基于可調(diào)諧激光的sted超分辨顯微鏡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及顯微鏡【技術(shù)領(lǐng)域】，提供的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡包括激發(fā)光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元；激發(fā)光單元包括第一可調(diào)諧激光光源；損耗光單元包括第二可調(diào)諧激光光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片；掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管。本發(fā)明采用可調(diào)諧激光光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發(fā)光光源和損耗光光源，由于激發(fā)光波長和損耗光波長均可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)設(shè)置，對于給定的熒光染料，可以找到適合的激發(fā)光波長和損耗光波長，擴(kuò)大了STED超分辨顯微鏡的適用范圍。
【專利說明】基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微鏡【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡。
【背景技術(shù)】
[0002]超分辨光學(xué)顯微術(shù)對生物醫(yī)學(xué)和材料學(xué)等領(lǐng)域的研究具有革命性的推動作用，其研究進(jìn)展在很多科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)都產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。超分辨光學(xué)顯微術(shù)由于實(shí)現(xiàn)方法不同，出現(xiàn)了多種類型:受激福射損耗(Stimulated Emission Depletion,STED)顯微術(shù)是建立在激光共聚焦顯微術(shù)基礎(chǔ)上的一種光學(xué)超分辨顯微術(shù)，是首先提出也是最直接地客服光學(xué)衍射極限的遠(yuǎn)場光學(xué)顯微術(shù)，相對于其它類型的超分辨顯微術(shù)，其成像速度相對較快，能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行成像，在生物醫(yī)學(xué)研究中可以探測更精細(xì)的結(jié)構(gòu)，也為材料科學(xué)領(lǐng)域研究提供了新手段。
[0003]在STED顯微成像系統(tǒng)中需要兩種激光照明，一種激光在物鏡焦點(diǎn)處形成近似艾利分布的光斑，對熒光物質(zhì)進(jìn)行激發(fā)，使得熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，這種照明激光為激發(fā)光?’另一種在物鏡焦點(diǎn)處形成中央光強(qiáng)為零的圓環(huán)形光斑，使位于圓環(huán)上處于激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)損耗掉，不再發(fā)射熒光，只有位于圓環(huán)形焦斑中央暗區(qū)的熒光物質(zhì)才能產(chǎn)生熒光，由于中央暗區(qū)的直徑遠(yuǎn)小于衍射極限，故可獲得超越光學(xué)分辨極限的圖像。
[0004]給定波長的激發(fā)光只能用來激發(fā)吸收峰值位于該波長附近的熒光染料，給定波長的損耗光只能用來退激發(fā)熒光發(fā)射波長紅端和該損耗光波長接近的熒光染料，激發(fā)光波長、損耗光波長和熒光染料的吸收發(fā)射波長要匹配。目前的STED顯微成像系統(tǒng)多是采用固定波長的激發(fā)光或損耗光，這樣一來適合的熒光染料數(shù)量就很有限，能夠觀察的生物組織也就很有限；采用雙色或多色STED可以同時對兩種或多種熒光染料進(jìn)行激發(fā)，擴(kuò)大了系統(tǒng)的適用范圍，但即使采用雙色或多色STED也只是很有限地?cái)U(kuò)大了系統(tǒng)的適用范圍，實(shí)際生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中熒光染料千差萬別，有限的幾個激發(fā)光波長或損耗光波長不能滿足要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，激發(fā)光波長和損耗光波長均可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)設(shè)置，擴(kuò)大了 STED超分辨顯微成像系統(tǒng)的適用范圍。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]一種基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，包括激發(fā)光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元；
