本發(fā)明涉及面包中溴酸根的確證檢測(cè)方法，屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、溴酸鉀簡(jiǎn)介

溴酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，過(guò)量食用會(huì)損害人的中樞神經(jīng)、血液及腎臟。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將該化合物列為致癌物質(zhì)。使用了溴酸鉀后的小麥粉加工制作的面包等食品具有更好的賣(mài)相：外觀更白，更具有彈性和韌性，發(fā)酵得更漂亮。雖然選用優(yōu)質(zhì)小麥粉也可達(dá)到使用溴酸鉀的效果，但成本將大大提高。我國(guó)自2005年7月1日起，已停止溴酸鉀作為面粉處理劑在小麥粉中使用，但是由于面包烘焙過(guò)程中溴酸鉀分解導(dǎo)致殘留量較低，較難檢出，因此仍有違法使用的情況。

2、面包中溴酸鉀的檢測(cè)方法現(xiàn)狀

小麥粉中溴酸鹽的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多，目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 20188-2006《小麥粉中溴酸鹽的測(cè)定 離子色譜法》，該方法檢出限為0.5mg/kg，僅適用于小麥粉和小麥粉品質(zhì)改良劑的測(cè)定。由于面包中溴酸鉀含量較低，不宜用GB/T 20188-2006《小麥粉中溴酸鹽的測(cè)定 離子色譜法》進(jìn)行檢測(cè)。目前，面包中溴酸鉀含量的檢測(cè)方法主要有分光光度法、氣相色譜法等，這些檢測(cè)方法分別主要存在以下缺點(diǎn)：

1）分光光度法

依據(jù)是溴酸鹽具有氧化性，通過(guò)溴酸鹽使還原性染料變色，吸光度在反應(yīng)前后存在差異，間接檢測(cè)溴酸鹽含量。該方法雖然能夠得到定量結(jié)果，但是沒(méi)有有效定性的手段，極易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

2）氣相色譜法

方法原理為將溴酸根轉(zhuǎn)化為單質(zhì)溴，與丁酮反應(yīng)生成溴丁酮后進(jìn)行氣相色譜測(cè)定。其局限在于測(cè)定的目標(biāo)物是溴化物，而不是溴酸根的形態(tài)，無(wú)法排除樣品中溴化物的干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種前處理簡(jiǎn)便易行、能夠準(zhǔn)確定性定量的面包中溴酸根的確證檢測(cè)方法。本發(fā)明的方法，能夠有效排除檢測(cè)中的基質(zhì)干擾，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)疑似檢測(cè)結(jié)果的確證。

技術(shù)方案

一種面包中溴酸根的確證檢測(cè)方法，包括以下步驟：

（1）用超純水提取面包中的水溶性物質(zhì)，得試樣；面包和水的用量比例為1g：5-10ml，（該用量比例為了保證樣品中的溴酸根被檢測(cè)出）；

（2）試樣用帶有電噴霧電離源的液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；

（3）初步確認(rèn)：若獲得的樣品總離子流圖中存在與標(biāo)樣相符的色譜峰，即可初步確認(rèn)試樣中含有溴酸根；若獲得的樣品總離子流圖中不存在與標(biāo)樣相符的色譜峰，即表明試樣中不含有溴酸根；

（4）確證：從含有溴酸根色譜峰的樣品總離子流圖中提取出四個(gè)定離子的質(zhì)量色譜圖；將試樣的四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖分別與標(biāo)樣的四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖進(jìn)行比對(duì)；若試樣四個(gè)定性離子質(zhì)量色譜圖的色譜峰保留時(shí)間、相對(duì)豐度比均與標(biāo)樣的一致，即可確證試樣中含有溴酸根；

（5）定量：根據(jù)試樣定量離子的質(zhì)量色譜圖中溴酸根的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算溴酸根的濃度；

液相色譜參數(shù)：

a）色譜柱：150mm×2.1mm（i，d）,內(nèi)填C18固定相，5μm；

b）流動(dòng)相：乙腈—1.5mmol/L的四丁基氫氧化銨水溶液，乙腈與四丁基氫氧化銨水溶液的體積比為45:55；

流速：0.3mL /min；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：50μL；

質(zhì)譜操作條件：

a）離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子；

b）掃描方式：選擇離子掃描監(jiān)測(cè)；定性離子的質(zhì)荷比為：129、127、113、111；定量離子的質(zhì)荷比為129；

c）電離電壓：2.6kV；錐孔電壓：35v；

d）離子源溫度：125℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：50L/h；霧化氣流速：700L/h。

