本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇的檢測方法，具體涉及一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測方法。

背景技術(shù)：

沙丁胺醇是一種β受體激動劑，可以作為藥物用于臨床醫(yī)學中呼吸道疾病的治療，也作為瘦肉精用于改變動物體內(nèi)的肥瘦肉比例以提高飼料轉(zhuǎn)化率。在家畜的體內(nèi)，沙丁胺醇可以很大程度上使肥肉轉(zhuǎn)化為瘦肉，從而使家畜得到更大的經(jīng)濟利益。沙丁胺醇亦可用作運動員提高身體興奮度的興奮劑。在大多數(shù)國家和地區(qū)(例如中國和印度)，由于沙丁胺醇對于人體的危害巨大，沙丁胺醇的使用是明令禁止的，但在很多地方，由于使用沙丁胺醇造成的食物中毒事件仍在發(fā)生。因此，一種簡單的、低成本的、快速的、靈敏度高的、特異性強的食品中沙丁胺醇的檢測方法是具有重要意義的。

當前，用于沙丁胺醇的檢測方法有ELISA法、毛細管電泳法、高效液相色譜(HPLC)法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法等。這些方法在沙丁胺醇的檢測中有各自的特點，在實際應用中也有各自的不足。例如：在過去興起沿用至今的免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法由于無法克服抗體的交叉反應性，已經(jīng)證實是不適合沙丁胺醇的檢測的。又如，近幾年，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法廣泛的用于沙丁胺醇的鑒定和檢測，但是由于沙丁胺醇的強極性和低揮發(fā)性，使得沙丁胺醇的檢測耗時多，操作過程繁瑣，成本高。再如，比起氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法更有效率的是液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，但由于需要同位素內(nèi)標，使得液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法非常昂貴，在大多數(shù)實驗室不能得到普及，近年來被廣泛地應用于微量目標化合物的測定。由于沙丁胺醇不具有熒光基團，一般采用HPLC-DAD進行檢測，但檢測靈敏度低且易受內(nèi)源物質(zhì)的干擾。因此，為了更靈敏檢測沙丁胺醇，一般需要用熒光試劑對其進行衍生化處理，使沙丁胺醇具有熒光基團，從而能順利的利用熒光檢測方法進行選擇性檢測。目前，常用試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯(AQC)，4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)，1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)等，這些試劑均存在諸多不足，如6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯(AQC)已成為了一種廣泛使用的柱前熒光衍生試劑，但是其衍生物在水溶液中的熒光強度僅是純乙腈中的10％，造成早洗脫的氨基酸衍生物通常比晚洗脫的氨基酸衍生物檢測限高1～2數(shù)量級。4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)試劑在水溶液中的穩(wěn)定性較差,見光容易分解,1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)不僅穩(wěn)定性差，其衍生物還伴有熒光猝滅現(xiàn)象，造成檢測靈敏度下降。

此外，對肉類等食品進行沙丁胺醇檢測時，需要對樣品進行提取，以便后續(xù)的檢測。目前，常用于沙丁胺醇的樣品前處理方法有固相萃取(SPE)。SPE萃取的方式是利用固體吸附劑吸附目標物，與樣品基體及干擾物分離，再經(jīng)洗脫而實現(xiàn)待測物的分離和富集，萃取方式提取時間長、提取率低、樣本量大，有機溶劑消耗量也較大，檢測耗時多，使應用受限。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測方法，該方法操作簡便、省時、省力，檢測靈敏度高，為沙丁胺醇的檢測提供了新的思路。

近幾年，超聲輔助分散液液微萃取(UA-DLLME)作為一個新興的前處理方法由于擁有操作簡單、快速、省時顯著、節(jié)約化學試劑、良好的恢復和高富集系數(shù)、低功耗等優(yōu)點被廣泛的應用。本發(fā)明中，我們首次使用BCEC-Cl作為熒光標記試劑，結(jié)合超聲輔助分散液液微萃取(UA-DLLME)技術(shù)對飼料和肉類食品中的沙丁胺醇進行檢測，先對樣品進行熒光標記(也稱為熒光衍生化處理)，再使用UA-DLLME技術(shù)進行萃取，并且經(jīng)過研究得到了合適的熒光標記條件和萃取條件，使沙丁胺醇的高效液相色譜熒光檢測法的檢測靈敏度大大提升。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測方法，該方法采用高效液相色譜熒光檢測法進行檢測，所用的待測樣品溶液的制備包括以下步驟：

