能力。
此外，在使用根據(jù)實(shí)施例1的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)所述增殖的神經(jīng)干細(xì)胞7天后，細(xì)胞用MAP2免疫染色和顯微鏡觀察，以研究細(xì)胞分化為神經(jīng)元的程度。
該結(jié)果表明所述增殖細(xì)胞分化為具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞并且大多數(shù)細(xì)胞是MAP2陽(yáng)性的。因此，提示使用根據(jù)實(shí)施例1制備的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基而獲得的神經(jīng)干細(xì)胞具有增殖和分化的潛力。
使用來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，在適于猴細(xì)胞的條件下，用與實(shí)施例2所述相同方法，將猴胚胎干細(xì)胞系CMK6細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。表2顯示了結(jié)果。在該表中，ESACM表示來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基和N2表示N2培養(yǎng)基。


如表2所示，該結(jié)果清楚地表明來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有足夠的能力誘導(dǎo)猴胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。此外，用與小鼠胚胎干細(xì)胞相同的方法研究獲得的細(xì)胞的增殖潛力并證實(shí)制備的猴神經(jīng)干細(xì)胞具有良好的增殖潛力。
實(shí)施例4使用常規(guī)方法培養(yǎng)獼猴ES細(xì)胞系CMK6細(xì)胞，在細(xì)胞接種后3天，使用毛細(xì)管物理挑取細(xì)胞的菌落。所產(chǎn)生的菌落使用含20ng/mlbFGF的用于神經(jīng)元培養(yǎng)的培養(yǎng)基(Sumitomo Bakelite目錄號(hào)MB-X9501，用作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的條件培養(yǎng)基的替代培養(yǎng)基)，在37℃、5％CO2下，懸液中培養(yǎng)10天以制備神經(jīng)干球(NSS)。在懸浮培養(yǎng)10天的過(guò)程中，每天向所述懸浮培養(yǎng)物中添加終濃度20ng/ml的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。
然后，所述NSS鋪在聚L-賴氨酸/層粘連蛋白包被的皿上，使用含1×B27添加劑[目錄號(hào)17504-044，Invitrogen Corporation，由市場(chǎng)上可買到的×50產(chǎn)品調(diào)劑]的NeurobasalTM培養(yǎng)基[目錄號(hào)21103-049，Invitrogen Corporation制造]培養(yǎng)，和在37℃、5％CO2下貼壁培養(yǎng)7天，每天添加終濃度20ng/ml的bFGF和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)以使神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
上述包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿是用10μg/ml層粘連蛋白[目錄號(hào)L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市場(chǎng)上可買到的涂有聚L-賴氨酸的皿[IWAKI，Asahi Techno Glass Corporation]3小時(shí)所制備的。
培養(yǎng)7天后，使用毛細(xì)管將增殖細(xì)胞的中心部分物理轉(zhuǎn)移到包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上，然后，使用含×1G-5添加劑的[目錄號(hào)17503-012，Invitrogen Corporation；×100產(chǎn)品]Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)[目錄號(hào)11960-069，Invitrogen Corporation](以下簡(jiǎn)稱為G-5培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在37℃、5％CO2下繼續(xù)培養(yǎng)7天。在上述培養(yǎng)過(guò)程中，每天添加終濃度20ng/ml的bFGF和EGF。
在培養(yǎng)7天時(shí)，使用毛細(xì)管物理移除增殖細(xì)胞的中心部分，剩余細(xì)胞再培養(yǎng)7天。
然后，棄去G-5培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，接著用0.05重量％的胰蛋白酶/EDTA解離所述細(xì)胞。使用G-5培養(yǎng)基再次在包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上培養(yǎng)所產(chǎn)生的解離細(xì)胞(增殖的神經(jīng)干細(xì)胞)10天，以誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
圖5示出用抗GFAP抗體[目錄號(hào)AB5804，CHEMICONCorporation]和抗MAP2抗體[目錄號(hào)442695，CALBIOCHEMCorporation]以常規(guī)方式對(duì)上述方法制備的來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物免疫染色的結(jié)果。在該圖中，A板顯示了GFAP的表達(dá)，B板顯示了MAP2的表達(dá)，C板顯示了A和B板的融合圖像。
培養(yǎng)容器中的大多數(shù)細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)，容器中幾乎沒(méi)有MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元。因此，該結(jié)果顯示制備了高純度和同源的猴星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
然后，用N2培養(yǎng)基(即補(bǔ)充了1×N2添加劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)替換該培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。2-4天后，從培養(yǎng)物中回收上清液，和用22nm過(guò)濾器[商品名DISMIC-25CS，ADVANTEC]過(guò)濾上清液以獲得來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
然后，向所述來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中補(bǔ)充分別得到×1濃度的量的N2添加劑[目錄號(hào)17502-048，Invitrogen Corporation；×100產(chǎn)品]或B-27添加劑[目錄號(hào)17504-044，Invitrogen Corporation；×50產(chǎn)品]，研究該培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)元的能力。