[0008]所述激發(fā)光單元包括第一可調(diào)諧激光光源；所述損耗光單元包括第二可調(diào)諧激光光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片，第二可調(diào)諧激光光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片沿第二可調(diào)諧激光光源的發(fā)光光路依次設(shè)置；所述掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管，掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡沿第二二色鏡的反射光路依次設(shè)置，針孔透鏡和光電倍增管沿第二二色鏡的透射光路依次設(shè)置；
[0009]所述第一二色鏡用于連接激發(fā)光單元和損耗光單元，第一二色鏡對激發(fā)光單元出射的激發(fā)光進(jìn)行透射，對損耗光單元出射的損耗光進(jìn)行反射；經(jīng)第一二色鏡透射后的激發(fā)光和反射后的損耗光共同入射至第二二色鏡；第二二色鏡對入射的損耗光和激發(fā)光進(jìn)行反射；
[0010]所述激發(fā)光單元中的第一可調(diào)諧激光光源發(fā)出的激發(fā)光波長可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，激發(fā)光單元出射的激發(fā)光經(jīng)第一二色鏡透射、第二二色鏡反射、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第一光斑，所述第一光斑用于激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)從而產(chǎn)生突光；
[0011]所述損耗光單元中的第二可調(diào)諧激光光源發(fā)出的損耗光波長可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，半玻片用于改變?nèi)肷鋼p耗光的偏振方向，渦旋相位片用于在損耗光光束中引入0-2 π的渦旋相位分布，四分之一波片用于將損耗光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光，損耗光單元出射的損耗光經(jīng)第一二色鏡、第二二色鏡、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重疊；
[0012]所述樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡收集后經(jīng)筒鏡、掃描透鏡透射和掃描振鏡反射，入射進(jìn)第二二色鏡，并被第二二色鏡透射后經(jīng)針孔透鏡被光電倍增管收集。
[0013]下面對上述技術(shù)方案進(jìn)一步解釋:
[0014]所述第一二色鏡對激發(fā)光單元出射的激發(fā)光具有高透射率，對損耗光單元出射的損耗光具有高反射率；第二二色鏡對入射的損耗光和激發(fā)光具有高反射率，對激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的熒光具有高透射率。
[0015]所述第一光斑為艾里斑狀光斑；
[0016]所述第二光斑為面包圈狀光斑，光斑的中央位置光強(qiáng)接近為零而周圍環(huán)狀區(qū)域光強(qiáng)較高。
[0017]所述艾里斑狀光斑和面包圈狀光斑重疊，使位于艾里斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子被損耗光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光。
[0018]在所述光電倍增管和針孔透鏡之間設(shè)有針孔，所述針孔位于針孔透鏡的焦點(diǎn)處；所述樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)過針孔透鏡聚焦在針孔處，透過針孔的熒光被光電倍
增管收集。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0020]本發(fā)明采用可調(diào)諧激光光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發(fā)光光源和損耗光光源，由于激發(fā)光波長和損耗光波長均可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)設(shè)置，對于給定的熒光染料，可以找到適合的激發(fā)光波長和損耗光波長，擴(kuò)大了 STED超分辨顯微鏡的適用范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]其中:基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡100、激發(fā)光單元110、第一可調(diào)諧激光光源111、損耗光單元120、第二可調(diào)諧激光光源121、半玻片122、渦旋相位片123、四分之一波片124、第一二色鏡130、掃描成像單元140、第二二色鏡141、掃描振鏡142、掃描透鏡
143、筒鏡144、物鏡145、針孔透鏡146、針孔147、光電倍增管148、樣本200?！揪唧w實(shí)施方式】
[0023]請參考圖1。圖1中標(biāo)有單箭頭的光路為激光傳播光路；標(biāo)有雙箭頭的光路為突光傳播光路。
[0024]實(shí)施例:基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡100包括激發(fā)光單元110、損耗光單元120、第一二色鏡130和掃描成像單元140。
[0025]激發(fā)光單兀110包括第一可調(diào)諧激光光源111,該第一可調(diào)諧激光光源111發(fā)出的激發(fā)光波長可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置。
