專利名稱：靶向神經元和神經膠質人類胚胎干細胞系的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及包含靶向基因構建體的人類干細胞系，并且特別涉及
包含經由同源重組插入01 ig2基因座內的報道基因的人類胚胎干細胞 系。
背景技術：
人類干細胞具有充當實驗模型以研究在體內不易取得的人類發(fā)育 的方面的潛力。人類干細胞還具有在研究負責疾病發(fā)作和進展的分子 和細胞機制中有用的潛力。Menedez等人，Current Gene Ther. 5: 375-85 ( 2005 )。
其為位于染色體中的DNA序列與新引入的DNA序列的同源重組的 基因靶向提供了用于特異性改變哺乳動物基因組的方法。Thomas和 Capecchi, Cell 51: 503-512 ( 1987 )?；虬邢蛞褢糜谛∈笈咛?干細胞(mESC)系，以研究神經元分化。Xian等人，Stem Cells 21: 41-49 ( 2003 )描述了包含關于01ig2基因座的GFP敲入的inESCs ( RW4 ES)的產生。Xian和Gottlieb, Glia 47: 88-101 ( 2004 )報告了 GFP-01ig2敲入mESCs的使用(如Xian 2003中所述)。Xian等人， Biochem. Biophys. Res. Comm. 327: 155-162( 2005 )描述了 GFP-01ig2 敲入小鼠的使用(Xian， 2003 )，以開發(fā)用RA和Shh的培養(yǎng)條件，用 于ES細胞沿著神經通路的快速和有效分化以用于HTS潛力。
然而，人類干細胞中的基因靶向已證明是困難的。Zwaka和 Thomson, Nature Biotech. 21: 319-321 ( 2003 )報告難以達到在人 類胚胎干細胞(hESCs)中高的、穩(wěn)定轉染率，并且對于mESCs建立的 電穿孔方案在hESCs中工作很差。Yates和Daley,Gene Ther. 13(20): 1431-9 )( 2006 )報告HR(同源重組)在hESCs中未廣泛采用(與mESCs 比較)，并且迄今僅存在3個HR靶向hESC系(2個HPRT系和1個0ct4
4系)。根據該作者，這是部分由于在將DNA轉染到hESCs內遇到的主要困難。此外，迄今，仍未靶向在未分化的人類干細胞中未表達的基因。
因此，本領域需要在基因中包含靶向突變的人類干細胞系，所述基因在未分化的人類干細胞中表達。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及包含靶向基因構建體的人類干細胞系，并且特別涉及包含經由同源重組插入01ig2基因座內的報道基因的人類胚胎干細胞系。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含插入基因內的報道基因的人類干細胞，所述基因在分化前在所述人類干細胞中不表達。在某些實施方案中，人類干細胞是胚胎干細胞。在某些實施方案中，報道基因插入olig2基因座內。在某些實施方案中，報道基因編碼熒光蛋白質。在某些實施方案中，熒光蛋白質選自綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含前迷人類干細胞的分離的干細胞系。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含前述人類干細胞的體外細胞培養(yǎng)物。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了包含前述人類干細胞的生物體。在再進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了包含前述人類干細胞的組織。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選化合物的方法，其包括a)提供包含插入基因內的報道基因的人類干細胞，所述基因在分化前在所述人類干細胞中不表達；b)使所述人類干細胞與所述至少一種化合物接觸；c)培養(yǎng)所述人類干細胞；和d)就所迷報道基因的表達測定所述人類干細胞。在某些實施方案中，人類千細胞包含插入0Ug2基因座內的報道基因。在某些實施方案中，測定通過選自熒光顯微鏡檢查和熒光激活細胞分選的方法來執(zhí)行。在某些實施方案中，培養(yǎng)包括在這樣的條件下培養(yǎng)所述人類干細胞，使得允許所述人類干細胞分化。在某些實施方案中，提供了多個細胞，并且所述接觸步驟包括在高流通量測定法中使所述多個細胞與化合物文庫接觸。在某些實施方案中，化合物選自蛋白質、肽、多肽和小有機化合物。在某些實施方案中，人類干細胞是胚胎千細胞。在某些實施方案中，該方法進一步包括選 擇化合物的步驟。在某些實施方案中，該方法進一步包括在人類動物 中測試所述化合物的步驟。在某些實施方案中，該方法進一步包括包 裝所述化合物用于在動物中使用的步驟。
在某些實施方案中，本發(fā)明進一步提供了篩選神經毒素的方法，
其包括提供a)提供包含插入01ig2基因座內的報道基因的人類干細 胞；b )使所述人類干細胞與懷疑是神經毒素的所述至少一種化合物接 觸；和c)就所述報道基因的表達測定所述人類干細胞。在某些實施 方案中，測定通過選自熒光顯微鏡檢查和熒光激活細胞分選的方法來 執(zhí)行。在某些實施方案中，人類干細胞是胚胎千細胞。 附圖
描述
圖l提供了關于人類01ig2的序列。
圖2提供了本發(fā)明的0Hg2報道基因(綠色熒光蛋白)構建體的
序列。 定義
如本文所使用的，術語"干細胞"意指全能或多能或多潛能的并
且能夠分化成一個或多個不同細胞類型的細胞。
如本文所使用的，術語"胚胎干細胞"意指衍生自受精后約7天 的胚胎的干細胞。
如本文所使用的，術語 體的干細胞。
如本文所使用的，術語 相關的特征的細胞系。
如本文所使用的，術語 細胞相關的特征的細胞系。
如本文所使用的，術語"神經細胞系"意指顯示通常與神經細胞 系相關的特征的細胞系。此種特征的例子包括但不限于，GFAP、神經 元特異性烯醇酶、Neu-N、神經絲-N或tau的表達。
如本文所使用的，術語"全能的"意指細胞分化成分化生物體中
'成人干細胞"意指衍生自出生后的生物 '中胚層細胞系"意指顯示與中胚層細胞 '內胚層細胞系"意指顯示通常與內胚層的任何細胞類型，以及胚胎外材料例如胎盤的細胞的能力。
如本文所使用的，術語"多能的"指能夠分化成任何分化的細胞類型的細胞系。
如本文所使用的，術語"多潛能的"指能夠分化成至少2個分化的細胞類型的細胞系。
如本文所使用的，術語"分化"如就分化細胞系統中的細胞而言使用的，指通過其細胞從一個細胞類型(例如，多潛能、全能或多能的可分化細胞)分化成另一個細胞類型例如靼分化細胞的過程。
如本文所使用的，術語"細胞培養(yǎng)"指細胞的任何體外培養(yǎng)。這個術語內包括的是連續(xù)細胞系(例如具有永生化表型)、原代細胞培養(yǎng)、有限細胞系(例如非轉化細胞)、和在體外維持的任何其他細胞群體，包括卵母細胞和胚胎。