(1)沙丁胺醇的初步提?。簩暳匣蛉忸愂称酚靡译婧退幕旌先芤撼曒腿。x心所得萃取上清液在氣體保護下干燥，然后用水溶解、過膜除雜，得初步樣品溶液；

(2)用熒光試劑2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯對初步樣品溶液進行熒光標記；

(3)熒光標記的初步樣品溶液的超聲輔助分散液液微萃?。簩⒙然c溶液和熒光標記初步樣品溶液混合，然后與分散劑與萃取劑的混合液混合，所得混合液在超聲萃取后離心分離，取底層液體，用保護性氣體吹干，然后用甲醇復溶，過膜除雜，得待測樣品溶液。

本發(fā)明熒光標記的步驟發(fā)生在初步樣品進行超聲輔助分散液液微萃取前，即先用熒光試劑對初步樣品溶液中的沙丁胺醇進行熒光標記，再進行超聲輔助分散液液微萃取。熒光標記和超聲輔助分散液液微萃取彼此協(xié)同，提高了萃取率，通過熒光標記既有利于樣品中沙丁胺醇的充分提取又提高了檢測的準確性和靈敏度。如果先進行超聲輔助分散液液微萃取再進行熒光標記，樣品中沙丁胺醇的萃取率將大大降低，降低了后續(xù)的檢測效果。

所用熒光試劑也可以稱之為衍生化試劑。本發(fā)明通過實驗，選擇2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯，簡稱BCEC-Cl作為熒光試劑。與其他熒光試劑相比，本發(fā)明所用的BCEC-Cl穩(wěn)定性好、檢測靈敏度更高。該BCEC-Cl可以按照現(xiàn)有技術(shù)公開的方法制備，例如文獻：Wu H,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents of six steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in chicken,fish and aquaculture pond water samples using pre-column derivatization and dispersive liquid–liquid microextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Food chemistry,2016,192:98-106.

進一步的，飼料或肉類食品烘干后再進行提取。

進一步的，熒光標記包括以下步驟：取4ml pH 7-10的緩沖溶液，加入40μL初步樣品溶液，然后加入熒光試劑乙腈溶液，震蕩后密封，在20-60℃反應10-30min，即得熒光標記的初步樣品溶液。

上述熒光標記步驟中，熒光試劑的用量遠大于其理論需求量。

上述熒光標記步驟中，pH優(yōu)選為8.5-9.0。反應溫度為優(yōu)選為40-50℃，反應時間優(yōu)選為10-15min。

上述方法中，采用超聲輔助分散液液微萃取對待檢樣品進行提取，操作簡單、快速、省時，降低了有機溶劑的使用量，大大提高了檢測效率。本發(fā)明方法可以用于飼料或肉類食品中沙丁胺醇的檢測，所述的肉類食品包括雞肉、豬肉、魚肉等生肉或熟肉，還包括以這些肉類為原料進行加工得到的半成品或成品。

上述步驟(1)中，乙腈和水的混合溶液中，乙腈的體積含量優(yōu)選為80％。

上述步驟(1)中，飼料或肉類食品用乙腈和水的混合溶液進行超聲萃取，混合溶液的量可以自行調(diào)整，超聲的時間一般為5min，快速、省時。

上述步驟(1)中，每1g飼料或肉類食品經(jīng)超聲萃取、干燥所得的提取物用1ml水溶解。用水溶解后的液體最好用0.22μm的膜過濾除雜。

上述步驟(3)中，所述分散劑為乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，優(yōu)選為丙酮。

上述步驟(3)中，所述萃取劑為二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，優(yōu)選為二氯甲烷。

上述步驟(3)中，分散劑、萃取劑和待測樣品溶液的體積比為500-1500μL：50-150μL：1.5-5.5ml，優(yōu)選為1400μL：145μL：4ml。

