專利名稱：H5型或h7型禽流感病毒的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及H5型或H7型禽流感病毒的檢測方法，更具體涉及用于檢測H5型或H7型禽流感病毒的寡核苷酸引物、使用該引物的H5型或H7型禽流感病毒的檢測方法、流感的診斷方法及用于診斷流感的試劑盒。
背景技術：
流感是流行性的病毒性呼吸器官傳染病，患病者具有從嬰幼兒到老年人的廣闊年齡層，常常是致命的。目前，感染禽類而形成問題的H5型禽流感病毒原來不感染人類。但是，1997年在香港發(fā)現(xiàn)了對人的感染，該次流行中18名患者的6名死亡。所幸之后沒有再發(fā)現(xiàn)對人的感染，但進入2004年，在泰國和越南發(fā)現(xiàn)了對人的感染，在泰國有8人死亡，在越南有16人。
高致病性禽流感病毒除H5型之外，還有H7型，H7型根據(jù)其序列大致分為歐洲型和美洲型。2003年在荷蘭流行時報告有1人死亡，在美國2003年至2004年也報告了H7型禽流感病毒的流行。
目前，禽流感病毒的檢測使用人A型流感病毒快速診斷試劑盒。但是，所感染病毒的亞型的鑒定需要分離的病毒的抗原分析和基因檢測等更加詳盡的分析。
可以獲得可靠的結果的采用病毒分離培養(yǎng)的診斷由于需要數(shù)日，因此無法進行快速的診斷?？梢员炔《痉蛛x更快速地進行診斷的方法有若干種，其中的RT-PCR法被認為與其它方法相比檢測靈敏度更高。但是，對于目前公開的RT-PCR法，有報道稱其與病毒的感染價相比無法以高靈敏度檢出病毒，即使采用RT-PCR法的檢查中呈陰性，也不能排除禽流感的感染。因此，希望出現(xiàn)可以迅速且高靈敏度地檢出H5和H7型禽流感病毒的檢查法。
專利文獻1歐洲專利申請公開第1310565號說明書專利文獻2日本專利公表2004-509648號公報非專利文獻1Lau LT.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.313，p.336-342(2004)非專利文獻2Shang S.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.302，p.377-383(2003)非專利文獻3Collins RA.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，vol.300，p.507-515(2003)非專利文獻4Lee MS.等，J.Virol.Methods，vol.97，p.13-22(2001)非專利文獻5Munch M.等，Arch.Virol.，vol.146，p.87-97(2001)發(fā)明的揭示為了解決上述課題，本發(fā)明人認真研究后發(fā)現(xiàn)，制作與對H5或H7型禽流感病毒特異性的堿基序列雜交的寡聚核苷酸引物，通過LAMP(環(huán)介導恒溫擴增，loop-mediated isothermal amplification)法擴增對H5或H7型禽流感病毒特異性的堿基序列，可以高靈敏度地檢出H5或H7型禽流感病毒，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供以下的(1)～(8)。
(1)根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的693位～959位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計的寡核苷酸引物。
(2)如(1)所述的寡核苷酸引物，其中，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號2～7表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
(3)如(1)或(2)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；
(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
(4)如(1)～(3)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號2的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號3的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號5的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號6的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
(5)H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用(1)～(4)所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
(6)如(5)所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
(7)流感的診斷方法，其特征在于，通過使用(1)～(4)所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
(8)試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的(1)～(4)所述的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還提供以下的(9)～(16)。
(9)根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的19位～220位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計的寡核苷酸引物。
(10)如(9)所述的寡核苷酸引物，其中，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號13～18表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
(11)如(9)或(10)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
(12)如(9)～(11)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號13的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號14的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號16的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號17的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
(13)H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用(9)～(12)所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
(14)如(13)所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
(15)流感的診斷方法，其特征在于，通過使用(9)～(12)所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