如本文所使用的，術語"報道基因"或"報道構建體"指包括編碼蛋白質的核酸的遺傳構建體，所述蛋白質可容易地檢測或可容易地測定，例如有色蛋白質、熒光蛋白質或酶例如P-半乳糖苷酶。
如本文所使用的，術語"基因靶向"指外源DNA整合到細胞基因組內在其中它的表達可以合適地控制的位點處。這種整合作為同源重組的結果而發(fā)生。
如本文所使用的，"敲入"方法指經由同源重組將所需核酸序列例如編碼報道基因的序列插入宿主細胞中的特定基因座內的操作。
如本文所使用的，術語"基因組"指生物體的遺傳材料(例如染色體)。
術語"目的核苷酸序列"指任何核苷酸序列(例如RNA或DNA ),其的操作可以由本領域普通技術人員認為由于任何原因(例如治療疾病、賦予改良的特性、目的蛋白質在宿主細胞中的表達、核酶的表達等)希望的。此種核苷酸序列包括但不限于，結構基因(例如報道基因、選擇標記基因、癌基因、藥物抗性基因、生長因子等)的編碼序列，和不編碼mRNA或蛋白質產物(例如啟動子序列。多腺苷酸化序列、終止序列、增強子序列等)的非編碼調節(jié)序列。
7如本文所使用的，術語"目的蛋白質，，指由目的核酸編碼的蛋白質。
如本文所使用的，術語"外源基因"指在宿主生物體或細胞中非 天然存在的基因，或人工引入宿主生物體或細胞內的基因。
術語"基因"指包含產生多肽或前體(例如胰島素原)所需的編
碼序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可以由全長編碼序列或 由編碼序列的任何部分編碼，只要保留全長或片段的所需活性或功能 性質(例如酶促活性、配體結合、信號轉導等)。該術語還包含結構 基因的編碼區(qū)，并且包括在任一末端上位于編碼區(qū)鄰近在5，和3，末 端上約1 kb或更多的距離的序列，從而使得基因對應于全長mRNA的 長度。位于編碼區(qū)的5，并且存在于mRNA上的序列稱為5，非翻譯序 列。位于編碼區(qū)的3，或下游并且存在于mRNA上的序列稱為3，非翻 譯序列。術語"基因"包含基因的cDNA和基因組形式?；虻幕蚪M 形式或克隆包含由稱為"內含子"或"間插區(qū)"或"間插序列"的非 編碼序列間隔的編碼區(qū)。內含子是轉錄成核RNA(hnRNA)的基因區(qū)段； 內含子可以包含調節(jié)元件例如增強子。內含子從核或原始轉錄物中去 除或"剪接掉，，；內含子因此不存在于信使RNA (fflRNA)轉錄物中。 mRN A在翻譯過程中作用于指定新生多肽中的氨基酸順序或次序。
如本文所使用的，術語"基因表達"指基因中編碼的遺傳信息通 過基因的"轉錄，，(即，經由RNA聚合酶的酶促作用)轉換成RNA (例 如mRNA、 rRNA、 tRNA或snRNA)的過程，并且對于蛋白質編碼基因， 通過mRNA的"翻譯"轉換成蛋白質的過程?；虮磉_可以在該過程中 的許多階段處進行調節(jié)。"上調"或"激活"指增加基因表達產物(即， RNA或蛋白質)的生產的調節(jié)，而"下調"或"阻遏，，指減少生產的 調節(jié)。涉及上調或下調的分子(例如，轉錄因子)通常分別稱為"激 活物"或"阻遏物"。
如本文所使用的，術語"核酸分子編碼"、"DNA序列編碼"、 "DNA編碼"、"RNA序列編碼"和"RNA編碼"指脫氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸沿著脫氧核糖核酸或核糖核酸鏈的次序或順序。這些脫氧核糖核酸或核糖核酸的次序決定氨基酸沿著多肽(蛋白質)鏈的次序。
DNA或RNA序列因此編碼氨基酸序列。
如本文所使用的，術語"互補的"或"互補性，，就通過堿基配對原則相關的多核苷酸(即，核苷酸的序列)而言使用。例如，序列"5/-A-G-T-3,，，與序列"3'-T-C-A-5"，互補。互補性可以是部分的，其中僅某些核酸的堿基根據堿基配對原則相匹配?；蛘?，在核酸之間可以存在"完全，，或"全部，，互補性。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間的雜交效率和強度具有顯著影響。這在擴增反應中，以及依賴核酸之間的結合的檢測方法中特別重要。
術語"同源性"或"同一性百分比"當就核酸而言使用時，指互補性程度。存在部分同源性(即部分同一性)或完全同源性(即完全同一性)。部分互補的序列是至少部分抑制完全互補的序列與靶核酸序列雜交的序列，并且涉及使用功能術語"基本上同源的"。完全互補的序列與靶序列的雜交的抑制可以使用雜交測定法(DNA或RNA印跡、溶液雜交等)在低嚴格性條件下進行檢查?；旧贤吹男蛄谢蛱结?即能夠與另一種目的寡核苷酸雜交的寡核苷酸)將竟爭且抑制完全同源的序列與靶序列在低嚴格性的條件下的結合(即雜交)。這并不是說低嚴格性條件是這樣的，使得允許非特異性結合；低嚴格性條件需要2個序列彼此的結合是特異性(即選擇性)相互作用。非特異性結合的不存在可以通過使用第二種靶進行測試，所述第二種靶缺乏甚至部分互補性程度(例如，小于約30%同一性)；在不存在非特異性結合的情況下，探針將不與第二種非互補靶雜交。
本領域眾所周知的是可以采用眾多等價條件，以包括低嚴格性條件；考慮因子諸如探針的長度和性質(DNA、 RNA、堿基組成)以及靶(DNA、 RNA、堿基組成、存在于溶液中或固定的等)的性質以及鹽和其他組分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的濃度，并且雜交溶液可以改變以產生與上文列出的條件不同但等價的低嚴格性雜交的條件。此外，本領域已知在高嚴格性條件下促進雜交的條件(例如增加雜交的溫度和/或洗滌步驟、在雜交溶液中使用甲當就雙鏈核酸序列例如cDNA或基因組克隆而言使用時，術語"基 本上同源的"指在如上所述的低嚴格性條件下可以與雙鏈核酸序列的 任一或兩條鏈雜交的任何探針。
當就單鏈核酸序列而言使用時，術語"基本上同源的"指在如上 所述的低嚴格性條件下可以雜交(即它是......的互補體)單鏈核酸序
列的任何探針。
如本文所使用的，術語"雜交"就互補核酸的配對而言使用。雜 交和雜交的強度(即核酸之間的結合強度)受此種因子如核酸之間的 互補性程度、涉及的條件的嚴格性、形成的核酸的L、和核酸內的G: C比的影響。在其結構內包含互補核酸的配對的單個分子被說成是"自 雜交的"。
如本文所使用的，術語"T "就核酸的"解鏈溫度"而言使用。 解鏈溫度是在其下雙鏈核酸分子的群體變得一半解離成單鏈的溫度。 用于計算核酸的L的等式是本領域眾所周知的。如由標準參考文獻指 示的，L值的簡單估計可以通過等式進行計算T - 81. 5 + 0." (% G + C)，當核酸在1 M NaCl下的水溶液中時(參見例如，Anderson 和Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985])。其他參考文獻包括考慮結構以及序列特征 用于計算L的更復雜計算。