實(shí)施例5研究根據(jù)實(shí)施例4制備的來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)CMK6-G4細(xì)胞系(穩(wěn)定表達(dá)hrGFP基因的細(xì)胞系)分化為神經(jīng)元的能力。
使用常規(guī)方法培養(yǎng)CMK6-G4細(xì)胞系，在細(xì)胞接種后3天，使用毛細(xì)管物理挑取細(xì)胞菌落。獲得的菌落在37℃、5％CO2下，使用含20ng/ml bFGF的來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(根據(jù)實(shí)施例4制備的)懸浮培養(yǎng)10天，以得到神經(jīng)干球(NSS)。在懸浮培養(yǎng)10天的過(guò)程中，每天向該懸浮培養(yǎng)物中添加終濃度20ng/ml的bFGF。
然后，獲得的NSS鋪在包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上并使用相同的來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，和在37℃、5％CO2貼壁培養(yǎng)14天，以誘導(dǎo)NSS分化為神經(jīng)細(xì)胞。在顯微鏡下觀察到許多神經(jīng)突。
為證實(shí)猴胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，分別用抗βIII微管蛋白(Tuj)抗體[目錄號(hào)MAB1637，CHEMICON Corporation]和抗MAP2抗體[目錄號(hào)442695，CALBIOCHEM Corporation]以常規(guī)方式免疫染色該細(xì)胞，評(píng)價(jià)所制備細(xì)胞群中III類β微管蛋白和MAP2的表達(dá)。結(jié)果如圖6所示。
如圖6所示，可見(jiàn)當(dāng)使用來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，許多細(xì)表達(dá)βIII微管蛋白或MAP2的胞(神經(jīng)元)被誘導(dǎo)。
這些結(jié)果表明來(lái)源于猴胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有誘導(dǎo)猴胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的能力，并且也具有高效誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力。
另一方面，在對(duì)照組中，在N2培養(yǎng)基(即用于制備條件培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和B27培養(yǎng)基(即含B-27添加劑的NeurobasalTM培養(yǎng)基)用在培養(yǎng)基中時(shí)，可能由于自發(fā)分化，觀察到僅有少許神經(jīng)元，并且沒(méi)有鑒定到實(shí)質(zhì)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6以常規(guī)方式培養(yǎng)人ES細(xì)胞系SA181細(xì)胞，在細(xì)胞接種后3天，在毛細(xì)管物理挑取細(xì)胞菌落。獲得的菌落在37℃、5％CO2下懸浮培養(yǎng)12天，使用用于神經(jīng)元培養(yǎng)的含20ng/ml bFGF的培養(yǎng)基[SumitomoBakelite Co.，Ltd.目錄號(hào)MB-X9501，用作原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的替代培養(yǎng)基]以制備神經(jīng)干球(NSS)。在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，每天向該懸浮培養(yǎng)物中添加終濃度20ng/ml的bFGF。
然后，所述NSS鋪在包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上并使用含1×B-27添加劑[目錄號(hào)17504-044，Invitrogen Corporation，從市場(chǎng)上可買到的×50產(chǎn)品調(diào)劑]的NeurobasalTM培養(yǎng)基[目錄號(hào)21103-049，Invitrogen Corporation]培養(yǎng)，和在37℃、5％CO2下貼壁培養(yǎng)7天，分別添加終濃度20ng/ml的bFGF和EGF，以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。
此外，上述涂有聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿是用10μg/ml層粘連蛋白[目錄號(hào)L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市場(chǎng)上可買到的涂有聚L-賴氨酸的皿[IWAKI，Asahi Techno GlassCorporation]3小時(shí)所制備的。
培養(yǎng)7天后，使用毛細(xì)管將增殖細(xì)胞的中心部分物理轉(zhuǎn)移到包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上，然后，使用含×1G-5添加劑的[目錄號(hào)17503-012，Invitrogen Corporation；×100產(chǎn)品]Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)[目錄號(hào)11960-069，Invitrogen Corporation](以下簡(jiǎn)稱為G-5培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。在37℃、5％CO2下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞7天。在上述培養(yǎng)過(guò)程中，每天添加終濃度20ng/ml的bFGF和EGF。
在培養(yǎng)7天時(shí)，使用毛細(xì)管物理移動(dòng)增殖細(xì)胞的中心部分，剩余細(xì)胞再培養(yǎng)7天。
然后，棄去G-5培養(yǎng)基，用無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌細(xì)胞，接著用0.05重量％的胰蛋白酶/EDTA解離所述細(xì)胞。使用G-5培養(yǎng)基再次在包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上培養(yǎng)所產(chǎn)生的解離細(xì)胞(增殖的神經(jīng)干細(xì)胞)14天，以誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
圖7示出用抗GFAP抗體和抗MAP2抗體對(duì)上述方法制備的來(lái)源于人的胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物免疫染色的結(jié)果。
