利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于近紅外光譜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用近紅外光譜同時(shí)測(cè)定微生物 發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的多種營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的檢測(cè)發(fā)酵液中多種營(yíng)養(yǎng)成分含量變化和抗生素效價(jià)變化的方法需要根據(jù) 不同的成分進(jìn)行不同的預(yù)處理，使用不同的儀器進(jìn)行檢測(cè)，如檢測(cè)pH值需要pH測(cè)定儀，檢測(cè) 總糖需要測(cè)糖儀，檢測(cè)氨基氮需要使用甲醛進(jìn)行反應(yīng)并用氫氧化鈉進(jìn)行滴定，檢測(cè)抗生素 效價(jià)需要經(jīng)過(guò)濾、加酸、煮沸、定容等再用分光光度計(jì)測(cè)定等等?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法處理繁瑣， 耗費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間，而且使用大量化學(xué)試劑，對(duì)環(huán)境造成一定的污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用近紅外光譜同時(shí)測(cè)定微生物發(fā) 酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變化的方法。該方法可以快速反饋和了解 發(fā)酵情況，及時(shí)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和工藝控制，并對(duì)抗生素效價(jià)的變化情況進(jìn)行監(jiān)控，且整個(gè) 檢測(cè)過(guò)程高效、節(jié)約、無(wú)污染。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變 化的方法，其包括如下步驟： 1) 在微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣； 2) 采用漫反射方式獲取每個(gè)樣品的近紅外光譜，同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品的理化指標(biāo)，獲得 理化檢測(cè)數(shù)據(jù);所述理化指標(biāo)包括各營(yíng)養(yǎng)成分的含量和抗生素效價(jià)； 3) 對(duì)采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘 法計(jì)算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測(cè)數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型，利用該發(fā)酵 液模型實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的測(cè)定。
[0005] 具體的，步驟2)中的營(yíng)養(yǎng)成分包括總糖、氨基氮和氨基酸。
[0006] 進(jìn)一步，步驟3)具體為:利用計(jì)算機(jī)軟件和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)采集到的近紅外光 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理(MSC)、一級(jí)導(dǎo)數(shù)預(yù)處理、平滑預(yù)處理或矢量歸一預(yù)處理， 并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法(PLS)計(jì)算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測(cè)數(shù) 據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后通過(guò)交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（1-VR)、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差 (SECV)兩個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，選擇交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)相對(duì)較大、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差相對(duì)較小的 模型確定為最終發(fā)酵液模型，利用該最終發(fā)酵液模型實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中營(yíng)養(yǎng) 成分含量和抗生素效價(jià)變化的測(cè)定。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，最終發(fā)酵液模型可預(yù)先經(jīng)理化指 標(biāo)在線檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證后，即可投入使用。
[0007] 主成分分析法(PCA)利用降維的思想，把多指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)綜合指標(biāo)，將光譜 中的有效信息提取出來(lái)。不同周期抗生素發(fā)酵液由于原輔料的使用會(huì)有一些顆粒物，而MSC 對(duì)光譜的處理能消除固體顆粒大小、表面散射以及光程變化對(duì)近紅外漫反射光的影響，使 光譜的差異更能代表樣品含量變化的差異。
[0008] 本發(fā)明利用光柵型近紅外光譜技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵周期的抗生素（包含有金霉素、土 霉素、新霉素等發(fā)酵型抗生素)發(fā)酵液進(jìn)行采集光譜，同時(shí)對(duì)每一個(gè)采集的樣品進(jìn)行化學(xué)方 法檢測(cè)，得到不同營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的理化數(shù)據(jù)，將采集的近紅外光譜和理 化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合建立模型。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，模型適用于不同周期抗生素發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分含量 和抗生素效價(jià)變化的檢測(cè)，短時(shí)間內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)的含量，并可進(jìn)行在線控制。