上述步驟(3)中，氯化鈉在混合液中的重量體積分數(shù)為0-5％，不包括0％，優(yōu)選為1％。

上述步驟(3)中，超聲萃取時間為2-6min，優(yōu)選為2.5min。該萃取時間短、效率高，省時省力。

步驟(3)中，每4ml初步樣品溶液經(jīng)超聲輔助分散液液微萃取、保護性氣體吹干所得的產(chǎn)物用0.5ml甲醇復溶。

進一步的，本發(fā)明檢測方法采用外標法檢測飼料或肉類食品中的沙丁胺醇。同樣的，外標法所用的沙丁胺醇標準品在進入高效液相色譜儀前采用與初步樣品溶液同樣的熒光標記方法進行熒光標記。步驟包括：取沙丁胺醇標準品溶液，調(diào)整pH，然后加入熒光試劑乙腈溶液，震蕩后密封反應，即得熒光標記的沙丁胺醇標準品溶液。

進一步的，本發(fā)明高效液相色譜條件如下：色譜柱為Hypersil C18，流動相A：體積分數(shù)30％的甲醇水溶液；B:體積分數(shù)70％的甲醇水溶液，梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mLmin^-1，柱溫＝30℃；熒光檢測時，λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

本發(fā)明有益效果為：本發(fā)明提供了一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的檢測方法，該方法采用熒光衍生試劑BCEC-Cl作為熒光標記試劑，通過衍生化反應對沙丁胺醇進行熒光標記，結(jié)合超聲輔助分散液液微萃取技術(shù)對待檢樣品進行處理，系統(tǒng)的優(yōu)化了熒光標記和萃取條件，使萃取效率高、用時短、操作簡便、檢測準確度高。本發(fā)明能夠在較短時間內(nèi)完成沙丁胺醇的檢測，并且樣品使用量少、有機溶劑用量也較少，檢測效率高，成本低，沙丁胺醇的檢出限在1ng mL^-1以下，靈敏度大大提升，本發(fā)明方法能夠成功的應用到飼料和豬肉、雞肉、魚肉等實際樣品的測定中，為沙丁胺醇的檢測提供了新的思路。

附圖說明

圖1萃取劑的種類、分散劑的種類、pH值、鹽含量和樣品溶液的體積與峰面積的關(guān)系曲線。

圖2時間和萃取劑對響應值的影響的響應面圖。

圖3時間和分散劑對響應值的影響的響應面圖。

圖4萃取劑和分散劑對響應值的影響的響應面圖。

圖5沙丁胺醇的標準品色譜圖(A)和市購豬肉樣品(B)所得的HPLC色譜圖。

圖6市購雞肉樣品(C)和魚肉樣品(D)所得的HPLC色譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明原理及優(yōu)勢進行解釋和說明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明。下述說明僅是示例性的，并不對其內(nèi)容進行限定。

實施例1超聲輔助分散液液微萃取條件的篩選與優(yōu)化

1、儀器與試劑

Agilent 1100HPLC–FLD(美國，Agilent公司)配四元梯度泵，在線真空脫氣機，自動進樣器；半制備高效液相色譜(Waters600E，美國，Waters公司)，Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)色譜柱(Agilent公司)。

衍生試劑(即熒光試劑)2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl，自制).

沙丁胺醇(美國sigma公司)，乙腈(光譜純，德國，Merck公司)，二氯甲烷(CH₂Cl₂,分析純，中國禹王試劑公司)，氯仿(CHCl₃,分析純，中國禹王試劑公司)，四氯化碳(CCl₄,分析純，中國禹王試劑公司)，丙酮(分析純，中國禹王試劑公司)，甲醇(光譜純，德國，Merck公司)，乙醇(光譜純，德國，Merck公司)，水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

2、色譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動相A：體積分數(shù)30％甲醇水溶液；流動相B:體積分數(shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mLmin^-1,進樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

3、標準溶液配制

(1)沙丁胺醇標準品儲備液：準確取一定量沙丁胺醇標準品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

4、外標標準品和實際樣品處理

4.1因?qū)嶋H樣品中一般不含沙丁胺醇，所以采用在樣品中加入沙丁胺醇的方式模擬含有沙丁胺醇的樣品。取從當?shù)爻?山東曲阜，中國)購買的豬肉、雞肉或魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉、雞肉或魚肉粉，按照5μg/kg的量加入沙丁胺醇標準品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