如圖7所示，培養(yǎng)容器中的大多數(shù)細(xì)胞是星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性)，容器中幾乎沒(méi)有MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元。因此，該結(jié)果顯示制備了高純度和同源的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
然后，用N2培養(yǎng)基(即補(bǔ)充×1 N2添加劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基)替換該培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。2-4天后，從培養(yǎng)物中回收上清液，和用22nm過(guò)濾器[商品名DISMIC-25CS，ADVANTEC]過(guò)濾上清液以獲得來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
然后，向所述來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中補(bǔ)充×1 N2添加劑[目錄號(hào)17502-048，InvitrogenCorporation；×100產(chǎn)品]或B-27添加劑[目錄號(hào)17504-044，InvitrogenCorporation；×50產(chǎn)品]。
實(shí)施例7評(píng)價(jià)根據(jù)實(shí)施例6制備的來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)SA181hrG2細(xì)胞系(穩(wěn)定表達(dá)hrGFP基因的細(xì)胞系；其被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生綠色熒光以促進(jìn)鑒定細(xì)胞的)分化為神經(jīng)元的能力。
以常規(guī)方式培養(yǎng)SA181hrG2細(xì)胞系，在細(xì)胞接種后3天，在毛細(xì)管物理挑取細(xì)胞菌落。獲得的菌落在37℃、5％CO2下懸浮培養(yǎng)12天，使用含20ng/ml bFGF的來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(根據(jù)實(shí)施例6制備的)以制備神經(jīng)干球(NSS)。在懸浮培養(yǎng)12天過(guò)程中，每天向該懸浮培養(yǎng)物中添加濃度達(dá)20ng/ml的bFGF。
然后，所述NSS鋪在包被聚L-賴氨酸/層粘連蛋白的皿上并使用上述來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5％CO2下貼壁培養(yǎng)14天，以誘導(dǎo)NSS分化為神經(jīng)細(xì)胞。在獲得的培養(yǎng)物中，顯微鏡下觀察到很多神經(jīng)突。
為證實(shí)是否人胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，分別用抗βIII微管蛋白(Tuj)抗體[目錄號(hào)MAB1637，CHEMICON Corporation]和抗MAP2抗體[目錄號(hào)442695，CALBIOCHEM Corporation]以常規(guī)方式免疫染色所得細(xì)胞，評(píng)價(jià)所制備細(xì)胞群中III類β微管蛋白和MAP2的表達(dá)。圖8顯示了結(jié)果。
如圖8所示當(dāng)使用來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，許多神經(jīng)元(即表達(dá)βIII微管蛋白或MAP2的細(xì)胞)被誘導(dǎo)。
這些結(jié)果表明來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的能力，并且也具有高效誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力。
另一方面，在對(duì)照組中，在N2培養(yǎng)基(即用于制備條件培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)和B27培養(yǎng)基(即含B-27添加劑的NeurobasalTM培養(yǎng)基)用在培養(yǎng)基中時(shí)，可能由于自發(fā)分化，觀察到僅有少許神經(jīng)元，并且沒(méi)有鑒定到實(shí)質(zhì)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。
此外，當(dāng)使用根據(jù)實(shí)施例6制備的來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)源自各種來(lái)源的神經(jīng)元培養(yǎng)物，包括來(lái)源于小鼠胎兒皮質(zhì)的原代培養(yǎng)神經(jīng)元[目錄號(hào)MB-X0305SHINKEISAIBOU CX(M)，Sumitomo Bakelite Co.，Ltd]時(shí)，維持了人正常神經(jīng)前體細(xì)胞[產(chǎn)品編號(hào)PT-2599 Cambrex Corporation]，和來(lái)源于人胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)元、神經(jīng)元細(xì)胞，并且在顯微鏡下觀察到很多神經(jīng)突。上述結(jié)果類似于實(shí)施例2中所示的結(jié)果。
圖9顯示關(guān)于人神經(jīng)前體細(xì)胞的結(jié)果。當(dāng)使用N2培養(yǎng)基(即用于制備條件培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基)培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)容器中稀稀拉拉地可見(jiàn)如A板中所示的區(qū)域。另一方面，當(dāng)使用hES-ACM時(shí)，在培養(yǎng)容器整個(gè)區(qū)域都可以發(fā)現(xiàn)很多神經(jīng)元，因此可以理解hES-ACM具有極好的培養(yǎng)神經(jīng)元的能力。
實(shí)施例8使用小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系KT-5細(xì)胞(GFAP陽(yáng)性；人類科學(xué)研究資料庫(kù)的資源號(hào)IFO50161)，用與上述方法類似的方法制備條件培養(yǎng)基。研究所述條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為神經(jīng)元和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)元的能力。
使用含10％胎牛血清的Nutrient Mixture F-12 HAM培養(yǎng)基(目錄號(hào)N8641；SIGMA Co制造)以常規(guī)方式傳代培養(yǎng)小鼠KT-5細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到70％融合時(shí)，用含×1 N2添加劑的DMEM/F-12培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基。再培養(yǎng)2-4天后，從培養(yǎng)物中回收上清液，并用22nm過(guò)濾器[商品名DISMIC-25CS，ADVANTEC]過(guò)濾以提供小鼠KT-5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