上述確證檢測(cè)方法，所述標(biāo)樣是指0.1μg/mL的溴酸根溶液。

上述確證檢測(cè)方法，其步驟（1）的具體操作為：

稱(chēng)取2.0g經(jīng)粉碎、混勻后的面包試樣，置于50mL具塞離心管中，加入10mL超純水，室溫下震蕩、超聲提取10min；然后于3000rpm離心3min，取上層溶液1mL，用0.22μm水相微孔濾膜過(guò)濾，得試樣。

面包中的溴酸根用超純水提取，經(jīng)過(guò)離心濾后，使用液相色譜分離，再用單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，通過(guò)溴酸根保留時(shí)間和四個(gè)定性離子及其相對(duì)豐度比進(jìn)行定性確證，以定量離子（m/z129）質(zhì)量色譜圖中溴酸根的峰面積進(jìn)行定量。

本發(fā)明的液相色譜流動(dòng)相中添加了離子對(duì)試劑“四丁基氫氧化銨”，其作用為實(shí)現(xiàn)了溴酸根的保留和有效分離及保證液相色譜-質(zhì)譜方法的順利進(jìn)行。溴酸根是一種水溶性的強(qiáng)極性物質(zhì)，在反相色譜柱上沒(méi)有保留，無(wú)法與其他水溶性成分分離。而加入離子對(duì)試劑“四丁基氫氧化銨”之后，則實(shí)現(xiàn)了溴酸根的保留和有效分離。另外，離子對(duì)試劑因其特有的親水親油結(jié)構(gòu)易對(duì)質(zhì)譜造成污染，所以，液相色譜-質(zhì)譜方法通常不能使用離子對(duì)試劑。但是，本發(fā)明的“四丁基氫氧化銨”是一種揮發(fā)性離子對(duì)試劑，能夠與高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)良好兼容，避免了離子對(duì)試劑在離子源和質(zhì)譜儀內(nèi)的蓄積導(dǎo)致的污染，突破了離子對(duì)色譜不能與質(zhì)譜利用的限制，方法檢出限低至0.02mg/kg，遠(yuǎn)低于現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)0.5mg/kg的水平，解決了低含量溴酸鹽檢測(cè)的難題。本發(fā)明拓展了有機(jī)質(zhì)譜儀的應(yīng)用范圍，成功實(shí)現(xiàn)了無(wú)機(jī)成分的檢測(cè)。

本發(fā)明利用溴酸根的天然同位素特征，設(shè)計(jì)了以溴酸根的一對(duì)同位素離子（129、127）和其脫去一分子氧的碎片離子的同位素離子（113、111）作為定性離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，將保留時(shí)間和四個(gè)離子的相對(duì)豐度比作為定性確證的依據(jù)，有力排除了假陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明之所以以m/z129、而不是m/z127、113、111作為定量離子是根據(jù)溴酸根的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的；m/z129是其完整的分子結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的質(zhì)荷比，113和111是其丟失一個(gè)氧原子的結(jié)構(gòu)碎片的質(zhì)荷比，此二離子的穩(wěn)定性不如129和127 ，而127是其同位素峰，因此使用m/z129定量。

本發(fā)明的有益效果

1、隨機(jī)測(cè)定了市售的面包樣品103個(gè)，在其中3個(gè)面包中檢出溴酸鉀殘留，檢出值分別為0.033mg/kg、0.029mg/kg、0.048mg/kg，若參照GB/T 20188-2006標(biāo)準(zhǔn)，根本無(wú)法檢出；該結(jié)果充分表明，本發(fā)明用于面包中溴酸鉀的測(cè)定具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)；

2、樣品前處理僅需15min（超聲提取10min+離心分層3min+過(guò)濾2min）；103個(gè)面包樣品檢測(cè)在24小時(shí)內(nèi)全部完成，充分體現(xiàn)了本發(fā)明快速簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)；

3、樣品的前處理僅需用到10mL超純水，消耗的試劑成本幾乎可以忽略不計(jì)；若使用其他方法，僅固相萃取柱的消耗至少在30元以上。本發(fā)明具有顯著的成本優(yōu)勢(shì)；

