本發(fā)明涉及溶血磷脂酸作為生物標(biāo)志物在制備檢測子宮內(nèi)膜異位癥的診斷試劑或檢測物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆粘膜以外部位的一種持續(xù)性病變疾病。EMs在育齡期婦女的發(fā)病率約為10％，且有明顯上升趨勢，80％的EMs伴有盆腔疼痛，50％合并不育，是嚴(yán)重影響婦女健康的常見病和多發(fā)病。目前，臨床上EMs治療方法主要有藥物治療、手術(shù)治療以及兩者治療相結(jié)合的方法，其中，腹腔鏡手術(shù)切除病灶是首選的治療方法，然而此方法復(fù)發(fā)率較高，有報(bào)道稱，其三年復(fù)發(fā)率為7～30％，五年復(fù)發(fā)率甚至高達(dá)50％，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

目前診斷EMs的手段主要包括臨床癥狀診斷、生化指標(biāo)診斷、影像學(xué)超聲檢查、核磁共振成像檢查等。EMs的典型臨床癥狀包括痛經(jīng)、骨盆痛、性交疼和不育，但其他疾病如過敏性大腸綜合征和盆腔炎也會有類似癥狀，而且EMs的異位程度與其所表現(xiàn)的疼痛癥狀嚴(yán)重程度相關(guān)性較差，使得根據(jù)臨床癥狀診斷EMs存在一定的局限性。美國生殖醫(yī)學(xué)會報(bào)告顯示根據(jù)臨床癥狀診斷III期和IV期EMs具有較好的準(zhǔn)確性，而對于I期和II期EMs的診斷準(zhǔn)確性較差。目前臨床上常采用癌相關(guān)抗原CA125作為EMs的生化診斷手段，但很多I期EMs患者的CA125的水平并未升高，而且CA125在許多其他婦科疾病如卵巢癌、子宮肌瘤等均有升高，因此CA125作為EMs診斷標(biāo)志物的特異性和敏感性不高。影象超聲對于卵巢EMs囊腫具有很好的診斷能力，但難以診斷腹膜EMs和EMs相關(guān)的粘連。常規(guī)的陰道檢查也并不能準(zhǔn)確診斷EMs，因?yàn)楹芏郋Ms患者進(jìn)行陰道檢查時并未發(fā)現(xiàn)異常。目前EMs診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是創(chuàng)傷性的外科手段，即腹腔鏡手術(shù)。歐洲EMs學(xué)會對7025例EMs患者進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示65％的患者在出現(xiàn)EMs相關(guān)癥狀后第一次就診時被誤診為其它疾病，46％的EMs患者在確診之前至少找過5個醫(yī)生就診，這7025名EMs患者從出現(xiàn)癥狀到確診的平均時間長達(dá)8年。Hadfield等調(diào)查顯示美國和英國EMs患者從開始出現(xiàn)癥狀到確診的延遲時間分別為11.7和8.0年。因此，尋找特異性和敏感性均高的EMs生物標(biāo)志物，建立無創(chuàng)的診斷模型，可以對EMs患者進(jìn)行早期診斷及時治療控制病情，同時可以用于治療后的監(jiān)測。目前常見血液學(xué)生物標(biāo)志物見表1。