如本文所使用的，術語"嚴格性"就在其下進行核酸雜交的溫度 條件、離子強度和其他化合物例如有機溶劑的存在使用。用"高嚴格 性，，條件，核酸堿基配對將僅在具有高頻率的互補堿基序列的核酸片 段之間發(fā)生。因此，"弱"或"低"嚴格性條件通常是衍生自遺傳上 不同的生物體的核酸需要的，因為互補序列的頻率通常較少。
"高嚴格性條件"就核酸雜交而言使用時，包括等價于在42。C下 在溶液中結合或雜交的條件，所述溶液由5X SSPE (43.8 g/1 NaCl、 6. 9 g/1 NaH2P04 H20和1. 85 g/1 EDTA， pH用NaOH調整至7.4)、 0. 5%SDS、 5X Denhardt's試劑和100 |a g/ml變性鮭精DNA組成，隨后為在包舍O.l X SSPE、 1. 0% SDS的溶液中在42r下洗滌，當采用長度約500個核苷酸的探針時。
"中等嚴格性條件"就核酸雜交而言使用時，包括等價于在42。C下在溶液中結合或雜交的條件，所述溶液由5X SSPE ( 43. 8 g/1 NaCl、6. 9 g/1 NaH具.H20和1. 85 g/1 EDTA， pH用NaOH調整至7. 4 )、0. 5°/。SDS、 5X Denhardt's試劑和100 jn g/ml變性鮭精DNA組成，隨后為在包含1.0 X SSPE、 1.0% SDS的溶液中在42'C下洗滌，當采用長度約500個核苷酸的探針時。
"低嚴格性條件"就核酸雜交而言使用時，包括等價于在42。C下在溶液中結合或雜交的條件，所述溶液由5X SSPE (43.8 g/1 NaCl、6. 9 g/1 NaH2P04 . H20和1. 85 g/1 EDTA， pH用NaOH調整至7,4)、0.1% SDS、 5X Denhardt's試劑[50X Denhardt's每500 ml包含:5gFicoll (類型400， Pharamcia) 、 5gBSA(部分V; Sigma)]和100Hg/ml變性鮭精DNA組成，隨后為在包含5 X SSPE、 0.1% SDS的溶液中在42。C下洗滌，當采用長度約500個核苷酸的探針時。
如本文所使用的，術語"以可操作的組合"、"以可操作的次序"和"可操作地連接"指核酸序列以這樣的方式連接，使得產生能夠指導給定基因的轉錄和/或所需蛋白質分子的合成的核酸分子。該術語還指氨基酸序列以這樣的方式連接，使得產生功能蛋白質。
如本文所使用的，術語"調節(jié)元件"指控制核酸序列表達的一定方面的遺傳元件。例如，啟動子是促進可操作地連接的編碼區(qū)的轉錄起始的調節(jié)元件。其他調節(jié)元件是剪接信號、多腺苷酸化信號、終止信號、RNA輸出元件、內部核糖體進入位點等(下文定義)。
真核生物中的轉錄控制信號包括"啟動子"和"增強子"元件。啟動子和增強子由DNA序列的短排列組成，所述DNA序列與涉及轉錄的細胞蛋白質特異性相互作用(Maniatis等人，Science 236: 1237[1987])。啟動子和增強子元件已從各種真核來源中分離，包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞以及病毒中的基因(類似的控制元件，即啟動子也在原核生物中發(fā)現)。特定啟動子和增強子的選擇依賴待使用何種
ii細胞類型以表達目的蛋白質。某些真核啟動子和增強子具有廣泛的宿 主范圍，而其他的在有限的細胞類型子集中起作用(關于綜述，參見
Voss等人，Trends Biochem. Sci. ， 11: 287 [1986];和ManUtis 等人，同上)。例如，SV40早期基因增強子在來自許多哺乳動物物種
的廣泛多樣的細胞類型中非常活躍，并且已廣泛用于在哺乳動物細胞 中表達蛋白質(Dijkema等人，EMBO J. 4: 761 [1985])。在廣泛范 圍的哺乳動物細胞類型中活躍的啟動子/增強子元件的2個其他例子 是來自人類延長因子loc基因(Uetsuki等人，J. Biol. Chem. ， 264: 5791 [1989]; Kim等人，Gene 91: 217 [1990];以及Mizushima和 Nagata, Nuc. Acids. Res. ， 18: 5322 [1990])以及勞斯肉瘤病毒 (Gorman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 [1982])和 人類巨細胞病毒(Boshart等人，Cell 41: 521 [1985])的長末端重 復的那些。
如本文所使用的，術語"啟動子/增強子"指包含能夠提供啟動子 和增強子功能(即，由啟動子元件和增強子元件提供的功能，參見上 文關于這些功能的討論)的序列的DM區(qū)段。例如，逆轉錄病毒的長
末端重復包含啟動子和增強子功能。增強子/啟動子可以是"內源"或 "外源"或"異源的，，。"內源"增強子/啟動子是在基因組中與給定 基因天然連接的那種。"外源，，或"異源"增強子/啟動子是借助于基 因操作(即分子生物學技術例如克隆和重組)放置與基因并列的那種， 從而使得那種基因的轉錄由連接的增強子/啟動子指導。
如本文所使用的，術語"啟動子"、"啟動子元件"或"啟動子 序列，，指，當與目的核苷酸序列連接時，能夠控制目的核苷酸序列轉 錄成mRNA的DNA序列。啟動子一般盡管不一定位于它控制其轉錄成 mRNA的目的核苷酸序列的5，(即上游)，并且提供通過RNA聚合酶 的特異性結合和其他轉錄因子的位點用于起始轉錄。
啟動子可以是組成型或調節(jié)型的。術語"組成型"當就啟動子而 言使用時，意指啟動子在不存在刺激(例如，熱休克、化學制品等) 的情況下能夠指導可操作地連接的核酸序列的轉錄。相比之下，"調節(jié)型"啟動子是在刺激(例如，熱休克、化學制品等)的存在下能夠 指導可操作地連接核酸序列的轉錄水平的啟動子，其不同于在不存在 刺激的情況下可操作地連接的核酸序列的轉錄水平。
如本文所使用的，術語"體外"指人為環(huán)境以及在人為環(huán)境內發(fā) 生的過程或反應。體外環(huán)境可以由試管和細胞培養(yǎng)組成，但不限于試 管和細胞培養(yǎng)。術語"體內，，指自然環(huán)境(例如動物或細胞)以及在 自然環(huán)境內發(fā)生的過程或反應。 發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及包含靶向基因構建體的人類干細胞系，并且特別涉及 包含經由同源重組插入所需基因座內的報道基因的人類胚胎干細胞
系。在某些實施方案中，人類干細胞系是人類胚胎干細胞(hESC)系。 在某些實施方案中，人類干細胞系仍是多能的，維持正常核型，并且 允許檢測基因的基因表達，所述基因當人類干細胞系處于未分化狀態(tài) 時不表達，但當分化成特定細胞類型時表達。在某些優(yōu)選實施方案中， 基因表達通過插入的報道基因的表達進行檢測。在某些實施方案中， 報道基因編碼熒光蛋白質，并且基因表達通過熒光顯微鏡檢查或通過 FACS的分選進行檢測。
