本發(fā)明屬于中藥分析技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份的含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

苦丁茶是冬青科冬青屬的干燥葉子，廣泛分布在中國的海南、湖北、廣東、廣西和湖南等省份。它作為預防脂代謝異常相關(guān)性疾病的民族藥，在民間已經(jīng)應用了上千年，目前研究表明其對心血管類疾病和代謝綜合癥具有顯著藥理活性，已成為當前藥食同源研究的熱點?；谄淇寡趸兔庖哒{(diào)節(jié)的特點，苦丁茶通常被應用臨床輔助治療糖尿病、高血壓、肥胖、高脂血癥，并且已經(jīng)開發(fā)出各種保健產(chǎn)品。

苦丁茶中的藥物活性成分被認為是酚酸、三萜皂苷和黃酮類化合物，它們也被認為是化學分析和質(zhì)量評價的主要成分。為了更有效的利用該藥材資源，亟須一種準確、可靠并能夠進行多成分同時含量測定的方法。

但是，目前報道的大部分定量方法由于受限于對照品的瓶頸問題，特別其大部分三萜皂苷類成分多來源于實驗室自制，傳統(tǒng)的測定方法難以普及。因此，苦丁茶的質(zhì)量檢驗和監(jiān)督仍然是一個挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份的含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法。利用“一測多評”法、指紋圖譜、化學模式識別以及相似度分析、主成分分析和聚類分析，基于18種成分(包括8種酚酸，7種三萜類、1種黃酮類和2個其它類別成分)的含量數(shù)據(jù)，對來自中國不同產(chǎn)地的15批藥材進行了模式識別分析，同時進行含量測定。

本發(fā)明的目的是提供一種可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份的含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法。

本發(fā)明另一目的是提供上述方法的應用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份的含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法，包括如下步驟：

S1.色譜條件：

柱溫：30℃；

檢測波長：210nm，260nm，326nm；

流速：1.0ml/min；

進樣量：20μl；

流動相：A為0.05％磷酸-H₂O，B為乙腈，C為甲醇；

S2.對照品溶液的制備：

稱取蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A標準品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成含蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A的混合對照品溶液，繪制標準曲線；

S3.供試品溶液的制備：

精密稱定苦丁茶細粉，甲醇室溫浸漬后冰浴超聲提取，0.45μm濾過，即得供試品溶液；

S4.成分含量計算：

進樣供試品溶液，記錄苦丁茶中18個組分在相應波長處的峰面積，用標準曲線計算出三個內(nèi)參物的濃度，再結(jié)合相對校正因子RCFx按下式即可計算出其他15種組分的濃度，繼而計算出其在苦丁茶中的含量：

待測組分的濃度C_x由下式計算得出：

其中，A_x為內(nèi)參物對照品峰面積，Ai為待測成分對照品峰面積；Ci為待測成分對照品濃度；

每個組分所對應的RCFx分別為：

其中，優(yōu)選地，步驟S1所述色譜條件為：

色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RPC18columns，4.6mm×250mm,5μm；

柱溫：30℃；

檢測波長：210nm，254nm，326nm；

流速：1.0ml/min；

進樣量：20μl；

流動相：A為0.05％磷酸-H₂O，B為乙腈，C為甲醇，按下面進行梯度洗脫：

時間0.0min，A相94％，B相6％；

時間5min，A相94％，B相6％；

時間15min，A相88％，B相12％；

時間25min，A相84％，B相16％；

時間26min，A相77％，B相20％，C相3％；

時間45min，A相77％，B相20％，C相3％；

時間50min，A相74％，B相26％；

時間70min，A相74％，B相26％；

時間85min，A相71％，B相29％；

時間110min，A相54％，B相46％；

時間110.01min，A相10％，B相90％；

時間120min，A相10％，B相90％。

優(yōu)選地，步驟S2所述對照品溶液的制備方法為：稱取蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A標準品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成含蘆丁100.0μg·ml^-1，異綠原酸A 1000μg·ml^-1、苦丁冬青甙A 1000μg·ml^-1、的混合對照品溶液；以此作為標準曲線的最高濃度，分別稀釋2、4、8和20倍，用作繪制標準曲線。

優(yōu)選地，步驟S3所述供試品溶液的制備方法為：取苦丁茶細粉0.2g，精密稱定，20.0ml甲醇室溫浸漬30min；冰浴超聲提取30min，放冷至室溫，補足重量，搖勻，0.45μm濾過，即得供試品溶液。

優(yōu)選地，步驟S4所述苦丁茶中18個組分在相應波長處是指：

260nm，以蘆丁為內(nèi)參物，對應：6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃，相對保留時間0.3253；羥基酪醇葡萄糖苷，相對保留時間0.385；原兒茶酸，相對保留時間0.420；苦丁冬青甙E，相對保留時間3.026；苦丁冬青甙D，相對保留時間3.116；