(16)試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的(9)～(12)所述的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還提供以下的(17)～(24)。
(17)根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的114位～333位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計的寡核苷酸引物。
(18)如(17)所述的寡核苷酸引物，其中，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號24～29表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
(19)如(17)或(18)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
(20)如(17)～(19)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號24的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號25的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號27的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號28的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
(21)H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用(17)～(20)所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
(22)如(21)所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
(23)流感的診斷方法，其特征在于，通過使用(17)～(20)所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
(24)試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的(17)～(20)所述的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還提供以下的(25)～(32)。
(25)根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的874位～1065位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計的寡核苷酸引物。
(26)如(25)所述的寡核苷酸引物，其中，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號35～40表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺夫、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
(27)如(25)或(26)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
(28)如(25)～(27)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號35的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號36的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號38的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號39的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
(29)H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用(25)～(28)所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
(30)如(29)所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
(31)流感的診斷方法，其特征在于，通過使用(25)～(28)所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
(32)試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的(25)～(28)所述的寡核苷酸引物。
本發(fā)明還提供以下的(33)～(40)。
(33)根據(jù)選自以序列編號48表示的H7型禽流感病毒的血凝素堿基序列的1016位～1225位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計的寡核苷酸引物。
(34)如(33)所述的寡核苷酸引物，其中，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號49～54表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
(35)如(33)或(34)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H7型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
(36)如(33)～(35)所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H7型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成
(a)5′-(與序列編號49的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號50的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號52的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號53的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
(37)H7型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用(33)～(36)所述的寡核苷酸引物，進行H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
(38)如(37)所述的H7型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
(39)流感的診斷方法，其特征在于，通過使用(33)～(36)所述的寡核苷酸引物，檢測H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H7型禽流感病毒的感染。
(40)試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的(33)～(36)所述的寡核苷酸引物。