在某些優(yōu)選實施方案中，人類千細胞系包含經由同源重組插入 01ig2基因座內的報道基因。01ig2是在中樞神經系統中的運動神經元 和少突膠質細胞分化中起關鍵作用的轉錄因子。脊髓的pMN結構域中 的0Ug2+細胞產生運動神經元和少突膠質細胞，具有用于治療脊髓損 傷和其他運動神經元病癥例如MS和ALS的潛力的細胞類型。因為
01ig2在運動神經元和少突膠質細胞的發(fā)育中是重要的，所以本發(fā)明 提供了研究千細胞分化成運動神經元和少突膠質細胞，以及研究影響 此種分化的固有和外源性因子的方法。本發(fā)明的人類千細胞系還提供 了研究和測定用于細胞分化的優(yōu)化因子和條件的方法。 A.報道基因構建體
在某些實施方案中，遺傳構建體包含編碼報道基因的核酸，所述 報道基因插入或"敲入，，人類干細胞中的所需基因座內。用于產生遺傳構建體用于在產生敲入細胞系中使用的方法和用于產生該細胞系的
技術是本領域技術人員已知的，并且可以在例如下述中發(fā)現Sambrook 等人,1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版， Cold Spring Harbor Laboratory; Yoo等人，2003, Neuron, 37: 383; Watase等人，2002， Neuron, 34: 905; Lorenzetti等人，2000, Human Molecular Genetics, 9: 779; 和Lin等人，2001, Human Molecular Genetics, 10: 137。
在某些實施方案中，本發(fā)明的報道基因構建體包含側面為5，核 酸序列和3，核酸序列的編碼報道基因的核酸序列，所述5，核酸序列 與目的靶基因同源，所述3，核酸序列與目的基因序列同源。在某些 實施方案中，報道基因核酸序列與5'和3'側翼序列在框內，從而使得 當報道基因構建體經由同源重組插入靶基因內時，表達包含功能報道 基因產物例如綠色熒光蛋白的融合蛋白。
本發(fā)明并不限于任何特定報道基因核酸序列的使用。事實上，考 慮了各種報道基因核酸序列的使用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供 了關于用編碼熒光蛋白質的報道基因轉染干細胞的組合物和方法，其 中所述蛋白質的表達提供了無需處死細胞在千細胞中跟蹤表達分析的 可靠方法。在某些實施方案中，報道基因編碼熒光蛋白質，其中熒光 蛋白質發(fā)出例如綠色、紅色、黃色、青色(例如水綠色或青綠色)、 藍色、黃色(GenBank登記號AY278271 )、橙色(Genbank登記號 AY278265 )、橙紅色(GenBank登記號AY278270 )或橙黃色(GenBank 登記號AY678267 )熒光。編碼熒光蛋白質的熒光基因的例子可以在例 如Promega Corporation、 Invitrogen、 Clontech、 Stratagene、 BD Biosciences Phanningen、 Bvrogen JSC商購獲得。熒光蛋白質源于 各種來源，例如海洋無脊推動物、暗礁珊瑚蟲等，并且包括但不限于 來自J《weores、 /astrea ( GenBank登"i己號AY218848 ) 、 Zoa/^Ai/s、 "/"ow邁a和^e化rec〃s屬。另外的熒光蛋白質的例子可以在例如美 國專利號6， 884， 620和6， 645， 761中發(fā)現。本發(fā)明并不限于熒光蛋白 質編碼基因，并且考慮來自任何來源的任何熒光編碼基因用于與本發(fā)明一起使用。在某些實施方案中，編碼熒光蛋白質的基因已通過用于 哺乳動物翻譯機器的密碼子優(yōu)化進行優(yōu)化用于哺乳動物表達。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了關于用編碼酶促蛋白質的報道 基因轉染干細胞的組合物和方法，其中所述蛋白質的表達提供了無需 處死細胞在干細胞中跟蹤表達分析的可靠方法。例如，報道酶促蛋白 質的表達在底物利用后提供光輸出。產生光作為底物(例如螢光素、 腔腸素)利用的副產物的此種酶促蛋白質的例子包括但不限于，螢光 素酶、P-半乳糖苷酶和0-內酰胺酶。螢光素酶編碼報道基因(例如
安火蟲屬物種(戶力o〃廳) (GenBank登記號AY738222 )、海腎 屬物種(i e"27/a s/7. ) (GenBank登記號AF025844 )、光叩曱屬物種 (尸/ro;7力or^《p. ) ( GenBank登記號AY258591和AY258593 )等) 從Promega Corporation、 Stratagene和Clontech商購可得,例如， P -半乳糖苷酶編碼報道基因從Promega Corporation和Clontech商 購可得，并且例如，^-內酰胺酶編碼才艮道基因可從Invitrogen獲得。 在某些實施方案中，發(fā)光產生報道基因已通過用于哺乳動物翻譯機器 的密碼子優(yōu)化進行進一步優(yōu)化用于哺乳動物表達。
本發(fā)明并不限于任何特定5，和3，靶基因側翼序列的使用。事實 上，考慮了各種5，和3，靶基因側翼序列的使用。例如，可以靶向各 種不同基因，并且可以靶向不同區(qū)域中的基因。在某些優(yōu)選實施方案 中，靶基因是在未分化的干細胞中不表達或基本上不表達的基因。在 某些特別優(yōu)選的實施方案中，靶基因是人類01ig2。因此，在某些優(yōu) 選實施方案中，報道基因構建體包含與人類01ig2同源的5'和3'側翼 序列[圖2， SEQ ID NO: 1]，其中側翼序列側接報道基因核酸序列。 在某些優(yōu)選實施方案中，5'和3'側翼序列長度約5-約IO千堿基，并 且與SEQ ID NO: 1中的相應序列95%-100%同源。在某些特別優(yōu)選 的實施方案中，基因靼向構建體對應于SBQ ID NO: 2。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，報道基因構建體進一步包括可選標 記。本發(fā)明并不限于任何特定可選標記的使用。事實上，考慮了各種 可選標記的使用，包括但不限于，顯性可選標記，例如在哺乳動物細胞中賦予對于藥物G418的抗性的細菌氨基糖苷3'磷酸轉移酶基因(也 稱為neo基因)，賦予對于抗生素潮霉素的抗性的細菌潮霉素G磷酸 轉移酶(hyg )基因，和賦予在霉酚酸的存在下生長的能力的細菌黃噤 呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(也稱為gpt基因)。其他可選標記不 是顯性的，因為它們的使用必須與缺乏相關酶活性的細胞系結合使用。 非顯性可選標記的例子包括與tk—細胞系結合使用的胸苷激酶(tk)基 因、與CAD缺陷細胞結合使用的CAD基因、和與hprt—細胞系結合使用 的哺乳動物次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hprt)基因?？蛇x標記 在哺乳動物細胞系中的使用的綜述在Sambrook， J.等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York ( 1989 )第16. 9-16. 15頁中提供。 B.干細胞系