[0009] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明檢測(cè)方法的有益效果： 本發(fā)明提供了一種利用近紅外光譜技術(shù)同時(shí)測(cè)定微生物發(fā)酵液中多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗 生素含量變化的方法，以通過(guò)監(jiān)控發(fā)酵過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)成分變化和抗生素含量變化來(lái)及時(shí)補(bǔ) 充營(yíng)養(yǎng)成分和控制發(fā)酵工藝。使用該測(cè)定方法時(shí)不需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行任何處理，不需使用 任何化學(xué)試劑，不對(duì)環(huán)境造成任何污染，且能夠減少人力勞動(dòng)，節(jié)約時(shí)間和成本。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為不同周期金霉素發(fā)酵液的近紅外光譜數(shù)據(jù)； 圖2為品管部對(duì)金霉素發(fā)酵液進(jìn)行理化檢測(cè)的部分?jǐn)?shù)據(jù)，圖中TotalSuger為總糖，AN 為氨基氮，CTC為抗生素效價(jià)； 圖3為圖1采用MSC預(yù)處理后的近紅外光譜數(shù)據(jù)； 圖4為采用最終金霉素發(fā)酵液模型進(jìn)行檢測(cè)的數(shù)據(jù)和品管部理化檢測(cè)數(shù)據(jù)的對(duì)比驗(yàn) 證，圖中，QC代表品管檢測(cè)數(shù)據(jù)，NIR為模型檢測(cè)數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0011]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步地詳細(xì)介紹，但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于此。
[0012] 實(shí)施例1 一種利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變 化的方法，其包括如下步驟： 1) 在微生物(包括金霉素、新霉素、土霉素等)發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行 取樣； 2) 利用F0SS公司光柵型近紅外分析儀采用漫反射方式獲取每個(gè)樣品的近紅外光譜(見(jiàn) 圖1)，同時(shí)通過(guò)本公司品管部(QC)測(cè)定每一個(gè)樣品的理化指標(biāo)，獲得理化檢測(cè)數(shù)據(jù)(見(jiàn)圖 2);所述理化指標(biāo)包括各營(yíng)養(yǎng)成分(如總糖、氨基氮和氨基酸)的含量和抗生素效價(jià);得到不 同營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化數(shù)據(jù)。近紅外光譜的波長(zhǎng)范圍選自400-2500nm。
[0013] 品管部理化檢測(cè)方法如下： 總糖測(cè)定：用碘量法。取樣品lml，置于250mL碘量瓶中，加蒸餾水30mL使之溶解。加入 0.05 mol/1 KI溶液25.00mL，在不斷搖動(dòng)下緩慢滴加0.1mol/l NaOH溶液40ml至溶液呈淡 黃色。密塞、暗置10分鐘。加0.5 mol/1 H2S〇4溶液6mL，搖勻，用Na2S2〇3標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mol/l) 滴定。接近終點(diǎn)時(shí)加入2ml淀粉指示液，繼續(xù)滴定到溶液藍(lán)色消失，即達(dá)終點(diǎn)。同時(shí)做空白試 驗(yàn)。
[0014] 氨基氮測(cè)定：取2ml樣品于三角瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水定至10ml。然后向瓶中加入甲基紅 指示劑2滴，lmol/1 H2S〇4加1-2滴，調(diào)節(jié)溶液至紅色，靜置5分鐘，再用0 · 5mol/l的NaOH標(biāo)準(zhǔn) 溶液調(diào)節(jié)溶液至橙色，加12 %中性甲醛10 m 1，搖勻靜置10 m i η，加1 %酚酞指示劑5滴，用 0. lmol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液顯微紅色為終點(diǎn)。
[0015] 氨基氮(呢/1001111)=0\￥\14.01\100/2.5((：:恥0田農(nóng)度，￥:恥0!1滴定體積）。
[0016] 氨基酸測(cè)定:采用氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定，具體略。
[0017] 抗生素效價(jià)測(cè)定:采用分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定，具體略。
[0018] 3)建立發(fā)酵液模型：具體為:利用計(jì)算機(jī)軟件和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)采集到的近紅 外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理(MSC，見(jiàn)圖3)，并結(jié)合主成分分析法(PCA)和偏最小二 乘法(PLS)計(jì)算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測(cè)數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后 通過(guò)交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)（1-VR)、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差（SECV)兩個(gè)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，選擇交叉驗(yàn)證 相關(guān)系數(shù)相對(duì)較大、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差相對(duì)較小的模型確定為最終發(fā)酵液模型(見(jiàn)表1 )，利 用該最終發(fā)酵液模型實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的 測(cè)定。