若采用本發(fā)明，通過制作與對H5或H7型禽流感病毒特異性的堿基序列選擇性地雜交的寡聚核苷酸引物，用LAMP法擴增對H5或H7型禽流感病毒特異性的堿基序列，可以高靈敏度且迅速地檢出H5或H7型禽流感病毒。
附圖的簡單說明

圖1為表示H5型禽流感病毒用引物組的特異性試驗的結果的圖，(a)、(b)、(c)和(d)分別表示使用引物組A、B、C和D時的結果，NC表示陰性對照，H1表示新喀里多尼亞亞型，H3表示巴拿馬亞型，PC表示陽性對照(H5型質(zhì)粒DNA)。
圖2為表示H5型禽流感病毒用引物組的靈敏度試驗的結果的圖，(a)、(b)、(c)和(d)分別表示使用引物組A、B、C和D時的結果，103～106表示RNA提取物的稀釋率。
圖3為表示以H5型禽流感病毒用引物組擴增的產(chǎn)物的電泳結果的圖，泳道1為100bp梯標記物，泳道2為LAMP產(chǎn)物的樣本，泳道3為將LAMP產(chǎn)物以Dde I處理得到的樣本。
圖4為表示H5型禽流感病毒用引物組的交叉試驗的結果的圖，B-sd表示B/山東/07/97，B-sh表示B/上海/361/2002，AIV-H1等表示禽流感病毒H1等。
圖5為表示H7型禽流感病毒用引物組的反應性確認試驗的結果的圖，250、100、50表示tRNA的添加量(拷貝/試驗)，NC表示陰性對照。
圖6為表示以H7型禽流感病毒用引物組擴增的產(chǎn)物的電泳結果的圖，泳道M為100bp梯標記物，泳道1為LAMP產(chǎn)物的樣本，泳道2為將LAMP產(chǎn)物以Pst I處理得到的樣本。
圖7為表示H7型禽流感病毒用引物組的交叉性試驗的結果的圖，H1和H3表示人流感病毒H1型和H3型，B-sd表示B/山東/07/97，B-sh表示B/上海/361/2002，AIV-H1等表示禽流感病毒H1等，PC表示陽性對照，NC表示陰性對照。
圖8為表示H7型禽流感病毒用引物組對于各種株的反應性的結果的圖，(a)表示A/荷蘭/219/2003，(b)表示A/荷蘭/33/2003，105～108表示RNA提取物的稀釋率。
圖9為表示H7型禽流感病毒用引物組對于各種株的反應性的結果的圖，(a)表示A/野鴨/荷蘭/12/00，(b)表示A/水鳧/大阪/1/2001，105～108表示RNA提取物的稀釋率。
實施發(fā)明的最佳方式作為本發(fā)明中使用的試樣，可以例舉例如痰液、支氣管肺泡清洗液、鼻液、鼻腔吸取液、鼻腔清洗液、鼻腔擦拭液、咽頭擦拭液、漱口液、唾液、血液、血清、血漿、腦脊液、尿、糞便、組織等來自于被懷疑感染禽流感病毒的人或其它動物的活體的樣本。此外，試樣也可以采用分離自感染實驗等中所用的細胞和其培養(yǎng)液或者來自于活體的標本和培養(yǎng)細胞等的含病毒的樣本等。這些試樣可以進行分離、抽提、濃縮、純化等預處理。
這樣的核酸的擴增可以通過不需要納富等開發(fā)的PCR法中不可缺少的溫度控制的新核酸擴增法——被稱為LAMP法的環(huán)介導恒溫擴增法(國際公開第00/28082號文本)來實現(xiàn)。該方法是通過使自身的3′末端退火到作為模板的核苷酸上而作為互補鏈合成的起點的同時，組合退火到這時形成的環(huán)上的引物，可以實現(xiàn)恒溫下的互補鏈合成反應的核酸擴增法。此外，LAMP法是至少使用識別6個區(qū)域的4個引物的特異性高的核酸擴增法。
LAMP法中所用的寡核苷酸引物為識別模板核酸的堿基序列的共6個區(qū)域的堿基序列的至少4種引物，該6個區(qū)域為自3′末端側的記作F3c、F2c、F1c的區(qū)域和自5′末端側的記作B3、B2、B1的區(qū)域，分別被稱為內(nèi)部引物F及B和外部引物F及B。此外，將F3c、F2c、F1c的互補序列分別記作F3、F2、F1，將B3、B2、B1的互補序列分別記作B3c、B2c、B1c。內(nèi)部引物是指識別目標堿基序列上的“某個特定的核苷酸序列區(qū)域”，且在3′末端具有供作合成起點的堿基序列，同時在5′末端具有對于將該引物作為起點的核酸合成反應生成物的任意區(qū)域互補的堿基序列的寡核苷酸。在這里，將包含“選自F2的堿基序列”和“選自F1c的堿基序列”的引物稱作內(nèi)部引物F(以下略作FIP)，并將包含“選自B2的堿基序列”和“選自B1c的堿基序列”的引物稱作內(nèi)部引物B(以下略作BIP)。另一方面，外部引物是指識別目標堿基序列上的“存在于比內(nèi)部引物識別的區(qū)域更接近3′末端側的某個特定的核苷酸序列區(qū)域”，且具有供作合成起點的堿基序列的寡核苷酸。在這里，將包含“選自F3的堿基序列”的引物稱作外部引物F(以下略作F3)，并將包含“選自B3的堿基序列”的引物稱作外部引物B(以下略作B3)。在這里，各引物中的F表示與目標堿基序列的有義鏈互補地結合且提供合成起點的引物；另一方面，B表示與目標堿基序列的反義鏈互補地結合且提供合成起點的引物。在這里，用作引物的寡核苷酸的長度在10堿基以上，較好是15堿基以上，可以是化學合成或天然的寡核苷酸，各引物可以是單一的寡核苷酸，也可以是多種寡核苷酸的混合物。
LAMP法中，除內(nèi)部引物和外部引物以外，還可以使用其它的引物，即環(huán)引物。環(huán)引物(Loop Primer)是指基于LAMP法的擴增生成物的同一鏈上產(chǎn)生的互補序列相互退火形成環(huán)的情況下，在其3′末端包含與該環(huán)內(nèi)的序列互補的堿基序列的2種引物(構成雙鏈的各鏈各1種)。若使用該引物，則核酸合成的起點增加，可以實現(xiàn)反應時間的縮短和檢測靈敏度的上升(國際公開第02/24902號文本)。
寡核苷酸可以通過公知的方法制造，例如可以進行化學合成?；蛘?，也可以將天然的核酸用限制性酶等剪切，改變或連結成所需堿基序列的結構。具體來說，可以使用寡核苷酸合成裝置等進行合成。此外，可以使用具有1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列的寡核苷酸的合成法等本身公知的制法。例如，可以單獨或適當組合使用位點特異性突變導入法、基因同源重組法、引物伸長法或PCR法，合成所述的寡核苷酸。
作為本說明書中的“嚴格的雜交條件”，可以選擇通常公知的條件。作為嚴格條件，可以例舉例如以下的條件在含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml的DNA的溶液中，在42℃雜交一晚后，在室溫下于2×SSC·0.1％SDS中清洗一次，再在約65℃下用0.1×SSC·0.1％SDS中清洗兩次。
流感病毒為RNA病毒。LAMP法中模板為RNA的情況下，通過在模板為DNA時的反應液中添加反轉錄酶，可以同樣地進行核酸擴增反應(RT-LAMP法)。
本發(fā)明人對可以快速地擴增對于H5型禽流感病毒特異性的堿基序列的LAMP法的引物堿基序列及其組合認真研究后，根據(jù)H5型禽流感病毒的血凝素的堿基序列(以序列編號1表示的堿基序列)，選定了以下的A、B、C和D這4組作為引物組。另外，這些引物的序列與已報道的(例如專利文獻2)的用于H5型禽流感病毒的檢測的NASBA(基于核酸序列的擴增，Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)用引物的序列完全不同。