本發(fā)明并不限于任何特定類型的人類干細胞的使用。事實上，考 慮了各種類型的人類干細胞的使用。用于獲得來自人類、猴、小鼠、 大鼠、豬、牛和綿羊的全能或多能細胞的方法先前已得到描述。參見 例如，美國專利號5, 453， 357; 5, 523, 226; 5, 589, 376; 5， 340， 740; 和5， 166， 065 (所有這些通過引用特別合并入本文)；以及Evans等 人，Theriogenology 33 ( 1 ) : 125-128， 1990 ; Evans等人， Theriogenology 33( 1 ): 125-128， 1990; Notariamii等人，J- Reprod. Fertil. 41 ( Suppl. ): 51-56, 1990; Giles等人，Mol. Reprod. Dev. 36: 130-138， 1993; Graves等人，Mol. Reprod. Dev. 36: 424-433， 1993; Sukoyan等人，Mol. Reprod. Dev. 33: 418-431 ， 1992; Sukoyan 等人，Mol. Reprod. Dev. 36: 148-158， 1993; Ia織ccone等人， Dev. Biol. 163: 288-292, 1994; Evans & Kauf隠，Nature 292: 154- 156， 1981; Martin, Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638, 1981; Doetschman等人Dev Biol 127: 224-227， 1988 ); Giles等 人Mol Reprod Dev 36: 130-138， 1993; Graves & Moreadith, Mol Reprod Dev 36: 424-433， 1993和Bradley等人，Nature 309: 255-256, 1984。
靈長類動物胚胎干細胞(ESCs )可以優(yōu)選通過美國專利號
165, 843,780和6， 200， 806中公開的方法獲得，所述專利各自通過引用合并入本文。靈長類動物(包括人類)干細胞也可以得自商業(yè)來源，例如WiCell， Madison, WI。用于分離ESCs的優(yōu)選培養(yǎng)基是"ES培養(yǎng)基"。ES培養(yǎng)基由80%達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM;無丙酮酸鹽、高葡萄糖配方，GibcoBRL)與20%胎牛血清(FBS; Hyclone)、0.1 mM 巰基乙醇(Sigma) 、 1%非必需氨基酸母液(Gibco BRL)組成。優(yōu)選地，胎牛血清批次通過測試低傳代raESC系(ESjt3)——僅為了這個測試目的開發(fā)的細胞系一一的克隆鋪平板效率進行比較。FBS批次必須進行比較，因為已發(fā)現批次在其支持胚胎細胞生長的能力方面顯著不同，但就支持胚胎細胞測定FBS批次的能力的任何其他方法將充當備選。
在ES培養(yǎng)基的存在下，在鼠類胚胎成纖維細胞的匯合層上分離靈長類動物ESCs。胚胎成纖維細胞優(yōu)選得自來自遠親雜交的CF1小鼠(SASCO)的12天大的胎兒，但其他品系可以用作備選。組織培養(yǎng)皿優(yōu)選用0.1%明膠(1型；Sigma)進行處理。恒河猴胚胎的回收已得到證實，具有平均0. 4-0. 6活胚胎/恒河猴/月的回收，Seshagiri等人Ara J Primatol 29: 81-91， 1993。來自絨猴的胚胎收集也得到充分證明 (Thomson 等人 "Non-surgical uterine stagepreimplantation embryo collection from the common marmoset,"J Med Primatol， 23: 333-336 ( 1994 ))。此處，通過短暫暴露于鏈霉蛋白酶(Sigma)從胚泡中去除透明帶。對于免疫外科，胚泡暴露于在DMEM中1: 50稀釋的兔抗絨猴脾細胞抗血清(用于絨猴胚泡)或1: 50稀釋的兔抗恒河猴(用于恒河猴胚泡)30分鐘，隨后在DMEM中洗滌5分鐘3次，隨后暴露于1: 5稀釋的豚鼠補體(Gibco) 3分鐘。
在DMEM中進一步洗滌2次后，通過輕輕吸液從完整的內細胞團(ICM)中去除裂解的滋養(yǎng)外胚層細胞，并且使ICM在小鼠滅活的(3000拉德Y輻射)胚胎成纖維細胞上鋪平板。7-21天后，用在立體顯微鏡下的直接觀察用微量吸管從內胚層長出中取出ICM衍生的團，暴露于補充有1%雞血清的0. 05%Trypsin-EDTA (Gibco) 3-5分鐘，并且經 由火焰拋光的微量吸管通過輕輕吸液而輕輕分離。
將分離的細胞再次鋪平板在新鮮的ES培養(yǎng)基中的胚胎銅養(yǎng)層上， 并且就菌落形成進行觀察。個別選擇證實ESC樣形態(tài)的菌落，并且如 上所述再次分開。ESC樣形態(tài)定義為具有高核質比和顯著核仁的致密 菌落。隨著培養(yǎng)物變得密集，所產生的ESCs隨后每1-2周通過短暫胰 蛋白酶消化或暴露于達爾伯克磷酸鹽緩沖鹽水(不含鉤或鎂并且含2 inM EDTA)進行常規(guī)分離。早期傳代細胞也在液氮中進行冷凍且貯存。
在某些實施方案中，利用臍帶血干細胞或臍帶基質干細胞。此種 干細胞的來源是本領域已知的。Brunstein等人，Br. J. Haematol. 137 (1) : 20-35 ( 2007 ) ; Sun等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 354 ( 4 ) : 919-23 ( 2007 ) ; McGuckin等人，Acta Neurobiol. Exp. 66 ( 4 ): 321-9 ( 2006 ); Riodan等人，Transl. Med. 30: 5-8 ( 2007 ); Weiss等人，Stem Cell Rev. 2 ( 2 ): 155-62 ( 2006 )。
在某些實施方案中，將上文描述的報道基因構建體引入所需細胞 系內。本發(fā)明不受引入方法的限制。在某些優(yōu)選實施方案中，報道基 因構建體通過電穿孔引入所需千細胞系內。在某些實施方案中，所采 用的條件在下文實施例2中描述。在某些優(yōu)選實施方案中，電穿孔在 低電壓和低電容的條件下進行。在某些優(yōu)選實施方案中，電壓為約 150V-約350 V，并且最優(yōu)選約250 V。在某些優(yōu)選實施方案中，電容 為約150-350 iaF,優(yōu)選約250 pF。在某些實施方案中，干細胞系 在電穿孔前無需祠養(yǎng)細胞進行培養(yǎng)。在某些實施方案中，在電穿孔后， 干細胞系在飼養(yǎng)細胞系優(yōu)選小鼠胚胎成纖維細胞上鋪平板。在某些實 施方案中，干細胞系在電穿孔優(yōu)選AccutaseT"后用酶進行收獲。電穿 孔后，在優(yōu)選實施方案中，使用抗生素優(yōu)選G418選擇包含報道基因構 建體的克隆。在優(yōu)選實施方案中，G418為約50-200 )ag/ml的劑量。