然后，向所述條件培養(yǎng)基補(bǔ)充×1 N2添加劑[目錄號(hào)17502-048，Invitrogen Corporation；×100產(chǎn)品]或×1B-27添加劑[目錄號(hào)17504-044，Invitrogen Corporation；×50產(chǎn)品]，并研究誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定體外培養(yǎng)神經(jīng)元的能力。
然而，據(jù)發(fā)現(xiàn)KT-5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基既不能長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)元，又不能高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。
這個(gè)結(jié)果給了我們一個(gè)實(shí)例，該實(shí)例表明不能保證每個(gè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞(即星形膠質(zhì)細(xì)胞)的每種條件培養(yǎng)基都可以用于長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)元或誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞(即通過(guò)培養(yǎng)一種類型的星形膠質(zhì)細(xì)胞所制備的條件培養(yǎng)基不一定具有與來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有相同的能力)。
上述實(shí)施例清楚表明本發(fā)明的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有維持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的神經(jīng)元培養(yǎng)和誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞等等的用途。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以穩(wěn)定和輕易地提供大量星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。該條件培養(yǎng)基能夠穩(wěn)定制備神經(jīng)細(xì)胞、工業(yè)制備神經(jīng)細(xì)胞；長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)元；高效誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞；工業(yè)規(guī)模提供通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞而制備的神經(jīng)細(xì)胞等等。因此，本發(fā)明使輕易提供大量高質(zhì)量神經(jīng)細(xì)胞成為可能。此外，因?yàn)楸景l(fā)明可以在基本上不存在來(lái)自非靶動(dòng)物的任何細(xì)胞成分條件下維持或制備神經(jīng)細(xì)胞，所以本發(fā)明能夠提供與活體具有高相容性的適于移植治療等等的材料。
權(quán)利要求
1.一種制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法，其中的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞來(lái)源于胚胎干細(xì)胞，其特征在于培養(yǎng)通過(guò)胚胎干細(xì)胞分化所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，包括步驟(A)由胚胎干細(xì)胞制備星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，和(B)培養(yǎng)所述步驟(A)所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，以得到培養(yǎng)上清液。
6.權(quán)利要求5的方法，在該方法的步驟(A)中，通過(guò)使用星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基、初步制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或初步制備的功能上等同于所述星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基來(lái)使胚胎干細(xì)胞分化。
7.一種來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，它是由權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法制備的。
8.一種培養(yǎng)神經(jīng)元的方法，其特征在于在根據(jù)權(quán)利要求7的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)神經(jīng)元。
9.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求8的方法培養(yǎng)的神經(jīng)元。
10.一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其特征在于在根據(jù)權(quán)利要求7的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基存在下，使胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。
11.通過(guò)使用根據(jù)權(quán)利要求7的來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基使胚胎干細(xì)胞分化而獲得的神經(jīng)細(xì)胞。
全文摘要
公開(kāi)了制備來(lái)源于胚胎干細(xì)胞的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的方法，其特征在于培養(yǎng)通過(guò)胚胎干細(xì)胞分化所制備的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞；由所述方法獲得的培養(yǎng)基，該條件培養(yǎng)基用于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞以及用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的用途。
文檔編號(hào)C12N5/079GK101052711SQ20058003786
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月6日
發(fā)明者中山孝, 井上順雄, 近藤靖, 鈴木豐, 奧野剛 申請(qǐng)人:田邊制藥株式會(huì)社