(引物組A)FIP19c5′-ACCATATTCCAACTCACTTTTCATAATTTCATTGCTCCAGAATATGC-3′(序列編號8)BIP55′-CAAACTCCAATGGGGGCATGGTGAGAGGGTGTAT-3′(序列編號9)F3m65′-GGAGTTCTTCTGGACAA-3′(序列編號4)B3m5′-GTCGCAAGGACTAATCT-3′(序列編號10)LF245′-GAGTCCCCTTTCTTGACAAT-3′(序列編號11)LB15′-GATAAACTCTAGTATGCCA-3′(序列編號12)(引物組B)FIP5′-GGGCATGTGTAACAGTAACGTTAAACAACTCGACAGAGCA-3′(序列編號19)BIP5′-TGGAAAAGACACACAATGGGAACATCCAGCTACACTACAATC-3′(序列編號20)F35′-CAGATTTGCATTGGTTACCA-3′(序列編號15)B35′-CGTCACACATTGGGTTTC-3′(序列編號21)LF5′-TTCCATTATTGTGTCAACC-3′(序列編號22)LB85′-CGATCTAGATGGAGTGAAGC-3′(序列編號23)(引物組C)FIP5′-CACATTGGGTTTCCGAGGAGATCTAGATGGAGTGAAGCC-3′(序列編號30)BIP5′-TTCATCAATGTGCCGGAATGGGTTGAAATCCCCTGGGTA-3′(序列編號31)F35′-GGAAAAGACACACAATGGG-3′(序列編號26)B35′-GCTCAATAGGTGTTTCAGTT-3′(序列編號32)LF65′-CCAGCTACACTACAATCTCT-3′(序列編號33)LB65′-TCCAGCCAATGACCTCTG-3′(序列編號34)(引物組D)
FIP5′-TCGCAAGGACTAATCTGTTTGACATACACCCTCTCACCAT-3′(序列編號41)BIP5′-TACCCCTCAAAGAGAGAGAAGATCCTCCCTCTATAAAACCTG-3′(序列編號42)F35′-TCTAGTATGCCATTCCACAA-3′(序列編號37)B35′-ACCATCTACCATTCCCTG-3′(序列編號43)LF85′-TCACATATTTGGGGCATTCC-3′(序列編號44)LB85′-AGAGAGGACTATTTGGAGCT-3′(序列編號45)另外，本發(fā)明人對可以快速地擴增對于H7型禽流感病毒特異性的堿基序列的LAMP法的引物堿基序列及其組合認真研究后，根據(jù)H7型禽流感病毒的血凝素的堿基序列(以序列編號1表示的堿基序列)，選定了以下的引物組E。
(引物組E)22FIP5′-ACCACCCATCAATCAAACCTTCTATTTGGTGCTATAGCGG-3′(序列編號55)22BIP5′-TTCAGGCATCAAAATGCACAAGCCTGTTATTTGATCAATTGCTG-3′(序列編號56)22F3m5′-TTCCCGAAATCCCAAA-3′(序列編號51)22B35′-GGTTAGTTTTTTCTATAAGCCG-3′(序列編號57)22-9LF5′-CCCATCCATTTTCAATGAAAC-3′(序列編號58)22-9LB5′-ACTGCTGCAGATTACAAAAG-3′(序列編號59)核酸合成中使用的酶只要是具有鏈置換活性的模板依賴性核酸合成酶即可，沒有特別限定。作為這樣的酶，可以例舉Bst DNA聚合酶(大片段)、Bca(exo-)DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段等，較好是Bst DNA聚合酶(大片段)。
作為RT-LAMP法中使用的反轉錄酶，只要是具有將RNA作為模板合成cDNA的活性的酶即可，沒有特別限定。作為這樣的酶，可以例舉AMV、克隆的AMV、MMLV的反轉錄酶和Superscript II、ReverTraAce、Thermoscript等，較好是AMV或克隆的AMV的反轉錄酶。此外，如果使用像Bca DNA聚合酶那樣具有反轉錄酶活性和DNA聚合酶活性這兩種活性的酶，則可以用1種酶進行RT-LAMP反應。
核酸合成中使用的酶和反轉錄酶可以從病毒或細菌等中純化得到，也可以通過基因重組技術制成。此外，這些酶可以進行片段化或氨基酸的置換等改變。
LAMP反應后的核酸擴增產(chǎn)物的檢測可以使用公知的技術。例如，可以使用特異性識別擴增得到的堿基序列的標記寡核苷酸或熒光性嵌入劑法(日本專利特開2001-242169號公報)進行檢測，也可以將反應結束后的反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳而容易地進行檢測。通過瓊脂糖凝膠電泳，LAMP擴增產(chǎn)物被以堿基長度不同的多種條帶呈梯狀地檢出。此外，LAMP法中，由于核酸的合成，底物被大量消耗，作為副產(chǎn)物的焦磷酸離子與共存的鎂離子反應而生成焦磷酸鎂，反應液白濁至肉眼也可確認的程度。因此，通過使用可以對反應結束后或反應中的濁度上升持續(xù)進行光學觀察的測定儀器確認該白濁，例如使用常規(guī)的分光光度計確認400nm的吸光度變化，也可以檢測核酸擴增反應(國際公開第01/83817號文本)。
使用本發(fā)明的引物進行核酸擴增的檢測時所需的各種試劑可以事先組合而試劑盒化。具體來說，作為本發(fā)明的引物或環(huán)引物所需的各種寡核苷酸、作為核酸合成的底物的4種dNTP、進行核酸合成的DNA聚合酶、具有反轉錄活性的酶、提供適合于酶反應的條件的緩沖液和鹽類、使酶和模板穩(wěn)定化的保護劑以及根據(jù)需要采用的反應生成物的檢測所需的試劑以試劑盒的形式提供。
實施例以下，例舉實施例，對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明并不受到這些實施例的任何限定。
實施例1H5型禽流感病毒用引物組的反應性的確認引物的反應性的確認通過以下的方法進行。用于通過LAMP法進行核酸擴增的反應溶液的組成如下。另外，引物的合成委托QIAGEN公司，使用OPC(反相柱層析)純化得到的產(chǎn)品。
20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl8mM MgSO41.4mM dNTP10mM(NH4)2SO40.8M甜菜堿(SIGMA)0.1％Tween201.6μM FIP1.6μM BIP0.2μM F30.2μM B30.8μM LF
0.8μM LBAMV反轉錄酶2U(Finnzyme)Bst DNA聚合酶16U(NEB)在上述反應溶液中加入104拷貝的H5質(zhì)粒DNA(HK/213/03；由國立傳染病研究所提供)，在62.5℃進行RT-LAMP反應60分鐘。使用實時濁度測定裝置LA-320C(榮研化學)，實時地對反應進行檢測。其結果是，4種引物組(引物組A、B、C和D)確認擴增。
另外，對于該4組，使用提取自作為培養(yǎng)病毒的新喀里多尼亞亞型(H1N1)和巴拿馬亞型(H3N2)的RNA作為模板進行特異性試驗。圖1為表示特異性試驗的結果的圖。如圖1所示，使用各引物組的情況下，都未發(fā)現(xiàn)H1型和H3型的擴增。由上述結果可知，所有的引物組對于H5型的特異性都高。
接著，使用提取自作為培養(yǎng)病毒的越南/JP1203/04(H5N1)的RNA，進行靈敏度試驗。由于提取RNA的模板量不明，因此使用以無核糖核酸酶的滅菌水稀釋103～106倍的RNA作為模板樣本。圖2為表示靈敏度試驗的結果的圖。使用引物組A時，即使是稀釋105倍的樣本也確認到擴增，靈敏度最高。
實施例2以H5型禽流感病毒用引物組擴增得到的產(chǎn)物的確認對于以引物組A擴增得到的LAMP產(chǎn)物，進行使用電泳和限制性酶Dde I的確認。圖3為表示電泳結果的圖。由圖3的泳道2可明顯地確認LAMP產(chǎn)物特有的梯形圖案。此外，以Dde I處理了的樣本(泳道3)確認發(fā)生消化。由以上的結果可知，目標序列被特異性地擴增。
實施例3H5型禽流感病毒用引物組的評價(交叉性試驗)將人流感病毒的A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/巴拿馬/2007/99(H3N2)、B/山東/07/97和B/上海/361/2002以及禽流感病毒H1～H15(除H5外)的總計18種作為樣本。分別從培養(yǎng)病毒用QIAamp Viral RNA Kit(QIAGEN公司)進行RNA的抽提，將5μL抽提液用于RT-LAMP反應(使用引物組A作為引物)。