[0026]損耗光單元120包括第二可調(diào)諧激光光源121、半玻片122、渦旋相位片123和四分之一波片124，它們分別沿第二可調(diào)諧激光光源121的發(fā)光光路依次設(shè)置。第二可調(diào)諧激光光源121發(fā)出的損耗光波長也可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置。其中，半玻片122用于改變?nèi)肷鋼p耗光的偏振方向，潤旋相位片123用于在損耗光光束中引入0-2 π的潤旋相位分布，四分之一波片124用于將損耗光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光。
[0027]第一二色鏡130用于連接激發(fā)光單元110和損耗光單元120，對激發(fā)光單元110出射的激發(fā)光進(jìn)行透射，對損耗光單元120出射的損耗光進(jìn)行反射。在一優(yōu)選實(shí)施例中，第一二色鏡130對激發(fā)光單元110出射的激發(fā)光具有高透射率，對損耗光單元120出射的損耗光具有高反射率。
[0028]掃描成像單元140包括第二二色鏡141、掃描振鏡142、掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145、針孔透鏡146和光電倍增管148，掃描振鏡142、掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145沿第二二色鏡141的反射光路依次設(shè)置，針孔透鏡146和光電倍增管148沿第二二色鏡141的透射光路依次設(shè)置。經(jīng)第一二色鏡130透射后的激發(fā)光和反射后的損耗光共同入射至第二二色鏡141，第二二色鏡141對入射的損耗光和激發(fā)光進(jìn)行反射。在一優(yōu)選實(shí)施例中，第二二色鏡141對入射的損耗光和激發(fā)光具有高反射率。
[0029]激發(fā)光單元110出射的激發(fā)光經(jīng)第一二色鏡130透射、第二二色鏡141反射、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射，在物鏡145焦面處形成第一光斑，該第一光斑用于激發(fā)樣本200中的熒光物質(zhì)從而產(chǎn)生熒光，熒光經(jīng)物鏡145收集后經(jīng)筒鏡
144、掃描透鏡143透射和掃描振鏡142反射，入射進(jìn)第二二色鏡141，并被第二二色鏡141透射后經(jīng)針孔透鏡146被光電倍增管148收集，光電倍增管148探測熒光并將熒光轉(zhuǎn)換成電信號，在一優(yōu)選實(shí)施例中，第二二色鏡141對激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的熒光具有高透射率。損耗光單元120出射的損耗光經(jīng)第一二色鏡130、第二二色鏡141、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射,在物鏡145焦面處形成第二光斑。第一光斑和第二光斑重疊。
[0030]在一優(yōu)選實(shí)施例中，第一光斑為艾里斑狀光斑；第二光斑為面包圈狀光斑，光斑的中央位置光強(qiáng)接近為零而周圍環(huán)狀區(qū)域光強(qiáng)較高。艾里斑狀光斑和面包圈狀光斑重疊在一起，使位于艾里斑外圍區(qū)域上處于突光發(fā)射態(tài)的突光分子被損耗光退激發(fā)，不再產(chǎn)生突光，從而減小了熒光的有效發(fā)射區(qū)域，實(shí)現(xiàn)光學(xué)超分辨成像。
[0031]在另一優(yōu)選實(shí)施例中，在光電倍增管148和針孔透鏡146之間設(shè)有針孔147，針孔147位于針孔透鏡146的焦點(diǎn)處；樣本200中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)過針孔透鏡146聚焦在針孔147處，透過針孔147的熒光被光電倍增管148收集。[0032]本實(shí)施例工作討稈如下:
[0033]如圖1所示，第一可調(diào)諧激光光源111發(fā)出激發(fā)光光束，經(jīng)第一二色鏡130透射、第二二色鏡141反射、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射后，在物鏡145焦面處形成一個艾里斑分布的光斑，用于激發(fā)樣本200中的熒光物質(zhì)從而產(chǎn)生熒光；第二可調(diào)諧激光光源121發(fā)出的損耗光光束經(jīng)半玻片122、渦旋相位片123、四分之一玻片124后，經(jīng)第一二色鏡130、第二二色鏡141、掃描振鏡142反射和掃描透鏡143、筒鏡144、物鏡145透射，在物鏡145的焦面處形成一個面包圈形的光斑，光斑的中央位置光強(qiáng)接近為零而周圍環(huán)狀區(qū)域光強(qiáng)較高。激發(fā)光在物鏡145焦面處形成的艾里斑狀光斑和損耗光在物鏡145焦面處形成的面包圈狀光斑重疊在一起，使得位于艾里斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子被損耗光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光，從而減小了熒光的有效發(fā)射區(qū)域，實(shí)現(xiàn)光學(xué)超分辨成像。樣本200中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡145收集后經(jīng)過筒鏡144和掃描透鏡143，之后被掃描振鏡142反射，入射進(jìn)入第二二色鏡141，被第二二色鏡141透射，經(jīng)過針孔透鏡146聚焦在針孔147處，透過針孔147的熒光被光電倍增管148收集。
