一種人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的制備方法及培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)制備人源星形膠 質(zhì)前體細(xì)胞的方法及培養(yǎng)基。具體涉及誘導(dǎo)人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（inducedpluripotent stemcell,iPSC)分化為大腦星形膠質(zhì)前體細(xì)胞（Astrocyteprogenitorcell)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte)是哺乳動(dòng)物腦內(nèi)分布最多的一類細(xì)胞，此類膠質(zhì)細(xì)胞 呈星形，從胞體發(fā)出許多長(zhǎng)的突起，突起與神經(jīng)細(xì)胞相接觸，起支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞的功 能。應(yīng)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞的技術(shù)不僅推進(jìn)神經(jīng)科學(xué)研宄的進(jìn)步，而 且為大量獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞來源應(yīng)用于臨床提供基本條件。星形膠質(zhì)細(xì)胞最早是由人源誘 導(dǎo)多能干細(xì)胞，經(jīng)過神經(jīng)前體細(xì)胞的分化步驟而獲得（圖1)。
[0003] 人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的維持培養(yǎng)，需要應(yīng)用特定的培養(yǎng)基以維持其前體細(xì)胞屬 性。目前有關(guān)人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)少之又少，大部分有關(guān)星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的報(bào) 道都是來源于大鼠或小鼠，科學(xué)家只能通過分離人腦部組織，通過原代培養(yǎng)和鑒定獲得，組 織來源有限，獲得細(xì)胞數(shù)目不多。能查到的文章中提到的有關(guān)人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞是這 樣獲得的：購(gòu)買人神經(jīng)前體細(xì)胞系（該細(xì)胞系是商品），經(jīng)過培養(yǎng)（培養(yǎng)基為人神經(jīng)前體細(xì) 胞培養(yǎng)基ScienCell Research Laboratories)混合1 %胎牛血清，20天后，即可獲得CD44 陽(yáng)性的細(xì)胞，CD44是星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)志物，故該細(xì)胞為星形膠質(zhì)前體細(xì)胞。利用流 式細(xì)胞儀，可以將這些⑶44陽(yáng)性細(xì)胞回收，純化和培養(yǎng)（人神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)基ScienCe 11 Research Laboratories混合1 %胎牛血清）的。這些前體細(xì)胞的分化產(chǎn)物是星形膠質(zhì)細(xì) 胞，是為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)與支持的，如果星形膠質(zhì)細(xì)胞功能受損，也會(huì)導(dǎo)致重大疾病如阿爾 茨海默病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的制備方法及 培養(yǎng)基。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：
[0007] (1)將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種于細(xì)胞專用培養(yǎng)板中，采用mTeSR干細(xì)胞培養(yǎng)基、于 37°C條件下對(duì)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6-8天，優(yōu)選7天傳代一次，每天更換新鮮的 mTeSR干細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0008] (2)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞傳代第5天后，用無菌的PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞表面，然后加入 少量（相當(dāng)于更換的新鮮的mTeSR干細(xì)胞培養(yǎng)基一半體積）擬胚體分化培養(yǎng)基（該擬胚體 分化培養(yǎng)基為現(xiàn)有技術(shù)）；用無菌細(xì)胞刮子輕刮誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)邊緣，使誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)脫離培養(yǎng)板并處于懸浮狀態(tài)，然后反復(fù)吹打使誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)分散， 將分散后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加擬胚體分化培養(yǎng)基后在37°C條 件下震蕩培養(yǎng)5天以上，每2天更換一次新鮮的擬胚體分化培養(yǎng)基；