由圖4(a)和(b)可知，通過RT-LAMP法所有的樣本未發(fā)現(xiàn)擴增。因此，確認RT-LAMP法的特異性高。
實施例4H5型禽流感病毒用引物組的評價(靈敏度試驗)使用2004年在山口縣確認感染的禽流感H5型株(CH/山口7/04)和2004年在越南確認感染的H5型株(VN/JP1203/04)作為模板樣本。分別將從培養(yǎng)病毒抽提得到的RNA以無核糖核酸酶的滅菌水分步稀釋(104～108)，RT-PCR法使用10μL稀釋液，RT-LAMP法(使用引物組A作為引物)使用5μL稀釋液。
RT-PCR法修改國立傳染病研究所的傳染病信息中心的網(wǎng)站上所登載的條件進行。即，使用市售的試劑盒(TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV))，在50℃進行反轉錄反應30分鐘，在94℃處理2分鐘后，重復30次94℃1分鐘、45℃1分鐘、72℃1分鐘的循環(huán)，再于72℃進行伸長反應10分鐘，在4℃進行保存。
RT-PCR法中使用的引物和反應溶液的組成如下。
引物(PCR產(chǎn)物的長度708bp)H5 515f5′-CATACCCAACAATAAAGAGG-3′(序列編號46)H5 1220r5′-GTGTTCATTTTGTTAATGAT-3′(序列編號47)反應溶液RNA抽提液10μL10×One Step RNA PCR緩沖液5μL10mM dNTP 5μL25mM MgCl210μL核糖核酸酶抑制劑1μLAMV反轉錄酶1μLAMV-優(yōu)化Taq 1μLH5515f(10μM)2μLH51220r(10μM)2μL無核糖核酸酶的滅菌水適當添加而將反應液調(diào)整至50μL采用RT-PCR法和RT-LAMP法的擴增的結果匯總示于表1。表1中，RT-LAMP法的欄表示確認擴增的樣本的比例。此外，RT-PCR中的擴增通過肉眼確認電泳的結果(表1中，○表示可檢出擴增，×表示無法檢出擴增)。


比較RT-LAMP法和RT-PCR法時，所有的株都是RT-LAMP法高達10～100倍的靈敏度。
實施例5H7型禽流感病毒用引物組的反應性的確認引物組E的反應性的確認通過以下的方法進行。用于通過LAMP法進行核酸擴增的反應溶液的組成如下。另外，引物的合成委托QIAGEN公司，使用OPC(反相柱層析)純化得到的產(chǎn)品。
20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl8mM MgSO41.4mM dNTP10mM(NH4)2SO40.8M甜菜堿(SIGMA)0.1％ Tween201.6μM FIP1.6μM BIP0.2μM F30.2μM B30.8μM LF0.8μM LBAMV反轉錄酶2U(Finnzyme)Bst DNA聚合酶16U(NEB)將A/荷蘭/219/2003(H7N7)(在荷蘭出現(xiàn)死亡病例時分離得到的株)的堿基序列(包含序列編號1所示的堿基序列的片段)重組到克隆載體上，通過轉錄反應制備tRNA。將制得的tRNA以250、100或50拷貝/試驗的量加入到上述反應溶液中，在62.5℃反應35分鐘，使用實時濁度測定裝置LA-200(テラメツクス)，進行擴增反應和檢測。
tRNA的添加量為250、100和50拷貝/試驗的情況以及陰性對照的實時檢測結果示于圖5。由該結果可知，至50拷貝/試驗也檢出擴增。
實施例6以H7型禽流感病毒用引物組擴增得到的產(chǎn)物的確認對于以引物組E擴增得到的LAMP產(chǎn)物，進行使用電泳和限制性酶Pst I的確認。圖6為表示電泳結果的圖。M表示100bp的梯標記物，泳道1為未處理的LAMP產(chǎn)物的樣本，泳道2為將LAMP產(chǎn)物以Pst I消化得到的樣本。由圖6的泳道1可明顯地確認LAMP產(chǎn)物特有的梯形圖案。此外，以Pst I處理了的樣本(泳道2)確認發(fā)生消化。由以上的結果可知，目標序列被特異性地擴增。
實施例7H7型禽流感病毒用引物組的評價(交叉性試驗)將人流感病毒的A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/巴拿馬/2007/99(H3N2)、B/山東/07/97和B/上海/361/2002以及禽流感病毒H1～H15(除H7外)的總計18種作為樣本，考察引物的特異性。分別從培養(yǎng)病毒用QIAamp Viral RNA Kit(QIAGEN公司)進行RNA的抽提，將稀釋100倍的抽提RNA用于RT-LAMP反應。另外，陽性對照(PC)使用實施例5中制備的tRNA，陰性對照使用蒸餾水。
由圖7可知，所有的樣本都未發(fā)現(xiàn)擴增。因此，確認本發(fā)明的引物組的特異性高。
實施例8H7型禽流感病毒用引物組的評價(對各種株的反應性)將4種H7型禽流感病毒基因組用作模板樣本，考察對各種病毒的靈敏度。分別將從培養(yǎng)病毒抽提得到的RNA以無核糖核酸酶的滅菌水分步稀釋(105～108)，使用5μL稀釋液。
將各病毒基因組作為模板樣本時的實時檢測的結果示于圖8和9。對于A/荷蘭/219/2003(H7N7)和A/荷蘭/33/2003(H7N7)，可以檢測至107倍稀釋(參照圖8)，對于A/野鴨/荷蘭/12/2003(H7N3)和A/水鳧/大阪/1/2001(H7N7)，可以檢測至106倍稀釋(參照圖9)。由以上結果可知，本發(fā)明的引物組與上述4種株反應。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性若采用本發(fā)明，可以高靈敏度且迅速地檢出H5型或H7型禽流感病毒。
序列表<110>榮研化學株式會社(EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA)國立傳染病研究所(National Institute of Infectious Diseases)<120>H5型或H7型禽流感病毒的檢測方法<130>FP05-0385-00<160>59<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1674<212>DNA<213>禽流感病毒<400>1agtcttgtta aaagtgatca gatttgcatt ggttaccatg caaacaactc gacagagcag 60gttgacacaa taatggaaaa gaacgttact gttacacatg cccaagacat attggaaaag120acacacaatg ggaagctctg cgatctagat ggagtgaagc ctctaatttt gagagattgt180agtgtagctg gatggctcct cggaaaccca atgtgtgacg aattcatcaa tgtgccggaa240tggtcttaca tagtggagaa ggccagtcca gccaatgacc tctgttaccc aggggatttc300aacgactatg aagaactgaa acacctattg agcagaataa accattttga gaaaattcag360atcatcccca aaagttcttg gtccaatcat gaagcctcat caggggtgag ctcagcatgt420ccatatcttg ggaagtcctc ctttttcaga aatgtggtat ggcttatcaa aaagaacagt480acatacccaa caataaagag gagctataat aataccaacc aagaagatct tttggtactg540tgggggattc accatcctaa tgatgcggca gagcagacaa agctctatca aaacccaacc600acctatattt ccgttggaac atcaacacta