本發(fā)明涉及中藥材的質(zhì)量檢測
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù):
:中藥質(zhì)量控制和評價的難題在于中藥多成分的復(fù)雜性,由于單一成分或指標評價難以表征中藥的質(zhì)量,而多成分質(zhì)量控制的方法需要較多的對照品。由于中藥化學(xué)對照品分離難度大或單體不穩(wěn)定、難以供應(yīng)、成本高等因素,使得多成分質(zhì)量控制的實施存在諸多困難。為此,研究者提出了適應(yīng)中藥特點的多指標質(zhì)量評價的新模式——一測多評法(quantitativeassayofmμlti-componentsbysinglemarker,QAMS)用以解決中藥質(zhì)量評價過程中所存在的對照品使用較多的問題。QAMS通過借鑒內(nèi)標法、校正因子法、主成分自身對照法、以及紫外百分吸收系數(shù)法等研究方法,依據(jù)一定范圍(線性范圍)內(nèi)成分的量(如質(zhì)量、濃度)與檢測器響應(yīng)成正比的原理,即W=f×A,選用樣品中某一典型成分的對照品,借助該成分與供試品中另一成分或其他多成分間的關(guān)系,引入相對校正因子(relativecorrectionfactor,RCF)的概念(其中,As、Ai分別為內(nèi)參物、待測物峰面積或峰高,Cs、Ci分別為內(nèi)參物、待測物的濃度),對供試品中其他成分進行測定的方法。研究多采用相對保留時間作為評價的指標??喽棺涌偵飰A(TASA)是中藥苦豆子的主要活性成分,主要包括槐定堿、槐果堿、氧化苦參堿、苦參堿、萊曼堿、苦豆堿、金花雀堿、氧化槐果堿等。這些生物堿具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗惡質(zhì)等?,F(xiàn)有技術(shù)中,苦豆子總生物堿的質(zhì)量評價主要是以單一的槐定堿作為指標,但是,由于其他活性成分如苦參堿、萊曼堿、氧化槐果堿也具有一定的含量,因此,現(xiàn)有技術(shù)以槐定堿的單一成分作為苦豆子總生物堿的評價指標,難以準確地表征苦豆子總生物堿的所有活性成分。目前,國內(nèi)外尚未有將“一測多評法”應(yīng)用于苦豆子總生物堿以及建立相關(guān)的質(zhì)量控制方法的相關(guān)報道。技術(shù)實現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法,該方法能夠準確地評價苦豆子總生物堿的質(zhì)量,可解決因?qū)φ掌啡狈Χ鵁o法客觀合理地控制中藥材及其制劑質(zhì)量的問題。為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:提供一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法,采用一測多評法,以苦豆子生物總堿中的槐定堿作為內(nèi)參物,檢測苦豆子生物總堿中的苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的質(zhì)量,具體包括以下步驟:(1)對照品溶液的配制:分別精密稱定槐定堿、苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿,置于容量瓶內(nèi),用KH2PO4溶液溶解并定容,然后過濾,分別獲得槐定堿、苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的對照品溶液,備用;(2)供試品溶液的配制:精密稱定一定量的苦豆子總生物堿樣品,置于容量瓶內(nèi),用KH2PO4溶液溶解并定容,然后過濾,獲得苦豆子總生物堿的供試品溶液,備用;(3)校正因子RCF的計算:取步驟(1)制備得到的混合對照品溶液,進樣2,4,8,12,16,20μl,用高效液相色譜測定色譜圖并計算峰面積,選取槐定堿作為內(nèi)參物,分別計算苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的校正因子RCFkm。(4)樣品中活性成分的測定取步驟(2)制備得到的供試品溶液注入高效液相色譜進行測定,獲得色譜圖,按以下公式分別計算出苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的質(zhì)量;所述公式為:Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak為槐定堿內(nèi)參物的峰面積,Wk為槐定堿內(nèi)參物的質(zhì)量;Am為被測組分的峰面積,Wm為被測組的質(zhì)量,RCFkm為苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的校正因子。。