[0019] 表1 =種牛物發(fā)酵液的沂紅外樽型評(píng)價(jià)指標(biāo)
[0020] 以金霉素為例，金霉素發(fā)酵液是由本公司保藏的金色鏈霉菌接種于由玉米淀粉等 常規(guī)原料配制成的培養(yǎng)基中，按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)在一定的溫度、濕度、PH、轉(zhuǎn)速等工藝控 制下得到的金霉素發(fā)酵液。
[0021] 圖4為采用最終金霉素發(fā)酵液模型進(jìn)行檢測(cè)的數(shù)據(jù)和品管部理化檢測(cè)數(shù)據(jù)的對(duì)比 驗(yàn)證。從圖4中可以看出：不同周期金霉素發(fā)酵液效價(jià)指標(biāo)利用兩種方法（品管常規(guī)方法QC 和近紅外模型預(yù)測(cè)方法NIR)檢測(cè)，兩種方法得到的數(shù)據(jù)相當(dāng)一致。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可知:上述建立 的最終發(fā)酵液模型適用于不同周期微生物發(fā)酵液中各營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)效價(jià)的 檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià) 變化的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 在微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣； 2) 采用漫反射方式獲取每個(gè)樣品的近紅外光譜，同時(shí)測(cè)定每個(gè)樣品的理化指標(biāo)，獲得 理化檢測(cè)數(shù)據(jù);所述理化指標(biāo)包括各營(yíng)養(yǎng)成分的含量和抗生素效價(jià)； 3) 對(duì)采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法和偏最小二乘法計(jì)算 得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測(cè)數(shù)據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型，利用該發(fā)酵液模型 實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變化的測(cè)定。2. 如權(quán)利要求1所述利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和 抗生素效價(jià)變化的方法，其特征在于，步驟2)中的營(yíng)養(yǎng)成分包括總糖、氨基氮和氨基酸。3. 如權(quán)利要求1所述利用近紅外光譜測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中多種營(yíng)養(yǎng)成分和 抗生素效價(jià)變化的方法，其特征在于，步驟3)具體為:利用計(jì)算機(jī)軟件和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì) 采集到的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正預(yù)處理、一級(jí)導(dǎo)數(shù)預(yù)處理、平滑預(yù)處理或矢量 歸一預(yù)處理，并結(jié)合主成分分析法和偏最小二乘法計(jì)算得到近紅外光譜數(shù)據(jù)與理化檢測(cè)數(shù) 據(jù)的擬合方程，即建立發(fā)酵液模型;然后通過(guò)交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差兩個(gè)指 標(biāo)的評(píng)價(jià)，選擇交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)相對(duì)較大、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)方差相對(duì)較小的模型確定為最 終發(fā)酵液模型，利用該最終發(fā)酵液模型實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素 效價(jià)變化的測(cè)定。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用近紅外光譜同時(shí)測(cè)定微生物發(fā)酵產(chǎn)抗生素過(guò)程中的多種營(yíng)養(yǎng)成分和抗生素效價(jià)變化的方法，具體為：利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵周期的抗生素（包含有金霉素、土霉素、新霉素等發(fā)酵型抗生素）發(fā)酵液進(jìn)行采集光譜，同時(shí)對(duì)每一個(gè)采集的樣品進(jìn)行化學(xué)方法檢測(cè)，得到不同營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的理化數(shù)據(jù)，將采集的近紅外光譜和理化數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合建立模型。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，該模型適用于不同周期抗生素發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分含量和抗生素效價(jià)變化的檢測(cè)。該方法可以快速反饋和了解發(fā)酵情況，及時(shí)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和工藝控制，并對(duì)抗生素效價(jià)的變化情況進(jìn)行監(jiān)控，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程高效、節(jié)約、無(wú)污染。
【IPC分類】G01N21/3577, G01N21/359
【公開(kāi)號(hào)】CN105548064
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510928644
【發(fā)明人】高惠姣, 陳浩然, 李書(shū)至, 李冰, 常坤, 張歡
【申請(qǐng)人】駐馬店華中正大有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2015年12月15日