aaccagagat tggtaccaaa aatagctact660agatccaaag taaacgggca aagtggaaga atggagttct tctggacaat tttaaagccg720aatgatgcta tcaatttcga gagtaatgga aatttcattg ctccagaata tgcatacaaa780attgtcaaga aaggggactc agcaattatg aaaagtgaat tggaatatgg taactgcaac840accaagtgtc aaactccaat gggggcgata aactctagta tgccattcca caacatacac900cctctcacca tcggggaatg ccccaaatat gtgaaatcaa acagattagt ccttgcgact960ggactcagaa atacccctca aagagagaga agaagaaaaa agagaggact atttggagct 1020atagcaggtt ttatagaggg aggatggcag ggaatggtag atggttggta tgggtaccac 1080catagcaatg agcaggggag tggatacgct gcagacaaag aatccactca aaaggcaata 1140gatggagtta ccaataaggt caactcgatc attgacaaaa tgaacactca gtttgaggcc 1200
gttggaaggg aatttaataa cttagaaagg agaatagaaa atttaaacaa gaagatggaa 1260gacggattcc tagatgtctg gacttataat gctgaacttc tggttctcat ggaaaatgag 1320agaactctag actttcacga ctcaaatgtc aagaaccttt acgacaaggt ccgactacag 1380cttagggata atgcaaagga gctgggtaac ggctgtttcg agttctatca caaatgtgat 1440aatgaatgta tggaaagtgt aaaaaacgga acgtatgact acccgcagta ttcagaagaa 1500gcaagactaa acagagagga aataagtgga gtaaaattgg aatcaatggg aacttaccaa 1560atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt tccctagcac tggcaatcat ggtagctggt 1620ctatctttat ggatgtgctc caatggatcg ttacaatgca gaatttgcat ttaa 1674<210>2<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>2aattatgaaa agtgagttgg aatatggt28<210>3<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3tcattgctcc agaatatgc 19<210>4<211>17<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>8accatattcc aactcacttt tcataatttc attgctccag aatatgc 47<210>9<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9caaactccaa tgggggcatg gtgagagggt gtat 34<210>10<211>17<212>DNA<213>人工的
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<223>引物<400>16tggaaaagac acacaatggg aa 22<210>17<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>26ggaaaagaca cacaatggg 19<210>27<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>29aactgaaaca cctattgagc 20<210>30
<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>30cacattgggt ttccgaggag atctagatgg agtgaagcc 39<210>31<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>31ttcatcaatg tgccggaatg ggttgaaatc ccctgggta 39<210>32<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>32gctcaatagg tgtttcagtt 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>33ccagctacac tacaatctct 20<210>34<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>34tccagccaat gacctctg18
<210>35<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>35tcaaacagat tagtccttgc ga 22<210>36<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>36catacaccct ctcaccat18<210>37<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>37tctagtatgc cattccacaa 20<210>38<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>38tacccctcaa agagagagaa ga 22<210>39<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>39caggttttat agagggagga 20
<210>40<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>40cagggaatgg tagatggt18<210>41<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>41tcgcaaggac taatctgttt gacatacacc ctctcaccat40<210>42<211>42<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>42tacccctcaa agagagagaa gatcctccct ctataaaacc tg 42<210>43<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>43accatctacc attccctg18<210>44<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>44tcacatattt ggggcattcc 20
