本發(fā)明公開(kāi)了一種基于結(jié)構(gòu)照明和熒光數(shù)字全息術(shù)的超分辨率熒光數(shù)字全息三維斷層成像系統(tǒng)和方法，屬于熒光數(shù)字全息與超分辨率成像技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

數(shù)字全息術(shù)作為一種干涉成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)相干照明樣品圖像的三維數(shù)值重建或定量相襯成像。數(shù)字全息顯微技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的具體研究中。在實(shí)際成像應(yīng)用時(shí)，與傳統(tǒng)的顯微成像技術(shù)相比，數(shù)字全息顯微術(shù)具有快速、實(shí)時(shí)、三維和高精度等優(yōu)點(diǎn)。熒光數(shù)字全息術(shù)的出現(xiàn)，解決了傳統(tǒng)數(shù)字全息術(shù)對(duì)照明光源相干性的依賴，將數(shù)字全息顯微技術(shù)拓展至空間非相干成像領(lǐng)域。通過(guò)利用光的空間自相干特性，熒光數(shù)字全息技術(shù)中使用空間光調(diào)制器等器件對(duì)樣品發(fā)出的光波進(jìn)行分光和相移等操作，再利用圖像采集器件記錄全息圖，通過(guò)計(jì)算機(jī)中的數(shù)值算法對(duì)全息圖進(jìn)行處理,最終可實(shí)現(xiàn)熒光樣品不同深度處圖像的三維重建。熒光數(shù)字全息術(shù)雖然具有三維成像能力，但樣品內(nèi)某一深度處的成像結(jié)果更容易受到來(lái)自樣品其它深度發(fā)出熒光的影響，即光學(xué)斷層成像能力較差。將熒光數(shù)字全息技術(shù)與共聚焦顯微等技術(shù)結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)樣品的高分辨率光學(xué)斷層成像。然而，為了實(shí)現(xiàn)樣品信息的三維重建，現(xiàn)有大多數(shù)類似研究中，依然需要對(duì)樣品進(jìn)行二維或三維掃描，系統(tǒng)的采集速度較慢。且共焦技術(shù)中照射到樣品上的聚焦光斑具有較高的能量密度，容易導(dǎo)致熒光蛋白或染料的光漂白。

結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)是一種主要應(yīng)用與寬場(chǎng)熒光顯微領(lǐng)域的超分辨率成像技術(shù)。傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)照明顯微術(shù)中，一般利用激光照明光柵或空間光調(diào)制器等器件，進(jìn)而在樣品上產(chǎn)生條紋狀的強(qiáng)度周期分布激發(fā)光。激發(fā)出的熒光具有類似的周期性強(qiáng)度分布，而后通過(guò)成像系統(tǒng)和圖像探測(cè)器探測(cè)該熒光信號(hào)，并結(jié)合數(shù)值算法在計(jì)算機(jī)中重構(gòu)超分辨率的熒光樣品圖像。通過(guò)該方法獲取的往往只是二維的超分辨率圖像，缺乏樣品的三維信息。通過(guò)結(jié)構(gòu)光斷層重建算法，可以從結(jié)構(gòu)光顯微獲取的原始數(shù)據(jù)中重構(gòu)樣品的光學(xué)斷層成像結(jié)果。但是，重建出的光學(xué)斷層結(jié)果的分辨率至多等于衍射極限分辨率，即不能實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。結(jié)合多光束干涉技術(shù)，可以產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的激發(fā)光照明樣品。利用精密壓電平移臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行深度方向掃描并記錄一系列樣品不同深度處的熒光圖像，對(duì)圖像進(jìn)行三維數(shù)值運(yùn)算后能夠?qū)崿F(xiàn)熒光樣品圖像的三維超分辨率重構(gòu)。但是，該方法的掃描過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，記錄的數(shù)據(jù)量較大，涉及的數(shù)值運(yùn)算量大且耗時(shí)較長(zhǎng)。因而不適合動(dòng)態(tài)樣品成像或樣品內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程的觀察。