4、本發(fā)明依據(jù)溴酸鉀的結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)了溴酸鉀的定性檢測(cè)方法，同時(shí)考察保留時(shí)間、四個(gè)定性離子及同位素峰的相對(duì)豐度比等定性數(shù)據(jù)，因此具有準(zhǔn)確確證的能力。

5、本發(fā)明所用有機(jī)質(zhì)譜儀（液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀），是所有質(zhì)譜儀器中市場(chǎng)占有率最高的產(chǎn)品，目前在國(guó)內(nèi)食品安全檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室普及程度非常高，國(guó)內(nèi)大多數(shù)食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室均有配備，一般熟悉色譜質(zhì)譜的檢驗(yàn)人員均可操作，具有很好的推廣應(yīng)用前景。所用儀器較為常用，具有較強(qiáng)的可操作性。

附圖說(shuō)明

圖1為溴酸根標(biāo)樣總離子流圖（TIC）與四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖；

圖2為實(shí)施例1面包試樣的總離子流圖（TIC）與四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、 標(biāo)樣配制

將1000μg/mL的溴酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用超純水稀釋至10μg/mL，再用超純水稀釋至0.1μg/mL，此溶液作為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)樣）。

2、樣品前處理

稱(chēng)取2.0g經(jīng)粉碎、混勻后的面包試樣，置于50mL具塞離心管中，加入10mL超純水，室溫下震蕩、超聲提取10min。取出后于3000rpm離心3min。取上層溶液1mL，經(jīng)0.22μm水相微孔濾膜過(guò)濾，所得濾液即為試樣。

3、儀器與操作條件

3.1儀器：液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀，帶有電噴霧電離源。

3.2液相色譜參數(shù)：

a）色譜柱：150×2.1mm(i,d),內(nèi)填X Terra^TM MS C18（美國(guó)Waters公司），5μm；

b）流動(dòng)相：乙腈—1.5mmol/L四丁基氫氧化銨水溶液（體積比45:55）；

流速：0.3mL /min；

柱溫：35℃；

進(jìn)樣體積：50μL。

3.3 質(zhì)譜操作條件

a）離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子；

b）掃描方式：選擇離子掃描監(jiān)測(cè)；定性離子質(zhì)荷比：129、127、113、111；定量離子質(zhì)荷比：129；

c）電離電壓：2.6kV；錐孔電壓：35v；

d）離子源溫度：125℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：50L/h；霧化氣流速：700L/h。

4、在上述條件下分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定；分別獲得標(biāo)樣和試樣的總離子流圖（圖1、2所示）；自標(biāo)樣和試樣的總離子流圖中，分別提取溴酸根四個(gè)定性離子質(zhì)量色譜圖（圖1、2所示）。若獲得的樣品總離子流圖中存在與標(biāo)樣相符的色譜峰，即可初步確認(rèn)試樣中含有溴酸根；若獲得的樣品總離子流圖中不存在與標(biāo)樣相符的色譜峰，即表明試樣中不含有溴酸根。在初步確認(rèn)含有溴酸根的情況下，進(jìn)一步確證是否含有溴酸根，以排除假陽(yáng)性。將試樣的四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖分別與標(biāo)樣的四個(gè)定性離子的質(zhì)量色譜圖進(jìn)行比對(duì)；若試樣的四個(gè)離子的色譜峰保留時(shí)間及相對(duì)豐度比均與標(biāo)樣的一致，即可確證檢測(cè)結(jié)果（試樣中含有溴酸根）。

5、采用外標(biāo)法定量：根據(jù)定量離子（m/z129）質(zhì)量色譜圖中溴酸根的峰面積進(jìn)行定量計(jì)算；計(jì)算公式如下：

X＝(c·As/A）×v/m ……………………………（1）

式中：

X－樣品中溴酸根離子的含量，mg/kg；

c－標(biāo)樣溶液中溴酸根離子的濃度，μg/mL；

As－樣品溶液中溴酸根離子的峰面積；

A－標(biāo)樣溶液中溴酸根離子的峰面積；0.048

v－樣品中加入的提取液體積，mL；

m－稱(chēng)取的樣品質(zhì)量，g。根據(jù)圖1、2，所得計(jì)算結(jié)果為0.048mg/kg；即被測(cè)樣品中溴酸根的濃度為0.048mg/kg。