表1目前子宮內(nèi)膜異位癥常見血清生物標(biāo)志物

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是脂質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物，可介導(dǎo)廣泛的生物效應(yīng)，被稱為多功能的“磷脂信使”。LPA通過其G蛋白偶聯(lián)受體(lysophosphatidic acid receptor,LPAR)激活多條信號通路而產(chǎn)生諸多細(xì)胞生理反應(yīng)，參與調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動、增殖、凋亡、分化、侵襲、分泌等多種細(xì)胞機(jī)能。目前可以確認(rèn)至少有6種LPA受體，分別為LPAR1(EDG2)、LPAR2(EDG4)、LPAR3(EDG7)、LPAR4(GPR23)、LPAR5(GPR92)和LPAR6。其中LPAR1-3為內(nèi)皮分化基因受體家族成員，具有50-57％同源氨基酸系列，他們與LPA具有高度的親和力，是目前研究最多的LPA受體。最新研究報(bào)道P2Y10、P2Y10和GPR87可能為LPA受體，有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。LPA與受體結(jié)合后主要通過以下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用：(1)Gi-CAMP途徑：可以抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，使得細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；(2)Gq-PLC途徑：可激活磷脂酶C(PLC)，形成三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)，引起暫時性的鈣離子濃度升高和蛋白激酶C(PKC)激活；(3)Gi-Ras/Raf-MAPK途徑：LPA可激活Ras、Raf，從而激活Raf/MAPK激酶級聯(lián)，引起細(xì)胞分裂增殖；(4)Rho信號途徑：LPA通過G12/13蛋白激活Rho信號通路，發(fā)揮重建細(xì)胞骨架，改變細(xì)胞形態(tài)等作用；(5)PPARγ途徑。LPAR在人體正常組織中普遍表達(dá)，隨后研究發(fā)現(xiàn)LPAR與腫瘤、心腦血管等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究表明LPA參與調(diào)控了許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。Wang等研究發(fā)現(xiàn)LPA可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A增值、侵襲、遷移以及MMP-7和uPA的表達(dá)和分泌，表明LPA是子宮內(nèi)膜癌微環(huán)境中的一個重要生物活性調(diào)節(jié)因子。Seo H等研究了豬和牛子宮中LPA信號通路、COX-2和PGs的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)LPA可以刺激豬子宮內(nèi)膜COX-2的分泌，表明LPA在維持子宮內(nèi)膜的功能中發(fā)揮了重要作用；而在牛的子宮中，LPA由子宮內(nèi)膜產(chǎn)生和釋放，LPA可以誘導(dǎo)孕酮和PGE₂的分泌并增加PGE₂/PGF_2α的比例，而這種作用可以被LPAR1和3受體拮抗劑Ki16425所抑制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LPA通過上調(diào)PGE₂合成酶活性使得子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞PGE₂和COX-2分泌增多，表明LPA信號通路在調(diào)控牛的妊娠和生育能力中發(fā)揮著重要作用。與正常者相比，卵巢癌患者血清和腹水中LPA水平顯著升高，LPA可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)浸潤、轉(zhuǎn)移和耐藥等，LPA可以通過COX-2介導(dǎo)MMP蛋白前體的表達(dá)和活化，降解基底膜，有利于癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，上調(diào)細(xì)胞表面的FasL表達(dá)，誘導(dǎo)激活淋巴細(xì)胞凋亡，有利于癌細(xì)胞的免疫逃逸；誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管腫瘤的形成。研究表明LPA受體LPAR2和LPAR3在卵巢癌中高表達(dá)，而在正常的卵巢細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。研究表明LPA可以通過NF-κB途徑作用于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的LPAR1受體而誘導(dǎo)IL-8的分泌，而IL-8作為前血管生成因子，通過受體結(jié)合直接參與血管生成的調(diào)節(jié)。綜上所述，雖然溶血磷脂酸LPA參與調(diào)控了許多疾病的發(fā)生和發(fā)展，但目前尚無有關(guān)LPA在子宮內(nèi)膜異位癥診斷治療中價值和應(yīng)用前景的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明公開了溶血磷脂酸的一種新用途——作為生物標(biāo)志物在制備檢測子宮內(nèi)膜異位癥的診斷試劑或檢測物中的應(yīng)用。同時，本發(fā)明還提供了一組用于檢測子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

溶血磷脂酸作為生物標(biāo)志物在制備檢測子宮內(nèi)膜異位癥的診斷試劑或檢測物中的應(yīng)用，所述溶血磷脂酸選自以下六種溶血磷脂酸中的任一種或任意幾種的組合：18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA；18:0LPA。

所述18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA；18:0LPA均為LPA的亞型，其含義為：N1:N2LPA，其中，N1指脂肪酸碳鏈含碳原子個數(shù)，N2為脂肪酸碳鏈碳碳雙鍵數(shù)，圖3為18:0LPA及18:2LPA的結(jié)構(gòu)式示例。