在優(yōu)選實施方案中，將報道基因構建體引入在未分化的干細胞中 不表達的基因內。如下文實施例中所述，報道基因在未分化的千細胞 中不表達的事實使克隆的選擇和細胞系的發(fā)育變得復雜，所述細胞系正確表達報道基因，因為細胞在鑒定報道基因的表達前必須進行誘導 以分化。認為例示的人類干細胞系是第一種人類干細胞系，以包含在 未分化的干細胞中不表達的基因中的乾向插入。本文描述的方法可以 用于靶向在未分化的干細胞中不表達的其他所需基因。在優(yōu)選實施方 案中，本發(fā)明的細胞系仍是多能或全能的，具有正常核型，并且允許 通過例如熒光顯微鏡檢查或熒光激活細胞分選的方法顯現報道基因。 在優(yōu)選實施方案中，報道基因的表達充當用于使細胞分化成特定細胞
類型的標記。在優(yōu)選實施方案中，當靼向01ig2時，標記基因的表達 在分化成運動神經元和少突膠質細胞的過程中發(fā)生。 C.細胞系的使用
本發(fā)明的細胞系具有各種用途。特別地，本發(fā)明的細胞系用于篩 選對于調節(jié)人類干細胞分化成所需細胞類型例如少突膠質細胞和運動 神經元有用的化合物，用于鑒定在細胞類型例如運動神經元和少突膠 質細胞的再生或生長中可能有用的化合物，從而使得可以治療脊髓損 傷和中樞神經系統的疾病或病癥，并且用于篩選神經毒性的化合物。
因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選測定法。本發(fā)明的 篩選方法利用包含插入目的基因座例如olig2基因座內的報道基因的 干細胞系。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選化合物的方 法，所述化合物改變(例如阻斷或觸發(fā))插入目的基因座內的報道基 因的表達?；衔锘蛟噭┛赡芮_轉錄，通過例如與包含在目的基因 座內的基因的啟動子區(qū)相互作用。備選地，化合物或試劑可能干擾其 為目的基因座的生物活性的上游或下游的途徑。
在一種篩選方法中，候選化合物就其影響插入目的基因座內的報 道基因的表達的能力進行評估。在優(yōu)選實施方案中，目的基因座中的 基因是在未分化的干細胞中不表達的基因。在某些實施方案中，候選 化合物對目的基因座中的基因表達的影響通過檢測包含報道基因構建 體的細胞的熒光水平進行測定。在其他實施方案中，mRNA表達可以通 過任何合適的方法進行檢測。
特別地，本發(fā)明提供了用于鑒定調節(jié)劑即候選或測試化合物或試
19劑(例如蛋白質、肽、擬肽、類肽、小分子或其他藥物)的篩選方法， 所述調節(jié)劑與插入的報道構建體上游的啟動子結合，或者與結合插入 的報道構建體上游的啟動子的蛋白質或蛋白質的表達相互作用，其對 例如插入的報道構建體的表達具有抑制(或刺激)作用。因此鑒定的 化合物可以用于在治療方案中直接或間接調節(jié)靼基因產物(例如
01ig2)的活性，以闡述靶基因產物的生物功能，或鑒定破壞正常耙基 因相互作用的化合物。例如調節(jié)01 ig2的活性或表達的化合物在與中 樞神經系統的功能相關的疾病治療中有用，并且對于在治療對于運動 神經元和少突膠質細胞的損傷中有用。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選候選物或測試化合物 的測定法，所述候選物或測試化合物改變目的基因例如01 ig2的表達， 所述基因在特定細胞類型例如運動神經元或少突膠質細胞的分化過程 中表達。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選候選物或測試 化合物的測定法，所述候選物或測試化合物與蛋白質結合，或調節(jié)蛋 白質的活性，所述蛋白質改變目的基因例如01ig2的表達。
眾多方法中的任何來獲得:包括生物文庫；類肽文庫(具有肽的功能
性，但具有新的、非肽主鏈的分子的文庫，所述分子對酶促降解有抵 抗力但仍保留生物活性；參見例如，Zucke腿nn等人，J. Med. Chem. 37: 2678-85 [1994]);可空間尋址的平行固相或液相文庫；需要重 疊合法的合成文庫方法；'單珠單化合物，文庫方法；和使用親和層 析選擇的合成文庫方法。生物文庫和類肽文庫方法優(yōu)選與肽文庫一起 使用，而其他4種方法可應用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文 庫(Um ( 1997 ) Anticancer Drug Des. 12: 145)。
用于合成分子文庫的方法的例子可以在本領域中發(fā)現，例如在下 述中DeWitt等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 [1993]; Erb等人，Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91: 11422 [1994]; Zuckermann 等人，J. Med. Chem. 37: 2678 [1994]; Cho等人，Science 261: 1303 [1993]; Carrell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33. 2059
20[1994]; Carell等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 [1994〗;和Gallop等人，J. Med. Chem. 37: 1233 [1994]。
化合物的文庫可以存在于溶液中(例如Houghten， Biotechniques13: 412-421 [1992])、或在珠(Lam， Nature 354: 82-84 [1991])、芯片(Fodor， Nature 364: 555-556 [1993])、細菌或孢子(美國專利號5， 223， 409;通過引用合并入本文)、質粒(Cul 1等人，Proc.Nad. Acad. Sci. USA 89: 18651869 [1992])上、或在嗟菌體上(Scott和Smith, Science 249: 386-390 [1990]; Devlin Science 249: 404-406[1990〗；Cwirla等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990];Felici， J. Mol. Biol. 222: 301 [1991])。