<210>45<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>RT-PCR引物(H5 515f)<400>46catacccaac aataaagagg20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>RT-PCR引物(H5 1220r)<400>47gtgttcattt tgttaatgat20<210>48<211>1737<212>DNA<213>禽流感病毒<400>48agcaaaagca ggggatacaa aatgaacact caaatcctgg tattcgctct ggtggcgagc 60attccgacaa atgcagacaa gatctgcctt gggcatcatg ccgtgtcaaa cgggactaaa120gtaaacacat taactgagag aggagtggaa gtcgttaatg caactgaaac ggtggaacga180acaaacgttc ccaggatctg ctcaaaaggg aaaaggacag ttgacctcgg tcaatgtgga240cttctgggaa caatcactgg gccaccccaa tgtgaccaat tcctagaatt ttcggccgac300ttaattattg agaggcgaga aggaagtgat gtctgttatc ctgggaaatt cgtgaatgaa360gaagctctga ggcaaattct cagagagtca ggcggaattg acaaggagac aatgggattc420acctacagcg gaataagaac taatggaaca accagtgcat gtaggagatc aggatcttca480
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<212>DNA<213>人工的<220>
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<223>引物<400>57ggttagtttt ttctataagc cg 22<210>58<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>58cccatccatt ttcaatgaaa c21<210>59<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>59actgctgcag attacaaaag 20
權利要求
1.寡核苷酸引物，其特征在于，根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的693位～959位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計。
2.如權利要求1所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號2～7表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
3.如權利要求1或2所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
4.如權利要求1～3中任一項所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號2的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號3的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號5的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號6的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
5.H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用權利要求1～4中任一項所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
6.如權利要求5所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
7.流感的診斷方法，其特征在于，通過使用權利要求1～4中任一項所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
8.試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的權利要求1～4中任一項所述的寡核苷酸引物。
9.寡核苷酸引物，其特征在于，根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的19位～220位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計。
10.如權利要求9所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號13～18表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
11.如權利要求9或10所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
12.如權利要求9～11中任一項所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號13的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號14的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號16的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號17的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
13.H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用權利要求9～12中任一項所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
14.如權利要求13所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
15.流感的診斷方法，其特征在于，通過使用權利要求9～12中任一項所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
16.試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的權利要求9～12中任一項所述的寡核苷酸引物。
17.寡核苷酸引物，其特征在于，根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的114位～333位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計。
18.如權利要求17所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號24～29表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
19.如權利要求17或18所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