210nm，以苦丁冬青甙A為內(nèi)參物，對應：大葉冬青苷G，相對保留時間0.803；苦丁冬青甙G，相對保留時間0.912；苦丁茶冬青苷T，相對保留時間1.208；大葉冬青苷H，相對保留時間1.215；

326nm，以異綠原酸A為內(nèi)參物，對應：新綠原酸，相對保留時間0.401；綠原酸，相對保留時間0.551；隱綠原酸，相對保留時間0.574；咖啡酸，相對保留時間0.629；異綠原酸B，相對保留時間0.948；異綠原酸C，相對保留時間1.105。

即如下表所示：

注：^a代表以蘆丁為內(nèi)參物；^b代表以異綠原酸A為內(nèi)參物；

^c代表以苦丁冬青甙A為內(nèi)參物。

另外，上述方法在苦丁茶的質(zhì)量控制方面的應用也在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明上述方法主要基于本發(fā)明研究得到的各組分的相對校正因子，獲得方法如下：是以蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A為內(nèi)參物，計算蘆丁對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃、羥基酪醇葡萄糖苷，異綠原酸A對原兒茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸C，以及苦丁冬青甙A對大葉冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大葉冬青苷H的相對校正因子，將其作為常數(shù)用于含量測定。具體地，包括如下步驟：

(1)確定色譜條件；

(2)對照品溶液的制備；

(3)供試品溶液的制備；

(4)校正因子的計算。

更具體地，上述可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份的含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法，步驟如下：

(1)色譜條件：

色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RPC18columns(4.6mm×250mm,5μm)

柱溫：30℃；檢測波長：210nm，254nm，326nm；

流速：1.0ml/min；

進樣量：20μl；

流動相：A為0.05％磷酸-H₂O，B為乙腈，C為甲醇，按下面進行梯度洗脫：

時間0.0min，A相94％，B相6％；

時間5min，A相94％，B相6％；

時間15min，A相88％，B相12％；

時間25min，A相84％，B相16％；

時間26min，A相77％，B相20％，C相3％；

時間45min，A相77％，B相20％，C相3％；

時間50min，A相74％，B相26％；

時間70min，A相74％，B相26％；

時間85min，A相71％，B相29％；

時間110min，A相54％，B相46％；

時間110.01min，A相10％，B相90％；

時間120min，A相10％，B相90％；

(2)對照品的制備：

精密稱取蘆丁(R4)標準品1.580mg、6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)標準品1.550mg、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)標準品0.760mg、原兒茶酸(R3)標準品0.225mg、苦丁冬青甙E(R5)標準品1.000mg、苦丁冬青甙D(R6)標準品1.010mg，異綠原酸A(K6)標準品2.730mg、新綠原酸標準品(C1)2.260mg、綠原酸(C2)標準品1.510mg、隱綠原酸(C3)標準品1.010mg、咖啡酸(C4)標準品1.060mg、異綠原酸B(C5)標準品1.640mg、異綠原酸C(C7)標準品0.970mg、苦丁冬青甙A(K3)標準品2.130mg、大葉冬青苷G標準品2.090mg、苦丁冬青甙G標準品1.830mg、苦丁茶冬青苷T標準品1.300mg和大葉冬青苷H標準品1.210mg，分別置于容量瓶中，先加甲醇溶解再定容，搖勻，即得對照品溶液儲備液；

吸取各對照品儲備液，制成含蘆丁31.6μg·ml-1、6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃62.0μg·ml-1、羥基酪醇葡萄糖苷380.0μg·ml-1、原兒茶酸10.13μg·ml-1、苦丁冬青甙E 60.0μg·ml-1、苦丁冬青甙D 50.0μg·ml-1，異綠原酸A 1365.0μg·ml-1、新綠原酸101.7μg·ml-1、綠原酸755.0μg·ml-1、隱綠原酸101.0μg·ml-1、咖啡酸106.0μg·ml-1、異綠原酸B 106.6μg·ml-1、異綠原酸C 485.0μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1065.0μg·ml-1、大葉冬青苷G 1045.0μg·ml-1、苦丁冬青甙G 915.0μg·ml-1、苦丁茶冬青苷T 39.0μg·ml-1和大葉冬青苷H 199.7μg·ml-1的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備：

取苦丁茶細粉0.2g，精密稱定，20.0ml甲醇室溫浸漬30min；冰浴超聲提取30min，防冷至室溫，補足重量，搖勻，0.45μm濾過，即得供試品溶液；

(4)校正因子計算：

以蘆丁(R4)、異綠原酸A(C6)和苦丁冬青甙A(K3)為內(nèi)參物，計算蘆丁(R4)對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)、原兒茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，異綠原酸A(C6)對新綠原酸(C1)、綠原酸(C2)、隱綠原酸(C3)、咖啡酸(C4)、異綠原酸B(C5)、異綠原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)對大葉冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大葉冬青苷H(K5)的相對校正因子，將其作為常數(shù)用于含量測定。