在一個實施方案中，測定法是基于細胞的測定法，其中使表達插入目的基因座內的報道基因的細胞與測試化合物接觸，并且測定測試化合物調節(jié)報道基因的表達的能力。測定測試化合物調節(jié)報道基因表達的能力可以通過監(jiān)控例如熒光、發(fā)光、顏色等中的變化來完成。合適的監(jiān)控方法包括但不限于，焚光激活細胞分選(FACS)和熒光顯微鏡檢查。
在某些其他實施方案中，本發(fā)明的細胞用于毒性測試。在某些實施方案中，使本發(fā)明的細胞與懷疑是毒素的化合物接觸，并且報道基因的表達得到修飾。在某些優(yōu)選實施方案中，化合物懷疑是神經毒素。
在某些實施方案中，本發(fā)明的細胞在高流通量篩選測定法中使用。在某些實施方案中，高流通量篩選測定法用于鑒定潛在藥物。在某些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的細胞用于篩選藥物，所述藥物對于治療神經學病狀有用，或對于治療中樞神經系統的組分例如運動神經元和少
突膠質細胞的損傷有用。
在進一步的實施方案中，本發(fā)明的細胞用于監(jiān)控在靶細胞類型的分化過程中對固有或外源性因子的應答。在某些優(yōu)選實施方案中，靶細胞類型是運動神經元或少突膠質細胞。在某些實施方案中，本發(fā)明的細胞用于鑒定用于開發(fā)所需細胞類型的細胞的優(yōu)化條件，所述細胞類型例如運動神經元或少突膠質細胞。實施例 實施例1
h01 ig2-BGFP敲入載體的產生 包含01ig2基因的人BAC克隆購自Invitrogen (目錄# RP1 l-585DO。使用同源重組在DH5a中構建靶向載體。M)lig2的翻譯起 始密碼子命名為+1位置自始至終用于描述01ig2基因。為了產生乾向 構建體，pENTRla (Invitrogen)進行修飾以在DH5 ot中作為低拷貝質 粒生長，再命名為pStartK，并且用作模板以擴增在attLl和attL2 外的片段。引物包含與h01ig2的側翼序列同源的2個突出端，從而使 得當這個PCR產物轉化成ET感受態(tài)的h01ig2 BAC時，由于如由氨千 青霉素選擇的同源重組，全長h01ig2基因以及其 2kb上游和其~ 5. 3kb下游序列拉出到pStartK內。所產生的質粒命名為 pStartK-h01ig2，并且它的序列通過限制測序進行驗證。隨后，擴增 包含h01ig2外顯子2 (分別為-19至+30和+976至+1025 )的總共100 bp同源臂、2個Ascl位點和cat (編碼氯霉素的基因)的片段，并且 與pStartK-h01ig2—起共轉染到ET感受態(tài)的DH5 ot內，尋求由 替換h01ig2外顯子2，并且所產生的質粒通過氯霉素和氨節(jié)青霉素進 行選擇。陽性質粒通過部分測序進行驗證，并且命名為 pStartK-h01ig2cam。 pStartK-h01 ig2cam隨后通過Ascl進《亍消化， 并且使EGFP-新霉素片段純化且連接到pStartK-h01ig2cam內，產生 pStartK-h01ig2eGFP，其中由編碼EGFP和新霉素的序列交換(新 霉素的表達由RNAPol II啟動子驅動)。為了給這種載體添加陰性選 擇位點，使pStartK-固ig2eGFP與基因通道(Invitrogen)質粒一 起溫育，所述質粒包含attRl和attR2位點以及Tk2——胸苷激酶基 因。與克隆酶(clonase ) ( Invitrogen ) —起溫育后，h01ig2eGFP 片段經由LR重組進行交換，并且與TK2基因連接。最終構建體通過氨 節(jié)青霉素進行選擇，并且命名為pWSTK3-hOUg2eGFP。當遞送到hESCs 內時，僅同源重組將具有切割的TK2基因，并且在陰性選擇藥物6-TG或FIAU下存活。靶向載體的序列在圖2中提供(SEQ ID NO: 2)。
實施例2
在人類胚胎干細胞系BG01中產生01ig2-GFP敲入克隆使BGOl hESC系維持在hESC培養(yǎng)基中的絲裂霉素C (Sigma)滅活的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF )層上，所迷hESC培養(yǎng)基包含DMEM-F12、20°/。敲除血清、1%非必需氨基酸、55 mM 2-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺(上述全部來自Invitrogen),補充有4 ng/ml堿性FGF( Peprotech )，或在用MEF條件化的培養(yǎng)基中在Matrigel ( BD Biosciences )包被的皿上24小時。
為了產生01ig2-GFP報道KI系，使用accutase (Sigma)分離總共5xl 06至lxl 07 BG01細胞，并且與30 jj g線性化pWSTK3-h01 ig2eGFP
(靶向載體)一起溫育。DNA和細胞的混合物隨后轉移至4mm比色杯，并且使用Bio-Rad Xcell Total系統以250V， 250 /a F的單脈沖進行電穿孔。將電穿孔的細胞鋪平板在MEF層上用于恢復。轉染后72小時，每天將G418(50 ing/ral用于前3-4天，并且在l周后增至200 " g/ml
(Invitrogen)和FIAU (125 nM， Maravek Biochmicals)力口入培養(yǎng)基中。在雙重選擇21天后人工挑選抗性克隆，并且鋪平板在MEF飼養(yǎng)層或Matrigel包被的皿上用于進一步擴增。
DNA印跡分析用于鑒定乾向克隆。如上所述獲得總共106克隆，由其提取基因組DNA。通過DM印跡分析，使來自每個克隆的HindIII消化的基因組DNA與衍生自同源臂的5，的探針雜交。證實6個克隆正確靼向01ig2位點。01ig2-GFP敲入hESCs的陽性克隆維持在包含100-200 mg/ml G418的hESC培養(yǎng)基中。細胞進行常規(guī)核分型(CellLine Genetics, Madison, WI)。在對于運動神經元和少突膠質細胞形成有利的條件下，在分化17天后GFP陽性細胞在熒光顯微鏡檢查下可見。
對于分化研究，0Hg2-GFP敲入克隆維持在hESC培養(yǎng)基中，并且通過使用膠原酶IV (1 mg/ml， Invitrogen)進行分離。細胞進4亍研磨以制備小團塊，其隨后轉移至Ultralow附著皿(Corning)以形成EBs。 EBs在MDFK培養(yǎng)基(DMEM-F12、 5%敲除血清、lx ITS-X、 1%非必需氨基酸、55 mM 2-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺，全部來自Invitrogen)中懸浮培養(yǎng)5天。通過每隔一天添加2juM全反式視黃酸
(RA， Sigma)和30 nM重組音猥(Shh， MD systems)，進一步誘導EBs以表達01ig2-GFP，共另外10-20天。隨后通過執(zhí)行01 ig2抗體染色的免疫細胞化學，在熒光顯微鏡下就GFP的表達以及01ig2和GFP的共標記檢查由這些01ig2-GFPKI克隆產生的EBs。