[0034]本發(fā)明采用可調(diào)諧激光光源作為STED超分辨顯微鏡中的激發(fā)光光源和損耗光光源，由于激發(fā)光波長和損耗光波長均可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)設(shè)置，對于給定的熒光染料，可以找到適合的激發(fā)光波長和損耗光波長，擴(kuò)大了 STED超分辨顯微鏡的適用范圍。
[0035]當(dāng)然本發(fā)明的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡還可具有多種變換及改型，并不局限于上述實(shí)施方式的具體結(jié)構(gòu)?？傊?，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)包括那些對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說顯而易見的變換或替代以及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，包括激發(fā)光單元、損耗光單元、第一二色鏡和掃描成像單元； 所述激發(fā)光單元包括第一可調(diào)諧激光光源；所述損耗光單元包括第二可調(diào)諧激光光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片，第二可調(diào)諧激光光源、半玻片、渦旋相位片和四分之一波片沿第二可調(diào)諧激光光源的發(fā)光光路依次設(shè)置；所述掃描成像單元包括第二二色鏡、掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡、針孔透鏡和光電倍增管，掃描振鏡、掃描透鏡、筒鏡、物鏡沿第二二色鏡的反射光路依次設(shè)置，針孔透鏡和光電倍增管沿第二二色鏡的透射光路依次設(shè)置； 所述第一二色鏡用于連接激發(fā)光單元和損耗光單元，第一二色鏡對激發(fā)光單元出射的激發(fā)光進(jìn)行透射，對損耗光單元出射的損耗光進(jìn)行反射；經(jīng)第一二色鏡透射后的激發(fā)光和反射后的損耗光共同入射至第二二色鏡；第二二色鏡對入射的損耗光和激發(fā)光進(jìn)行反射； 所述激發(fā)光單元中的第一可調(diào)諧激光光源發(fā)出的激發(fā)光波長可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，激發(fā)光單元出射的激發(fā)光經(jīng)第一二色鏡透射、第二二色鏡反射、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第一光斑，所述第一光斑用于激發(fā)樣本中的熒光物質(zhì)從而產(chǎn)生突光； 所述損耗光單元中的第二可調(diào)諧激光光源發(fā)出的損耗光波長可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)置，半玻片用于改變?nèi)肷鋼p耗光的偏振方向，渦旋相位片用于在損耗光光束中引入0-2 π的渦旋相位分布，四分之一波片用于將損耗光由線偏光轉(zhuǎn)為圓偏光，損耗光單兀出射的損耗光經(jīng)第一二色鏡、第二二色鏡、掃描振鏡反射和掃描透鏡、筒鏡、物鏡透射，在物鏡焦面處形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重疊； 所述樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)物鏡收集后經(jīng)筒鏡、掃描透鏡透射和掃描振鏡反射，入射進(jìn)第二二色鏡，并被第二二色鏡透射后經(jīng)針孔透鏡被光電倍增管收集。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，所述第一二色鏡對激發(fā)光單元出射的激發(fā)光具有高透射率，對損耗光單元出射的損耗光具有高反射率；第二二色鏡對入射的損耗光和激發(fā)光具有高反射率，對激發(fā)光激發(fā)產(chǎn)生的熒光具有高透射率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，所述第一光斑為艾里斑狀光斑； 所述第二光斑為面包圈狀光斑，光斑的中央位置光強(qiáng)接近為零而周圍環(huán)狀區(qū)域光強(qiáng)較聞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，所述艾里斑狀光斑和面包圈狀光斑重疊，使位于艾里斑外圍區(qū)域上處于熒光發(fā)射態(tài)的熒光分子被損耗光退激發(fā)，不再產(chǎn)生熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于可調(diào)諧激光的STED超分辨顯微鏡，其特征在于，在所述光電倍增管和針孔透鏡之間設(shè)有針孔，所述針孔位于針孔透鏡的焦點(diǎn)處；所述樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光經(jīng)過針孔透鏡聚焦在針孔處，透過針孔的熒光被光電倍增管收集。
【文檔編號】G01N21/64GK103698309SQ201310732247
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月26日
【發(fā)明者】張運(yùn)海, 昌劍 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所