4.2衍生化

向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應10-15min，取出冷卻后備用。衍生反應方程式如下：

4.3超聲輔助分散液液微萃取

將分散劑與萃取劑混合均勻后，用注射器打入到盛NaCl溶液和衍生化的初步樣品溶液的離心管中，超聲萃取，然后離心，取底層小液滴用氮氣吹干，用甲醇復溶，過0.22μm膜，得待測樣品溶液。

5、實驗方法及結(jié)果

5.1將衍生化(即熒光標記)的沙丁胺醇標準品儲備液用甲醇稀釋至不同濃度，然后按照上述色譜條件進行高相液相色譜檢測，繪制峰面積對沙丁胺醇濃度的標準曲線。

5.2為了獲得更高的萃取效率，對影響超聲輔助分散液液微萃取的六個重要的參數(shù)(萃取劑的種類和分散劑的種類，pH值，鹽效應和樣品溶液的體積)進行了單因素優(yōu)化，各參數(shù)與峰面積的關(guān)系曲線見圖1。

5.2.1萃取劑的種類的影響

萃取劑可以顯著影響液液微萃取的提取效率。本發(fā)明選擇氯化溶劑(例如二氯甲烷，氯仿和四氯化碳)作為萃取劑，該類萃取劑具有水溶解度低，密度大于水，能溶解分析物等特點。結(jié)果表明，二氯甲烷，氯仿和四氯化碳都可以取得一定的提取效果，但二氯甲烷比其他的提取效果要好，更適合擁有羥基和叔胺官能團的沙丁胺醇的萃取。因此，二氯甲烷為優(yōu)選的萃取劑。

5.2.2分散劑的種類的影響

分散劑的作用是使各成分充分混溶，本發(fā)明選取乙腈，丙酮，甲醇和乙醇作為分散劑。結(jié)果表明，丙酮比其他溶劑更適合作為沙丁胺醇的提取劑。因此，丙酮為優(yōu)選的分散劑。

5.2.3pH值的影響

待檢樣品溶液的pH可以顯著影響提取效率，尤其是當目標為堿性或酸性化合物時。本次對溶液的pH值(由4至10)進行了的研究。結(jié)果表明，不同的pH值對提取結(jié)果無明顯影響，這主要是因為在超聲輔助分散液液微萃取之前，沙丁胺醇的酚羥基和胺基已經(jīng)被衍生試劑的基團取代，因此，選擇中性的pH。

5.2.4鹽效應的影響

離子強度的增加會導致分析物在樣品溶液中的溶解度下降，從而可以提高提取效率。為調(diào)查離子強度對超聲輔助分散液液微萃取的提取效率的影響，本發(fā)明研究了在其他實驗條件保持恒定的情況下，控制樣品溶液中NaCl的濃度(0～5％，重量/體積)對萃取效率的影響。結(jié)果表明，過多的增加離子強度不會顯著提高萃取效率；與此相反，在較高的離子強度不益于沙丁胺醇的衍生產(chǎn)物的超聲輔助分散液液微萃取。因此，氯化鈉濃度選擇(1％，重量/體積)。

5.2.5樣品溶液的體積的影響

超聲輔助分散液液微萃取的提取效率可以通過增加樣品的體積得以提高，因為增加的樣本體積可為目標化合物從水相轉(zhuǎn)移到萃取劑的有機相提供一個正向的效應。本發(fā)明考察了樣品體積從1.5mL到5.5mL對超聲輔助分散液液微萃取的影響。結(jié)果表明，樣品體積由1.5mL增加至4mL,峰面積的波動較?。挥?.5mL增加至5.5mL，峰面積反而有所降低。所以，優(yōu)選4mL為樣品體積。