為了解決上述局限，本發(fā)明將三維結(jié)構(gòu)照明顯微和熒光數(shù)字全息術(shù)相結(jié)合，公開(kāi)了一種超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)與方法。與現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)或熒光數(shù)字全息術(shù)相比，本發(fā)明提出的系統(tǒng)和方法能夠?qū)崿F(xiàn)熒光樣品的寬場(chǎng)超分辨率光學(xué)斷層三維成像。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了在現(xiàn)有結(jié)構(gòu)照明顯微中結(jié)合熒光數(shù)字全息技術(shù)，實(shí)現(xiàn)超分辨率的光學(xué)斷層成像并提高成像速度，本發(fā)明提供了一種超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)與方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，包括光路連接放置的激光器(1)、光纖(2)、準(zhǔn)直透鏡(3)、I空間光調(diào)制器(4)，第一透鏡(5)、二向色鏡(6)、第二透鏡(7)、第三透鏡(8)、反射鏡(9)、顯微物鏡(10)、第四透鏡(12)、樣品(11)、分束棱鏡(13)、II空間光調(diào)制器(14)、圖像采集器(15)；其特征在于：激光器(1)發(fā)出的光經(jīng)光纖(2)傳導(dǎo)和準(zhǔn)直透鏡(3)準(zhǔn)直后照明I空間光調(diào)制器(4)，I空間光調(diào)制器(4)反射光波經(jīng)過(guò)第一透鏡(5)匯聚后被二向色鏡(6)反射，二向色鏡(6)反射的光進(jìn)而依次經(jīng)過(guò)第二透鏡(7)、第三透鏡(8)后，再被反射鏡(9)反射后進(jìn)入顯微物鏡(10)，經(jīng)過(guò)顯微物鏡(10)后的光波照射在樣品(11)上，激發(fā)出的熒光被顯微物鏡(10)收集后被反射鏡(9)反射，然后再依次通過(guò)第三透鏡(8)、第二透鏡(7)、二向色鏡(6)、第四透鏡(12)和分束棱鏡(13)后照射到II空間光調(diào)制器(14)上，II空間光調(diào)制器(14)反射的光再次被分束棱鏡(13)反射后照射到圖像采集器(15)上，由圖像采集器(15)記錄光強(qiáng)分布；其中I空間光調(diào)制器(4)、II空間光調(diào)制器(14)和圖像采集器(15)均與計(jì)算機(jī)(16)相連接。

其中，為了產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)照明光，進(jìn)一步優(yōu)選，在計(jì)算機(jī)(16)中生成并于I空間光調(diào)制器(4)上顯示二值光柵；為了實(shí)現(xiàn)分光和相移進(jìn)而實(shí)現(xiàn)全息圖的記錄，還在計(jì)算機(jī)(16)中生成并于II空間光調(diào)制器(14)上顯示衍射分光相位掩膜圖樣。

顯微物鏡(10)為無(wú)限遠(yuǎn)焦物鏡；I空間光調(diào)制器(4)處在顯微物鏡(10)的后焦平面的共軛平面上，即I空間光調(diào)制器(4)至第一透鏡(5)的軸向距離為第一透鏡(5)的焦距，第一透鏡(5)與第二透鏡(7)的軸向距離為第一透鏡(5)和第二透鏡(7)焦距之和，第二透鏡(7)至第三透鏡(8)的軸向距離為第二透鏡(7)至第三透鏡(8)焦距之和，第三透鏡(8)至顯微物鏡(10)后焦平面的軸向距離為第三透鏡(8)的焦距。

進(jìn)一步II空間光調(diào)制器(14)為純相位型空間光調(diào)制器，入射其表面的熒光應(yīng)該先通過(guò)偏振片形成線偏振光；且偏振片的偏振取向與II空間光調(diào)制器(14)的偏振敏感軸之間夾角為45度。

在II空間光調(diào)制器(14)上加載的衍射分光相位掩膜經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)(16)中的數(shù)值運(yùn)算生成，對(duì)應(yīng)為某一確定焦距確定尺寸的正透鏡的位相分布；衍射分光相位掩膜一般由三張彼此之間具有確定相移的位相分布圖片構(gòu)成。

所述圖像采集器(15)的放置位置應(yīng)該經(jīng)過(guò)特殊選取，以最優(yōu)化所記錄全息圖的質(zhì)量；使用本發(fā)明系統(tǒng)(如附圖1所示)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，先固定采集器(15)的一個(gè)位置，在圖像采集器(15)位置附近沿軸向前后移動(dòng)圖像采集器(15)，可以發(fā)現(xiàn)前后分別有兩個(gè)軸向位置處可以獲得熒光樣品清晰的圖像；將這兩個(gè)軸向位置到II空間光調(diào)制器(14)的軸向距離分別記為d₁和d₂；則圖像采集器(15)的具體放置位置應(yīng)該選取為：其距離II空間光調(diào)制器14的軸向距離為：2d₁d₂/(d₁+d₂)。

超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像方法，通過(guò)數(shù)值計(jì)算過(guò)程，對(duì)使用超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)所獲取的圖像進(jìn)行處理，以重建熒光樣品的超分辨率光學(xué)斷層圖像；具體步驟如下：

(1)在I空間光調(diào)制器上顯示預(yù)先生成好的二值光柵，II空間光調(diào)制器上依次顯示相移值不同的位相掩膜，圖像采集器分別記錄對(duì)應(yīng)的圖片；

(2)改變光柵相位值并生成新的二值光柵，重復(fù)(1)步驟；

(3)改變光柵取向，重復(fù)(1)步驟和(2)步驟；

(4)針對(duì)(1)步驟中獲得的全息圖，在計(jì)算機(jī)中通過(guò)相移算法和標(biāo)量衍射數(shù)值算法計(jì)算得到結(jié)構(gòu)照明的樣品再現(xiàn)圖像；改變標(biāo)量衍射算法中的再現(xiàn)距離，可以獲得不同深度處結(jié)構(gòu)照明的樣品再現(xiàn)圖像；