20.如權利要求17～19中任一項所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號24的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號25的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號27的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號28的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
21.H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用權利要求17～20中任一項所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
22.如權利要求21所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
23.流感的診斷方法，其特征在于，通過使用權利要求17～20中任一項所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
24.試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的權利要求17～20中任一項所述的寡核苷酸引物。
25.寡核苷酸引物，其特征在于，根據(jù)選自以序列編號1表示的H5型禽流感病毒的血凝素堿基序列的874位～1065位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計。
26.如權利要求25所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號35～40表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中的1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
27.如權利要求25或26所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H5型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、B1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
28.如權利要求25～27中任一項所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H5型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號35的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號36的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號38的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號39的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
29.H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用權利要求25～28中任一項所述的寡核苷酸引物，進行H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
30.如權利要求29所述的H5型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
31.流感的診斷方法，其特征在于，通過使用權利要求25～28中任一項所述的寡核苷酸引物，檢測H5型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H5型禽流感病毒的感染。
32.試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的權利要求25～28中任一項所述的寡核苷酸引物。
33.寡核苷酸引物，其特征在于，根據(jù)選自以序列編號48表示的H7型禽流感病毒的血凝素堿基序列的1016位～1225位的堿基序列的任意堿基序列或與其互補的堿基序列設計。
34.如權利要求33所述的寡核苷酸引物，其特征在于，包含選自以下的(a)～(c)的寡核苷酸(a)選自以序列編號49～54表示的堿基序列或與其互補的堿基序列的至少含有連續(xù)的15個堿基的寡核苷酸；(b)可與前述(a)所述的寡核苷酸在嚴格條件下雜交的寡核苷酸；(c)包含前述(a)或(b)所述的寡核苷酸中1個～數(shù)個的堿基被置換、缺失、插入或添加的堿基序列，具有引物功能的寡核苷酸。
35.如權利要求33或34所述的寡核苷酸引物，其特征在于，從H7型禽流感病毒的血凝素的目標核酸上的3′末端側選擇記作F3c、F2c、F1c的堿基序列區(qū)域，從5′末端側選擇記作B3、B2、B1的堿基序列區(qū)域，將各自的互補堿基序列記作F3、F2、F1和B3c、B2c、b1c時，由選自以下的(a)～(d)的堿基序列構成(a)在3′末端側具有目標核酸的F2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的F1c區(qū)域的堿基序列；(b)具有目標核酸的F3區(qū)域的堿基序列；(c)在3′末端側具有目標核酸的B2區(qū)域，在5′末端側具有目標核酸的B1c區(qū)域的堿基序列；(d)具有目標核酸的B3區(qū)域的堿基序列。
36.如權利要求33～35中任一項所述的寡核苷酸引物，其特征在于，可以擴增對H7型禽流感病毒特異性的堿基序列，從5′末端到3′末端，由選自以下的(a)～(b)的堿基序列構成(a)5′-(與序列編號49的堿基序列互補的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(序列編號50的堿基序列)-3′；(b)5′-(序列編號52的堿基序列)-(堿基數(shù)0～50的任意的堿基序列)-(與序列編號53的堿基序列互補的堿基序列)-3′。
37.H7型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，使用權利要求33～36中任一項所述的寡核苷酸引物，進行H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應。
38.如權利要求37所述的H7型禽流感病毒的檢測方法，其特征在于，H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增反應采用LAMP法。
39.流感的診斷方法，其特征在于，通過使用權利要求33～36中任一項所述的寡核苷酸引物，檢測H7型禽流感病毒的目標核酸區(qū)域的擴增，診斷是否有H7型禽流感病毒的感染。
40.試劑盒，其特征在于，包含用于診斷流感的權利要求33～36中任一項所述的寡核苷酸引物。
全文摘要
本發(fā)明提供與根據(jù)H5型或H7型禽流感病毒的血凝素的堿基序列設計的任意的堿基序列特異性地雜交的寡核苷酸、使用該引物的核酸擴增方法、基于核酸擴增的檢測的H5型或H7型禽流感病毒感染的診斷方法及流感診斷用試劑盒。
文檔編號C12Q1/70GK101052720SQ20058003760
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月26日 優(yōu)先權日2004年11月1日
發(fā)明者峰川晴美, 納富繼宣, 米川俊廣, 富田憲弘, 葛原陽子, 小田切孝人 申請人:榮研化學株式會社, 國立感染癥研究所所長代表的日本國