5.3對提取時間(T)，萃取劑的體積(EV)和分散劑的體積(DV)采用響應面法進行優(yōu)化。

根據(jù)BBD設計，優(yōu)化包括17組實驗(見下表1)?；趯嶒灁?shù)據(jù)，獲得了可以預測的最佳點的回歸方程。預測的二階多項式模型如下：

Y＝12.60–0.40X₁+2.40X₂+2.80X₃–2.40X₁X₂+2.81X₁X₃–0.89X₂X₃–3.68X₁²–2.05X₂²–4.08X₃²

式中，Y是預測的平均峰面積；X₁，X₂和X₃分別為超聲時間(T)，萃取劑的體積(EV)和分散劑的體積(DV)。

表1響應面實驗設計

響應面曲線可以反映出各變量之間的相互作用關(guān)系(見圖2-4)。圖2展示了在分散劑的體積固定時，超聲時間和萃取劑體積之間的相互作用關(guān)系，當超聲時間由2min增加到6min時，峰面積先迅速增加，達到一個最大值，然后略有下降；萃取劑體積從50μL增加到150μL時，峰面積一直增加。圖3展現(xiàn)了當萃取劑體積一定時超聲時間和分散劑的體積之間的相互作用關(guān)系，分散劑的體積由500μL增加到1500μL時，峰面積首先表現(xiàn)是增加的趨勢，在1300μL附近達到最高值，然后有少許下降；超聲時間的趨勢是與圖2基本一致。圖4描述的是萃取劑的體積和分散劑的體積之間的相互作用關(guān)系，峰面積隨著分散劑的體積的增加表現(xiàn)為顯著增加，達到峰值后有所下降；峰面積隨著萃取劑體積的增加而增加。

上述結(jié)果表明,該模型顯著(p<0.05)，且實驗值與模型預測值之間有高度的相關(guān)性(R²＝0.9125)。通過分析實驗結(jié)果，軟件評估出的最佳超聲輔助分散液液微萃取條件分別為萃取劑體積為145μL，分散劑體積為1400μL和超聲時間為2.5min。在最佳的條件下，峰面積預測值為9.85，實際的測量值為9.98，兩者非常接近。預測值和測量值之間的良好的相關(guān)性驗證了該響應模型是適當?shù)?，足以體現(xiàn)預期的優(yōu)化。

實施例2

根據(jù)實施例1的優(yōu)化，得到了本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法，其具體如下：

1、色譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動相A：體積分數(shù)30％甲醇水溶液；流動相B:體積分數(shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mL min^-1,進樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

2、標準溶液配制

(1)沙丁胺醇標準品儲備液：準確取一定量沙丁胺醇標準品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液，備用。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

3、外標標準品和實際樣品處理

3.1精確稱取1g待飼料或測肉類食品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應10-15min，得衍生化標準品儲備液或初步樣品溶液，取出冷卻后備用。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

取4ml衍生化初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮氣吹干，用0.5mL甲醇復溶，過0.22μm膜，得待測樣品溶液。

4、檢測方法

采用外標法，將衍生化的儲備液用甲醇稀釋，得到一系列不同濃度的衍生化沙丁胺醇標準溶液，采用上述色譜條件對不同濃度的標準溶液進行高相液相色譜-熒光檢測，繪制濃度對峰面積的標準曲線。

取衍生化的待測樣品溶液，按照相同的色譜條件進行高相液相色譜-熒光檢測，得到峰面積，根據(jù)峰面積計算沙丁胺醇的含量。

5、為了檢測該方法的可行性，根據(jù)USP指導對該方法進行驗證。方法驗證具體如下：

5.1標準曲線線性范圍和檢出限、定量限

步驟：用沙丁胺醇標準品儲備液制成0-1000ngmL^-1的一系列標準溶液，繪制沙丁胺醇濃度對峰面積的標準曲線。以3倍基線噪聲所對應的沙丁胺醇的濃度為其檢測限，以10倍基線噪聲所對應的沙丁胺醇的濃度為其定量限。

結(jié)果：本方法在0-1000ng mL^-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，所得線性回歸方程見表2，其相關(guān)性系數(shù)為0.9998。經(jīng)驗證，其LOD(S/N＝3：1)和LOQ(S/N＝10：1)分別為0.2ng mL^-1和1.1ng mL^-1，這表明，該方法具有良好的靈敏度。