(5)針對(duì)(2)步驟和(3)步驟中記錄的圖像，重復(fù)(4)步驟，獲得不同光柵相位和不同光柵取向時(shí)結(jié)構(gòu)照明的樣品再現(xiàn)圖像；改變標(biāo)量衍射算法中的再現(xiàn)距離，可以獲得不同深度處結(jié)構(gòu)照明的樣品再現(xiàn)圖像；

(6)針對(duì)某一相同的深度，即再現(xiàn)距離相同的結(jié)構(gòu)照明再現(xiàn)圖像，將(5)步驟獲得的所有圖像通過(guò)結(jié)構(gòu)照明超分辨率重建算法進(jìn)行合成，最終獲得該深度處樣品的超分辨率重構(gòu)圖像；

(7)針對(duì)某一相同的深度，即再現(xiàn)距離相同的結(jié)構(gòu)照明再現(xiàn)圖像，將(5)步驟獲得的所有圖像通過(guò)結(jié)構(gòu)照明斷層重建算法進(jìn)行合成，最終獲得該深度處樣品的光學(xué)斷層重構(gòu)圖像；

(8)將(6)和(7)步驟中獲得的樣品某一深度處的超分辨率重構(gòu)圖像和光學(xué)斷層重構(gòu)圖像，進(jìn)行頻域?yàn)V波并融合，獲得該深度處的超分辨率光學(xué)斷層重建圖像；

(7)對(duì)所有可能的再現(xiàn)距離，重復(fù)(6)-(8)步驟，獲得樣品內(nèi)不同深度處的超分辨率光學(xué)斷層再現(xiàn)圖像。

本發(fā)明所述的深度為樣品(11)與顯微物鏡(10)之間的距離。

本系統(tǒng)和方法的主要優(yōu)點(diǎn)在于：在現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)照明顯微成像技術(shù)中結(jié)合熒光數(shù)字全息技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)樣品內(nèi)不同深度處結(jié)構(gòu)的三維再現(xiàn)；同時(shí)，還可實(shí)現(xiàn)超分辨率光學(xué)斷層成像，且采集速度較快；采用I空間光調(diào)制器(4)作為產(chǎn)生結(jié)構(gòu)照明的元件，因而在結(jié)構(gòu)的周期、形式、調(diào)制度等具體參數(shù)上有較大的選擇自由度。本發(fā)明提出的系統(tǒng)和方法使用于三維動(dòng)態(tài)熒光樣品或熒光樣品內(nèi)三維動(dòng)態(tài)過(guò)程的超分辨率觀察應(yīng)用領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明一種超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)示意圖；

其中1激光器、2光纖、3準(zhǔn)直透鏡、4I空間光調(diào)制器，5第一透鏡、6二向色鏡、7第二透鏡、8第三透鏡、9反射鏡、10顯微物鏡、11樣品、12第四透鏡、13分束棱鏡、14II空間光調(diào)制器、15圖像采集器、16計(jì)算機(jī)。

圖2為本發(fā)明具體實(shí)施方式中涉及的數(shù)值仿真模擬中用到的兩個(gè)樣品的結(jié)構(gòu)；

圖3為本發(fā)明具體實(shí)時(shí)方式說(shuō)明中涉及的數(shù)值仿真模擬中，通過(guò)本發(fā)明所述系統(tǒng)和方法最終重建的圖像(b)；以及相同光學(xué)參數(shù)下通過(guò)傳統(tǒng)熒光顯微成像系統(tǒng)獲取的圖像(a)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

在計(jì)算機(jī)中利用數(shù)值仿真軟件對(duì)本發(fā)明所述的超分辨率熒光數(shù)字全息斷層顯微成像系統(tǒng)的成像過(guò)程以及后續(xù)數(shù)值處理方法進(jìn)行模擬，采用的超分辨率光學(xué)斷層熒光數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)見(jiàn)圖1，選取如附圖2所示的兩個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)的樣品，并將它們一前一后同時(shí)放置于樣品11空間內(nèi)的不同深度處。模擬系統(tǒng)的成像過(guò)程，記錄所需的所有全息圖后，使用重建算法進(jìn)行重建的結(jié)果附圖3(b)所示。對(duì)比附圖3(a)中給出的利用傳統(tǒng)熒光顯微成像系統(tǒng)獲得的結(jié)果，可以看出樣品空間內(nèi)的不同深度處兩物體像之間的串?dāng)_在附圖3(b)中更??；同時(shí)附圖3(b)中，由數(shù)字和橫線等結(jié)構(gòu)構(gòu)成的樣品的細(xì)節(jié)可以被更清晰的分辨。由此，證明了本發(fā)明所提出方法的超分辨率光學(xué)斷層成像特性。