實施例3人類胚胎干細胞的轉染由于細胞的生長習性，人類胚胎干細胞(hESCs)難以轉染。與可以由單個細胞生長的小鼠干細胞相反，hESCs趨于以團塊生長并且一般難以由單個細胞形成。hESCs中的同源重組看起來非常難以達到，因為迄今在hESCs中僅已靶向2種基因，0ct4和HPRT。這2種基因在hESCs中表達，這幫助選擇轉化林，即使當轉化率很低時。即使具有這個優(yōu)點，用hESCs的結果與小鼠ESCs形成顯著對比，其中已通過同源重組成功靶向數百種基因。Yates和Daley, Gene Ther. 13 (20):1431-9 ( 2006 ),報告HR (同源重組)在hESCs中(與mESCs比較)仍未廣泛采用，并且迄今僅存在3個HR靶向的hESCs系(2個HPRT系和1個0ct4系)。該不良結果部分由于在將DNA轉染到hESCs中遇到的主要困難。Zwaka和Thomson, Nat Biotechnol. 21(3): 319-21
(2003 ),報告盡管關于0ct4和HPRT1基因的靶向頻率類似于在mESCs中獲得的結果，但重要的是確定在人和mESCs之間的這個比率的相似性對于在ESCs中不表達的基因是否適用。
迄今，仍未粑向在hBSCs中不表達的基因，除本文描述的工作外。為了克服在靶向在hESCs中不表達的基因中固有的困難，采用幾種方法以優(yōu)化轉染率和乾向率。這些方法包括化學轉染，包括脂質介導的轉染試劑，例如Lipofectamine 2000和FuGene， Amaxa核因子(核穿孔(nucleoporation))和電穿孔(Bio-Rad Xcell總系統)?；瘜W轉染和核穿孔都不產生任何靶向克隆。隨后利用優(yōu)化的電穿孔條件，并且在8個電穿孔循環(huán)后導致具有約l(T8 - 10—7的轉染率的6個耙向克隆。
測試下述參數
培養(yǎng)方法必須確定hESCs應在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF )飼養(yǎng)者上還是在不含飼養(yǎng)細胞的基質上生長。發(fā)現在電穿孔前不與飼養(yǎng)者一起培養(yǎng)并且在電穿孔后鋪平板在MEFs層上的hESCs給出最高轉染率以及靶向率。這個結果先前未得到報告。
細胞收獲還必須確定應使用何種方法以在電穿孔前收獲細胞。測試了許多不同酶，包括胰蛋白酶(分離細胞的最常用的酶-這也是用于傳代小鼠ESCs的酶)、膠原酶IV(通常用于hESC傳代)和Accutase 。導致靶向克隆的使用的唯一酶是accutase。
電穿孔條件還必須測試不同電穿孔條件。測試了 5種條件800V,lOmF; 250V， 250raF; 500V， 500 mF; 250V， 250 mF; 320V， 200 mF。在這些中，通常對于小鼠ESCs起作用的高電壓例如800V,或高電壓高電容例如500V, 500 mF在hESCs中不起作用。然而，低電壓和低電容例如250V, 250mF給出最高轉染率和靶向率。事實上，所有靶向克隆得自使用較低電壓和低電容的電穿孔。
用于藥物選擇的劑量還必須確定用于選擇靶克隆的合適劑量。此處再次，對于小鼠ESCs起作用的劑量(例如500-1000 ja g/ml G418 )對于hESCs不起作用(對于G418選擇，使藥物劑量從50逐步增加到200 pg/ml)。較高的藥物濃度殺死所有hESCs。
擴增且維持轉染克隆還必須開發(fā)方法用于擴增且維持轉染克隆。發(fā)現酶促和人工剝離的組合對于獲得且維持轉染克隆最佳。
權利要求
1.包含靶向進入基因內的報道基因的人類干細胞，所述基因在分化前在所述人類干細胞中不表達。
2. 權利要求1的人類干細胞，其中所述人類干細胞是胚胎千細胞。
3. 權利要求1的人類干細胞，其中所述報道基因靶向進入olig2 l因座內。
4. 權利要求1的人類干細胞，其中所述報道基因編碼熒光蛋白質。
5. 權利要求1的人類干細胞，其中所述熒光蛋白質選自綠色熒光 蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白。
6. 權利要求1的人類干細胞，其中所述報道基因通過同源重組靶向。
7. 分離的干細胞系，其包含權利要求1的人類干細胞。
8. 體外細胞培養(yǎng)物，其包含權利要求1的人類干細胞。
9. 生物體，其包含權利要求1的人類干細胞。
10. 組織，其包含權利要求1的人類千細胞。
11. 篩選化合物的方法，其包括a) 提供包含靶向進入基因內的報道基因的人類千細胞，所述基因 在分化前在所述人類干細胞中不表達；b) 使所述人類干細胞與所述至少一種化合物接觸；c) 培養(yǎng)所述人類干細胞；和d) 就所述報道基因的表達測定所述人類千細胞。
12. 權利要求11的方法，其中所述測定通過選自熒光顯微鏡檢查 和熒光激活細胞分選的方法來執(zhí)行。
13. 權利要求11的方法，其中所述培養(yǎng)包括在這樣的條件下培養(yǎng) 所述人類千細胞，使得允許所述人類干細胞分化。
14. 權利要求11的方法，其中提供了多個細胞，并且所述接觸步 驟包括在高流通量測定法中使所述多個細胞與化合物文庫接觸。
15. 權利要求11的方法，其中所述化合物選自蛋白質、肽、多肽和小有機化合物。
16. 權利要求ll的方法，其中所述人類干細胞是胚胎干細胞。
17. 權利要求ll的方法，其進一步包括選擇化合物的步驟。
18. 權利要求17的方法，其進一步包括在人類動物中測試所述化 合物的步驟。
19. 權利要求18的方法，其進一步包括包裝所述化合物用于在動 物中使用的步驟。
20. 篩選神經毒素的方法，其包括提供a) 提供包含插入01ig2基因座內的報道基因的人類干細胞；b) 使所述人類干細胞與懷疑是神經毒素的所述至少 一種化合物接 觸^ 和c) 就所述報道基因的表達測定所述人類干細胞。
21. 權利要求20的方法，其中所述測定通過選自熒光顯微鏡檢查和熒光激活細胞分選的方法來執(zhí)行。
22. 權利要求20的方法，其中所述人類干細胞是胚胎干細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含靶向基因構建體的人類干細胞系，并且特別涉及包含經由同源重組插入Olig2基因座內的報道基因的人類胚胎干細胞系(hESC)。hESC系仍是多能的，并且維持正常核型，并且允許通過熒光顯微鏡檢查和通過FACS的分選顯現Olig2。因為Olig2在運動神經元和少突膠質細胞的發(fā)育中是重要的，所以本發(fā)明提供了研究干細胞分化成運動神經元和少突膠質細胞，以及研究影響此種分化的固有和外源性因子的方法。本發(fā)明的hESCs還提供了研究和測定用于細胞分化的優(yōu)化因子和條件的方法。
文檔編號C12N5/10GK101679952SQ200880015613
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權日2007年3月28日
發(fā)明者曾憲敏 申請人:巴克老年研究所