優(yōu)選的,所述步驟(2)和步驟(4)中,高效液相色譜的測定條件是:以乙腈為流動相A和KH2PO4溶液為流動相B所組成的梯度洗脫液按照下表的洗脫程序進行梯度洗脫:時間/min0256065流動相A/%55125流動相B/%95958895其中,柱溫為30℃,流速為1ml/min,進樣量為20μl,檢測波長為205nm。優(yōu)選的,所述步驟(1)和步驟(2)中,所述過濾是采用0.2~0.25um的濾膜過濾。優(yōu)選的,所述過濾是采用0.22um的濾膜過濾。優(yōu)選的,所述KH2PO4溶液為含有2ml/L三乙胺的濃度為0.05mol/L的KH2PO4溶液,其中三乙胺在流動相B中作為掃尾劑,苦豆子總生物堿屬于一種生物總堿,用高效液相色譜儀檢測時,峰形會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,而三乙胺能有效改善拖尾現(xiàn)象,對色譜峰的積分計算更準確。本發(fā)明以槐定堿為內(nèi)參物,計算苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿不同進樣量下所得的相對校正因子RCF,并在三臺不同的色譜儀及三根不同的色譜柱上考察相對校正因子的重現(xiàn)性。以Pearson相關(guān)系數(shù)評價本發(fā)明的檢測結(jié)果是否與外標法所得結(jié)果具有相關(guān)性。本發(fā)明的原理如下:本發(fā)明利用一測多評方法,即通過測定苦豆子總生物堿中的一個成分,實現(xiàn)對其他7個生物堿成分定量的方法。依據(jù)一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比,即:W=RCF×A。以苦豆子總生物堿中某一典型組分(如槐定堿)作為內(nèi)參物,建立該組分與其他組分之間的相對校正因子,通過校正因子計算其他組分的含量。如苦豆子總生物堿中含有i個組分,則存在:Wi/Ai=RCFi(i=1,2,…,k,…,m)式中Ai為組分i的峰面積;Wi為i組分的量。選取其中槐定堿k為內(nèi)標,建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子,有相對校正因子RCFkm=RCFk/RCFm=(Wk×Am)/(Wm×Ak),由此可導(dǎo)出定量計算公式:Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak為內(nèi)參物峰面積,Wk為內(nèi)參物量;Am為組分m的峰面積,Wm為組分m的量,RCFkm為相對校正因子。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明利用一測多評法,以苦豆子生物總堿中的槐定堿作為內(nèi)參物,計算槐定堿與其他7種具有中藥活性的生物堿(金花雀堿、苦豆堿、槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿及萊曼堿)的相對校正因子,進而測定出苦豆子生物總堿中的其他7種生物堿的含量。與現(xiàn)有技術(shù)以槐定堿單一成分作為苦豆子總生物堿的評價指標的方法相比,本發(fā)明的方法檢測靈敏度高,穩(wěn)定性好,可以客觀、全面、準確地評價苦豆子總生物堿的質(zhì)量,可解決因?qū)φ掌啡狈Χ鵁o法客觀合理地控制中藥材及其制劑質(zhì)量的問題,對控制質(zhì)量和保證臨床療效具有重要意義;本發(fā)明的方法具有簡便、快捷、易于普及和掌握的優(yōu)點。附圖說明圖1是本發(fā)明的一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法的空白溶劑(流動相B)的高效液相色譜圖。圖2是本發(fā)明的一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法的對照品溶液的高效液相色譜圖。圖3是本發(fā)明的一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法的供試品溶液的高效液相色譜圖。