[0009] (3)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)懸浮震蕩培養(yǎng)5天后，形成大小均一、構(gòu)造類似的擬胚 體球狀結(jié)構(gòu)的擬胚體細(xì)胞團(tuán)；將擬胚體分化培養(yǎng)基更換為由N2培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基和DMEM/ F12無血清培養(yǎng)基混合成的混合培養(yǎng)基A，該混合培養(yǎng)基A中添加有生長(zhǎng)因子bFGF和生長(zhǎng) 因子EGF，生長(zhǎng)因子bFGF和生長(zhǎng)因子EGF在混合培養(yǎng)基A中的的濃度均為10yg/L;將擬胚 體細(xì)胞團(tuán)與混合培養(yǎng)基A-起移至由基質(zhì)膠Matrigel包被的培養(yǎng)皿中，輕搖培養(yǎng)皿使擬胚 體細(xì)胞團(tuán)平均分散于培養(yǎng)皿底面，37°C條件下靜置培養(yǎng)5-7天，優(yōu)選6天，每?jī)商旄鼡Q一次 新鮮的混合培養(yǎng)基A;擬胚體細(xì)胞團(tuán)中央定向分化為玫瑰花狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)前體細(xì)胞團(tuán)；1L 步驟（3)所述混合培養(yǎng)基A由10mLN2培養(yǎng)基、20mLB27培養(yǎng)基和970mLDMEM/F12無血清 培養(yǎng)基混合成（未添加后述生長(zhǎng)因子的混合培養(yǎng)基為市售），該混合培養(yǎng)基A中添加有生長(zhǎng) 因子bFGF和生長(zhǎng)因子EGF，生長(zhǎng)因子bFGF和生長(zhǎng)因子EGF在混合培養(yǎng)基A中的的濃度均為 10ug/L〇
[0010] (4)用無菌針挑出神經(jīng)前體細(xì)胞團(tuán)并置于無菌離心管中，添加相當(dāng)于離心管2/3 體積的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，于lOOOrpm條件下離心，收集細(xì)胞，然后更換新鮮的由N2 培養(yǎng)基、B27培養(yǎng)基和DMEM/F12無血清培養(yǎng)基混合成的混合培養(yǎng)基B，該混合培養(yǎng)基B中添 加有生長(zhǎng)因子bFGF、生長(zhǎng)因子BMP-4及替代血清的KSR的培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子bFGF在混合培 養(yǎng)基B中的濃度為10 yg/L，生長(zhǎng)因子BMP-4在混合培養(yǎng)基B中的濃度為20 yg/L，替代血 清的KSR的培養(yǎng)基的添加量為混合培養(yǎng)基B總體積的10 %;吹打收集的細(xì)胞沉淀，使細(xì)胞沉 淀重懸于新鮮培養(yǎng)基中，形成細(xì)胞液，將細(xì)胞液平鋪于基質(zhì)膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37°C 條件下靜置培養(yǎng)3天后，細(xì)胞液中的細(xì)胞體積膨大，開始分化為星形膠質(zhì)前體細(xì)胞，增殖的 細(xì)胞開始表達(dá)低水平的GFAP標(biāo)志蛋白，即得人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞。1L步驟（4)所述混合 培養(yǎng)基B由10mL N2培養(yǎng)基、20mL B27培養(yǎng)基和970mL DMEM/F12無血清培養(yǎng)基混合成（未 添加后述生長(zhǎng)因子的混合培養(yǎng)基為市售），該混合培養(yǎng)基B中添加有生長(zhǎng)因子bFGF、生長(zhǎng)因 子BMP-4及替代血清的KSR的培養(yǎng)基，生長(zhǎng)因子bFGF在混合培養(yǎng)基B中的濃度為10yg/L， 生長(zhǎng)因子BMP-4在混合培養(yǎng)基B中的濃度為20yg/L，替代血清的KSR的培養(yǎng)基的添加量為 混合培養(yǎng)基B總體積的10%。
[0011] 優(yōu)選地，1L步驟（2)所述擬胚體分化培養(yǎng)基中含有DMEM/F12無血清培養(yǎng)基 990mL，N2 培養(yǎng)基 10mL，還含有A-8301 和Dorsomorphin，A-8301 和Dorsomorphin在擬胚體 分化培養(yǎng)基中的濃度為1umol/L。
[0012] 優(yōu)選地，所述方法還包括如下步驟：向混合培養(yǎng)基B中加入白血病抑制因子，白血 病抑制因子在混合培養(yǎng)基B中的濃度為20yg/L，將步驟（4)獲得的人源星形膠質(zhì)前體細(xì)胞 置于該添加有白血病抑制因子的混合培養(yǎng)基B中進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞的定向分化。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)化并篩選出應(yīng)用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞制備星形膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法（圖2)。 與分化型的星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，該前體細(xì)胞具有增殖和定向分化能力，大量提供高純度的 星形膠質(zhì)細(xì)胞提供來源。該技術(shù)對(duì)于腦部疾病的發(fā)病機(jī)理、腦的再生和修復(fù)機(jī)制、進(jìn)而應(yīng)用 于臨床治療有著非常重要的應(yīng)用前景。
[0014] 下面對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明：
[0015] 本發(fā)明將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞專用培養(yǎng)板中，保持誘導(dǎo)多能干細(xì) 胞以細(xì)胞團(tuán)的狀態(tài)進(jìn)行傳代，細(xì)胞團(tuán)大小均一（圖3)。在培養(yǎng)過程中需要保持高密度 的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)，一般每隔7天傳代一次。傳代使用無菌針挑去分化的細(xì)胞。此階 段中用于培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基為市售的專用mTeSR干細(xì)胞培養(yǎng)基（Stemcell Technologies,Vancouver,Canada)。每天更換2毫升新鮮培養(yǎng)液。干細(xì)胞傳代第五天后，用 無菌的PBS緩沖液（pH7. 4)潤(rùn)洗細(xì)胞表面，然后更換1毫升的擬胚體（EmbryonicBody，EB) 分化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有DMEM/F12無血清培養(yǎng)基（ThermoFisherScientific)，N2培 養(yǎng)基（ThermoFisherScientific,Inc)，1ymol/L的A-8301 (Stemgent,SanDiego,CA)和 1y