神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)板的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)器材，具體地說涉及一種神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)板。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)元原代培養(yǎng)是體外研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要手段之一，也是對神經(jīng)系統(tǒng)損傷進(jìn)行細(xì)胞分子水平研究的基礎(chǔ)。建立神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型對研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元發(fā)育、損傷和修復(fù)中的作用尤為重要。
[0003]目前存在的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的裝置主要是:傳統(tǒng)Banker裝置和Transwell小室。傳統(tǒng)的Banker法是利用烙鐵在蓋玻片上滴入四個高度約1_2 mm石錯，SP在蓋玻片上安放支持物以建立共培養(yǎng)體系，但該裝置不利于蓋玻片上的神經(jīng)元進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。劉利等于《中華神經(jīng)外科疾病研究雜志》2006年04期發(fā)表了 “神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)方法的建立”，公開了一種改進(jìn)的Banker法，利用烙鐵將石錯(0.1 mm)安放在培養(yǎng)板的底面而不是蓋玻片上，這樣相對更容易建立共培養(yǎng)體系。
[0004]以上兩種方法均存在共同的缺陷:1、利用烙鐵在培養(yǎng)皿底部滴入石蠟，由于操作人員的關(guān)系，每次構(gòu)建的體系，甚至同一批次的體系都可能會出現(xiàn)較大差異。2、石蠟的熔點(diǎn)較低(47°C -64°C)，且密度(0.9 g/cm3)低于細(xì)胞培養(yǎng)基，在共培養(yǎng)體系建立的過程中，勢必降低裝置的穩(wěn)定性。3、石蠟溶于汽油、二硫化碳、二甲苯、乙醚、苯、氯仿、四氯化碳、石腦油等非極性溶劑，同時極易溶于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常用的溶劑二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMS0)，影響共培養(yǎng)體系的微環(huán)境。
[0005]Transwell小室的底部濾膜材質(zhì)為聚苯二甲酸乙二醇酯(polythyleneterephthalate, PET)，膜表面經(jīng)過鈦酸酯偶聯(lián)劑(titanate coupling agent，TC)處理，改善了細(xì)胞的貼壁性；另外，插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿包含有透明的B1pore膜，可直接透過膜觀察細(xì)胞。利用插入式培養(yǎng)皿可將星形膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元接種于可通透性的PET膜上，直徑為12 mm和30 mm的插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿可懸掛于24孔或6孔板上，其原理是將星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元在同一培養(yǎng)基中的兩個層面上進(jìn)行培養(yǎng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分泌的各種細(xì)胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)可以通過插入式培養(yǎng)皿的微孔膜在細(xì)胞間進(jìn)行交換。純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞向培養(yǎng)基中釋放大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子以供神經(jīng)元生長所需，又不會阻礙神經(jīng)元的生長。插入式培養(yǎng)皿為懸掛式設(shè)計，方便移液管操作，而且插入皿會自動歸位。但利用Transwell小室進(jìn)行神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，存在以下問題=(I)Transwell小室中，生長于不同層面的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞通過濾膜進(jìn)行對話，不符合實(shí)際生理情況。(2)尤其在共培養(yǎng)的短期作用觀察中，Transwell小室的濾膜在一定程度上，不利于細(xì)胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)的迅速擴(kuò)散和相互交流，導(dǎo)致介質(zhì)分布不均，影響細(xì)胞間對話。(3) Transwell小室費(fèi)的用較貴且膜面積有限，難以應(yīng)用于大規(guī)模、大批次的細(xì)胞共培養(yǎng)。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006]發(fā)明目的:本實(shí)用新型的目的是提供一種低成本、建立培養(yǎng)體系簡捷有效的神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)板。
[0007]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)板包括孔板、設(shè)于孔板內(nèi)底面的若干個支撐座、以及搭在若干支撐座上的爬片。
[0008]本實(shí)用新型的支撐座設(shè)置于孔板底面，方便爬片上的神經(jīng)元進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。為了保證爬片支撐的穩(wěn)定性，防止使用過程中發(fā)生晃動，所述爬片下表面設(shè)有與支撐座上端形成限位關(guān)系的淺槽。
[0009]所述支撐座為球形支撐座或柱形支撐座，優(yōu)選為圓柱形支撐座。
[0010]進(jìn)一步地，所述支撐座為局部熔融狀態(tài)下焊接在孔板內(nèi)底面的玻璃珠或玻璃柱。[0011 ] 所述淺槽為圓形槽，位置與支撐座的分布是對應(yīng)的。支撐座上端位于淺槽內(nèi)，僅會在微小范圍內(nèi)浮動，防止爬片在移動孔板過程中滑落。所述淺槽也可設(shè)為一體式的環(huán)形槽，熔融焊接支撐座時，根據(jù)需要焊接到孔板內(nèi)底面，支撐座上端對應(yīng)地環(huán)形槽內(nèi)，可在一定程度上保證爬片安裝的穩(wěn)定性。
[0012]優(yōu)選地，對于12孔板而言，所述玻璃珠直徑為3~5 mm，相鄰玻璃珠之間距離為15-25 mm，恪融部分的高度為0.5-1.0 mm ;所述玻璃柱底面直徑為3~5 mm，高度為3~5 mm,相鄰玻璃柱之間距離為15~25 mm，熔融部分的高度為0.5~1.0 mm。6孔板、24孔板的玻璃珠、玻璃柱大小根據(jù)使用需要進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。
[0013]本實(shí)用新型所述孔板為6孔、12孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)皿中的任意一種，優(yōu)選為12孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0014]所述支撐座設(shè)有為3~6個，優(yōu)選數(shù)量為4個。所述爬片形狀包括但不限于圓形或四邊形，優(yōu)選為四邊形，方便爬片的取出。
[0015]利用本實(shí)用新型的培養(yǎng)板建立神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系的處理步驟包括:
[0016](I)酸處理后進(jìn)行高壓滅菌，然后焊接到孔板內(nèi)底面；
[0017](2)冷卻后將焊接有玻璃珠或玻璃柱的孔板紫外消毒，多聚賴氨酸包被，37°C過夜；
[0018](3)將神經(jīng)元種植于孔板內(nèi)底面，48 h后大半量換液，以后每2?3 d換液一次；
[0019](4)神經(jīng)元種植第5 d，玻璃爬片酸處理后高壓滅菌，多聚賴氨酸包被，37°C過夜；
[0020](5)離體培養(yǎng)10?14 d星形膠質(zhì)細(xì)胞種植于爬片，24 h后全量換液，以后每2?3 d換液一次；
[0021](6)神經(jīng)元種植第7 d，條件培養(yǎng)基預(yù)孵星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，收集條件培養(yǎng)基；次日，條件培養(yǎng)基半量更換神經(jīng)元培養(yǎng)基，37°C孵育24 h ;
[0022](7)神經(jīng)元種植第9?10 d，更換新鮮神經(jīng)元培養(yǎng)基，將星形膠質(zhì)細(xì)胞爬片小心反扣于玻璃珠表面，建立體系。
[0023]有益效果:(I)本實(shí)用新型設(shè)計合理、操作簡便、易行，克服了傳統(tǒng)的Banker培養(yǎng)方法星形膠質(zhì)細(xì)胞生長不易控制的問題，神經(jīng)元和星形