優(yōu)選的，所述溶血磷脂酸為以下六種溶血磷脂酸：18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA；18:0LPA。

優(yōu)選的，所述診斷試劑或?yàn)檠涸\斷試劑。

進(jìn)一步地，具體應(yīng)用時，檢測人血漿中溶血磷脂酸水平，可采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。

進(jìn)一步地，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中六種LPA濃度水平后，進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，如主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。

一組用于檢測子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物，由以下六種溶血磷脂酸組成：18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA；18:0LPA。

本發(fā)明采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定了子宮內(nèi)膜異位癥患者和正常對照者血漿中六種LPA(18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA)的水平，結(jié)果表明子宮內(nèi)膜異位癥患者血漿中這六種LPA濃度水平顯著高于正常對照者。因此，這六種LPA可以作為子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物，用于制備檢測子宮內(nèi)膜異位癥的診斷試劑或檢測物，且這六種LPA作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物的靈敏度和特異性分別達(dá)到92％和86％，均顯著高于目前子宮內(nèi)膜異位癥已有的血液學(xué)生物標(biāo)志物。本發(fā)明將溶血磷脂酸作為生物標(biāo)志物用于子宮內(nèi)膜異位癥的檢測，檢測結(jié)果可作為臨床診斷的依據(jù)，具有重要的醫(yī)學(xué)價值。

附圖說明

圖1a：采用6種LPA水平作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物用于區(qū)分診斷子宮內(nèi)膜異位癥和對照的PLS-DA圖(二維圖)。

圖1b：采用6種LPA水平作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物用于區(qū)分診斷子宮內(nèi)膜異位癥和對照的PLS-DA圖(三維圖)。

圖2：置換次數(shù)為1000次下的置換檢驗(yàn)分析圖，其中，A為分離距離，B為預(yù)測準(zhǔn)確度。

圖3：18:0LPA及18:2LPA的結(jié)構(gòu)式示例。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。

實(shí)施例1

在得到江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者知情同意后，用EDTA管子收集江西省婦幼保健院確診子宮內(nèi)膜異位癥患者(30-42歲)和無子宮內(nèi)膜異位者(對照組)(30-42歲)血液各30份，室溫1,750×g離心15分鐘，得到血漿。參照文獻(xiàn)方法(J Chromatogr B Analyt Technol Biomed and Life Sci.2008；864(1-2):22-28.)進(jìn)行樣品處理并采用高校液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定六種LPA(18:2LPA；16:0LPA；20:4LPA；18:1LPA；22:6LPA)的水平。

三重四極桿離子肼復(fù)合質(zhì)譜儀為美國AB SCIEX公司，液相色譜為日本Shimadzu公司，LPA標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)準(zhǔn)品購于Avanti Polar Lipids公司。掃描模式為MRM，監(jiān)測離子對為[¹³C₁₆]16:0LPA：m/z 425→153,22:6LPA：m/z 481→153,22:4LPA：m/z 457→153,18:0LPA：m/z 437→153,18:1LPA：m/z 435→153,18:2LPA：m/z 433→153,16:0LPA：m/z 409→153。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析和置換分析。

結(jié)果如表2、圖1、圖2所示，從表2中可以看出，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中LPA濃度水平顯著高于對照者血清中的LPA濃度水平。從圖1和圖2中可以看出，六種LPA可以作為子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物，且這六種LPA作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物的靈敏度和特異性分別達(dá)到92％和86％，靈敏度和特異性高于目前已有的子宮內(nèi)膜異位癥血液生物標(biāo)志物。圖1是模型，圖2是表明此聯(lián)合生物標(biāo)志物的模型具有很好的特異性和靈敏度。

表2子宮內(nèi)膜癥患者與對照者LPA水平對比表

上述結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者血漿中六種LPA濃度水平顯著高于正常對照者，六種LPA可以作為子宮內(nèi)膜異位癥的生物標(biāo)志物。且這六種LPA作為聯(lián)合診斷標(biāo)志物的靈敏度和特異性分別達(dá)到92％和86％，均顯著高于目前子宮內(nèi)膜異位癥已有的血液學(xué)生物標(biāo)志物。

上述雖然結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。