表2線性回歸方程，R，檢出限，定量限，重現(xiàn)性和精度

將本發(fā)明方法和現(xiàn)有技術(shù)中報道的其他樣品處理方法和分析方法所得的沙丁胺醇的檢測限和定量限進行比較，結(jié)果如下表3所示。從表中可以看出，在樣品處理方面，相比SPE，本發(fā)明UA-DLLME可以克服SPE操作繁瑣的缺點，展現(xiàn)出包括操作簡單，省時顯著，節(jié)約化學試劑和具有良好的高富集系數(shù)低等優(yōu)勢。在靈敏度方面，本發(fā)明所建立的方法具有其他方法更低LOD和LOQ。MS雖然能提供較低的檢測極限，但其需要同位素內(nèi)標，設備是昂貴的，且并沒有達到普及的水平，而與MS相比，本發(fā)明具有高效率和靈敏度的HPLC-FLD方法能被廣泛地應用于常見的實驗室中。此外，本發(fā)明熒光標記和隨后的UA-DLLME的超聲時間分別為10min和2.5min，時間短，省時高效。

表3方法比較

文獻1：Tyagi A,Sharma N,Mittal K,et al.HPTLC-Densitometric and RP-HPLC Method Development and Validation for Determination ofSalbutamol Sulphate,Bromhexine Hydrochloride and Etofylline in Tablet Dosage Forms[J].PharmaceuticaAnalyticaActa,2015:1-5

文獻2：Rosales‐Conrado N,Dell'Aica M,León‐González M E,et al.Determination of salbutamol by direct chiral reversed‐phase HPLC using teicoplanin as stationary phase and its application to natural water analysis[J].Biomedical Chromatography,2013,27(11):1413-1422.

文獻3：Zhang D,Teng Y,Chen K,et al.Determination of salbutamol in human plasma and urine using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study[J].Biomedical Chromatography,2012,26(10):1176-1182.

文獻4：Wu Y Y,Shi W X,Chen S Q.Determination of beta-estradiol,bisphenol A,diethylstilbestrol and salbutamol in human urine by GC/MS[J].Medical sciences,2009,38(3):235-241.

5.2重復性和精確度

在相同的最佳色譜條件下平行檢測6次，得到的保留時間和峰面積的RSD分別為0.03％和0.51％,重復性良好。連續(xù)3天內(nèi)對沙丁胺醇的衍生物平行分析6次，測得的日內(nèi)平均和日間平均的精密度分別為0.4％和1.2％，見表2。

5.3準確度

按照表4的數(shù)據(jù)向?qū)嶋H樣品中添加已知的三個不同濃度的標準品(1μg/kg，5μg/kg和10μg/kg)并測其回收率，測得的回收率結(jié)果見表4。由表4可知，回收率在95.0-101.4％的范圍內(nèi)，且RSD小于3.1％。

表4實際樣品的回收率(n＝6)

5.4魯棒性

魯棒性是考察對分離的色譜條件進行較小的改變對分離結(jié)果的影響。對流速和柱溫分別進行1±0.2mg·mLmin^-1和30±1℃的改變，得到了觀察微不足道的變化，表明魯棒性良好。

綜上所述，該方法具有良好的線性，滿意的重復性，可接受的魯棒性，良好的精密度和準確度，具有可應用性。

實施例3

以豬肉為樣品，對衍生化條件進行篩選和優(yōu)化，方法如下：

1、色譜條件

同實施例2。

2、標準溶液配制

同實施例2。

3、外標標準品和實際樣品處理

3.1取從當?shù)爻匈徺I的豬肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉粉，按照2μg/kg的量加入沙丁胺醇標準品，攪拌混勻，作為待檢樣品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

按照下述四種方法進行衍生化處理：

方法一：向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9.0的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應10-15min，取出冷卻后備用。

方法二：向10mL離心管中加入4mLpH＝7-8的硼酸鈉緩沖鹽，60μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，90μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于20-25℃反應30min，取出冷卻后備用。

方法三：向10mL離心管中加入4mLpH＝9.5-10的硼砂氫氧化鈉緩沖液，40μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于55-60℃反應10min，取出冷卻后備用。

方法四：向10mL離心管中加入4mLpH＝5-6的磷酸鹽緩沖液，60μL沙丁胺醇標準品儲備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于80℃反應10min，取出冷卻后備用。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