圖2和圖3中:色譜峰歸屬:1——金花雀堿;2——苦豆堿;3——槐定堿;4——氧化苦參堿;5——氧化槐果堿;6——苦參堿;7——槐果堿;8——萊曼堿具體實施方式結(jié)合以下實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明的一種苦豆子生物總堿的質(zhì)量控制方法,采用一測多評法,以苦豆子生物總堿中的槐定堿作為內(nèi)參物,檢測苦豆子生物總堿中的苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的質(zhì)量,具體包括以下步驟:(1)對照品溶液的配制:分別精密稱定對照品槐定堿、苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿,置于5ml容量瓶內(nèi),分別用0.05mol/LKH2PO4(含2ml/L三乙胺)溶解并定容至刻度,然后分別過0.22um濾膜,獲得濃度為0.2914mg/ml的槐定堿對照品溶液、0.4714mg/ml的苦參堿對照品溶液、0.2700mg/ml的金花雀堿對照品溶液、0.2586mg/ml的槐果堿對照品溶液、0.2500mg/ml的氧化槐果堿對照品溶液、0.4171mg/ml的苦豆堿對照品溶液、0.5171mg/ml的氧化苦參堿對照品溶液以及0.3943mg/ml的萊曼堿對照品溶液,備用。(2)供試品溶液的配制:精密稱定16.4mg的苦豆子總生物堿樣品,用0.05mol/LKH2PO4(含2ml/L三乙胺)溶解并定容至5ml容量瓶內(nèi),過0.22um濾膜,獲得供試品溶液,備用。(3)液相色譜圖的獲?。阂粤鲃酉郆作為空白溶劑,取步驟(1)和步驟(2)制備得到的對照品溶液、供試品溶液分別進行高效液相色譜檢測,獲得色譜圖(如圖1、圖2和圖3所示),所用高效液相色譜參數(shù)設(shè)置如下:儀器:安捷倫1200高效液相色譜儀;色譜柱:DIKMA5C18色譜柱(250*4.6mm)色譜柱;流動相:乙腈(流動相A)-0.05mol/LKH2PO4(含2ml/L三乙胺)(流動相B);流速:1.0mL/min;進樣量:10μl;檢測器:二極管陣列檢測器(PDA),掃描范圍190-400nm;檢測波長:205nm;流動相的梯度洗脫程序如表1所示:表1.HPLC梯度洗脫表停止時間:65min,后運行時間15min。(4)校正因子RCFkm的計算取步驟(1)制備得到的對照品溶液,進樣2,4,8,12,16,20μl,用高效液相色譜測定色譜圖并進行峰面積計算,選取槐定堿作為內(nèi)參物,分別計算金花雀堿、苦豆堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿、萊曼堿的校正因子RCFkm(見表2)。(5)校正因子重現(xiàn)性考察:考察各對照品溶液在三臺不同色譜儀及三根不同色譜柱中的相對校正因子RCF,所得RCF的RSD%小于5%,表明色譜儀及色譜柱對相對校正因子的測定沒有明顯影響(見表3和表4)。(6)色譜峰的定位:考察各對照品溶液在三臺不同色譜儀及三根不同色譜柱中的相對保留時間tR,所得tR的RSD%小于5%(見表5)。(7)樣品中生物堿活性成分的測定:制備6份供試品溶液注入高效液相色譜進行測定,獲得色譜圖,按以下公式計算有效成分含量:Wm=(Wk×Am)/(RCFkm×Ak),式中Ak為槐定堿內(nèi)參物峰面積,Wk為槐定堿內(nèi)參物質(zhì)量;Am為被測組分m的峰面積,Wm為被測組分m的質(zhì)量,RCFkm為苦參堿、金花雀堿、槐果堿、氧化槐果堿、苦豆堿、氧化苦參堿、萊曼堿的校正因子。(8)對測定結(jié)果進行比較:以Pearson相關(guān)系數(shù)表征本發(fā)明的方法與外標法所得結(jié)果的相關(guān)性(見表6),根據(jù)表6的Pearson相關(guān)系數(shù)可知,本發(fā)明的方法與外標法所得結(jié)果無顯著差異。表2.苦豆子總生物堿的校正因子表3.不同色譜儀對校正因子的影響表4.不同色譜柱對校正因子的影響表5不同儀器和色譜柱測得的相對保留時間表6.一測多評法與外標法測定結(jié)果比較(mg/g)本發(fā)明的方法檢測靈敏度高,穩(wěn)定性好,可以客觀、全面、準確地評價苦豆子總生物堿的質(zhì)量,可解決因?qū)φ掌啡狈Χ鵁o法客觀合理地控制中藥材及其制劑質(zhì)量的問題,對控制質(zhì)量和保證臨床療效具有重要意義,而且具有簡便、快捷、易于普及和掌握的優(yōu)點。最后應(yīng)當說明的是,以上實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制,盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解,可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。當前第1頁1 2 3