將上述四種方法得到的衍生化初步樣品溶液分別按照實施例23.3的超聲輔助分散液液微萃取方法進行萃取，得到待測樣品溶液1、2、3、4。

4、檢測方法

采用外標法，對衍生化的待測樣品溶液進行檢測，各樣品中沙丁胺醇的峰面積和含量如下表5所示。

表5

從以上結(jié)果可以看出，衍生化時pH、反應溫度和反應時間對檢測結(jié)果均有影響，衍生化條件為：pH8.5-9.0，反應溫度40-50℃、反應時間10-15min時效果最佳。

實施例4

采用本發(fā)明方法對本地豬肉、雞肉和魚肉中沙丁胺醇的含量進行檢測，方法如下：

1、色譜條件

同實施例2。

2、標準溶液配制

同實施例2。

3、外標標準品和實際樣品處理

3.1取從當?shù)爻匈徺I豬肉、雞肉和魚肉，烘干后粉碎。分別精確稱取1g豬肉、雞肉和魚肉粉，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

同實施例2。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

同實施例2。

4、檢測方法

采用外標法，對衍生化的待測樣品溶液進行檢測，各樣品所得的色譜圖如圖5和6所示。從圖中可以看出，豬肉、魚肉和雞肉中均未檢測到沙丁胺醇，由此可知，該地區(qū)對沙丁胺醇的控制還是十分有效的。

對比例1

以豬肉和魚肉作為待檢樣品，按照實施例2的方法制備待測樣品溶液和對待測樣品溶液進行檢測，不同的是：初步樣品溶液先進行分散液液微萃取，再進行熒光標記，步驟如下：

取從當?shù)爻?山東曲阜，中國)購買的豬肉或魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉或魚肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇標準品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

取4ml初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮氣吹干，用0.5mL甲醇復溶，過0.22μm膜，備用。

向10mL離心管中加入4mLpH＝9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標準品儲備液或液液微萃取后的初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于50℃反應10min，取出冷卻，得待測樣品溶液。

采用外標法，待測樣品溶液進行檢測，結(jié)果如下表6所示。

表6

對比例2

1、色譜條件

同實施例2。

2、標準溶液配制

同實施例2。

3、外標標準品和實際樣品處理

3.1取從當?shù)爻匈徺I豬肉和魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉和魚肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇標準品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

同實施例2。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

取4ml初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為6％，然后加入36μL二氯甲烷(萃取劑)和1645μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮氣吹干，用0.5mL甲醇復溶，過0.22μm膜，備用。

4、檢測方法

采用外標法，對衍生化的待測樣品溶液進行檢測，結(jié)果見下表7。

表7

對比例3

采用實施例2的方法檢測食品中萊克多巴胺的含量，步驟如下：

1、標準溶液配制

(1)萊克多巴胺標準品溶液：準確取一定量萊克多巴胺標準品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

2、樣品溶液配制

因?qū)嶋H樣品中一般不含萊克多巴胺，所以采用在樣品中加入萊克多巴胺的方式模擬含有萊克多巴胺的樣品。精確稱取1g豬肉，干燥后粉碎，按照10μg/kg的量加入萊克多巴胺標準品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮氣下干燥，再用1mL水溶解，然后通過0.22μm的尼龍過濾器過濾，得初步樣品溶液。

3、衍生化處理

3.1、向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL萊克多巴胺標準品溶液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應10-15min，取出冷卻后備用。

3.2、取4ml衍生化初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮氣吹干，用0.5mL甲醇復溶，過0.22μm膜，得待測樣品溶液。

4、HPLC-FLD檢測

4.1采用外標法，將衍生化的儲備液用甲醇稀釋，得到一系列不同濃度的衍生化萊克多巴胺標準溶液，采用下述色譜條件對不同濃度的標準溶液進行高相液相色譜-熒光檢測，繪制濃度對峰面積的標準曲線。色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動相A：體積分數(shù)30％甲醇水溶液；流動相B:體積分數(shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mL min^-1,進樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

4.2取衍生化的待測樣品溶液，按照相同的色譜條件進行高相液相色譜-熒光檢測，結(jié)果如表8所示。

表8