具體地，在線性范圍內(nèi)，苦丁茶中成分的量與檢測器的響應成正比，蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A為內(nèi)參物，計算蘆丁(R4)對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)、原兒茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，異綠原酸A(C6)對新綠原酸(C1)、綠原酸(C2)、隱綠原酸(C3)、咖啡酸(C4)、異綠原酸B(C5)、異綠原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)對大葉冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大葉冬青苷H(K5)的相對校正因子，根據(jù)校正因子(RCF，f)的計算公式：

${\mathrm{RCF}}_x=\frac{f_x}{f_i}=\frac{A_x/C_x}{A_i/C_i}---\left(1\right)$

$C_x=\frac{C_i}{{\mathrm{RCF}}_x}\×\frac{A_x}{A_i}---\left(2\right)$

$C_x\×{\mathrm{RCF}}_x=\frac{A_x}{(A_i/C_i)}---\left(3\right)$

其中A_x為內(nèi)參物對照品峰面積，C_x為內(nèi)參物對照品濃度，Ai為待測成分對照品峰面積；Ci為待測成分對照品濃度。

試驗得到蘆丁對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃、羥基酪醇葡萄糖苷、原兒茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，異綠原酸A對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸C以及苦丁冬青甙A對大葉冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大葉冬青苷H的相對校正因子，分別為3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349。

進一步地，共有峰的確認方法如下：

S1.按照權(quán)利要求3中步驟(2)和(3)分別制備對照品溶液和供試品溶液，按步驟(1)的色譜條件，精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀中，測定并記錄色譜，即得。

S2.指標的建立及圖譜組分色譜峰判斷方法

供試品色譜中，呈現(xiàn)18個與苦丁茶指紋圖譜共有模式標準圖譜相對應的特征峰；按歐氏距離計算，供試品指紋圖譜與對照品指紋圖譜的相似度不低于0.90。以蘆丁峰為對照峰，6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃、羥基酪醇葡萄糖苷、原兒茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D共有特征峰相對保留時間分別為：0.325、0.385、0.420、3.066、3.116；以異綠原酸A峰為對照峰，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸C共有特征峰相對保留時間分別為：0.401、0.551、0.574、0.629、0.948、1.105；以苦丁冬青甙A峰為對照峰，大葉冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T、大葉冬青苷H共有特征峰相對保留時間分別為0.803、0.912、1.208、1.215，各峰相對保留時間RSD≤5％，無顯著差異。

而不同產(chǎn)地苦丁茶的相似度評價方法如下：

樣品聚類與成分分析：將供試品色譜中18個已得到定量特征性成分信息導入SPSS19.0進行樣品聚類與主成分分析，可以看到不同產(chǎn)地的苦丁茶的品質(zhì)以及成分含量與其他產(chǎn)地的差異，可作為區(qū)別藥材品質(zhì)的手段之一，18個成分可降維成兩個因子綜合代表飲片的綜合質(zhì)量。

另外，上述方法在苦丁茶的質(zhì)量控制方面的應用，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明方法所涵蓋的核心思路還可以應用于其他含有多類組份的中藥飲片或藥物制劑的質(zhì)量控制，具有廣泛的應用基礎(chǔ)。

本發(fā)明以苦丁茶中有效活性成分且含量較高的蘆丁(K4)、異綠原酸A(C6)和苦丁冬青甙A(K3)作為內(nèi)參物，計算校正因子，可實現(xiàn)僅需3種常見對照品即可同時測定苦丁茶中18種成分的含量，快速、經(jīng)濟、科學的控制苦丁茶的質(zhì)量，還可解決因?qū)φ掌啡狈Χ鵁o法實現(xiàn)多組分同時含量測定，全面控制苦丁茶質(zhì)量的問題。此外，利用18個成分的含量進行了藥材的聚類分析、主成份分析和相似度計算，與利用不同波長下指紋圖譜共有峰峰面積的計算結(jié)果相一致，對苦丁茶的全面質(zhì)量控制有重要意義。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明僅用中藥有效成分內(nèi)在比例關(guān)系，以蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A為內(nèi)參物，計算蘆丁(R4)對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)、原兒茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，異綠原酸A(C6)對新綠原酸(C1)、綠原酸(C2)、隱綠原酸(C3)、咖啡酸(C4)、異綠原酸B(C5)、異綠原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)對大葉冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大葉冬青苷H(K5)的相對校正因子，分別為3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349，將其作為常數(shù)用于含量測定，并考察了不同儀器、柱子、柱溫和流速對于相對校正因子的影響，通過測定蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A實現(xiàn)苦丁茶中其它15種成分的含量測定，可用于苦丁茶中成分的全面定量。

2、使用本發(fā)明色譜條件所獲得的色譜圖，不僅可實現(xiàn)18個組分的同時含量測定，還可作為指紋圖譜實現(xiàn)模式識別分析及相似度計算。采用歐氏距離計算方法，即可在對苦丁茶下進行相似度評價，即：通過一測多評對供試品進行定量，將結(jié)果導入SPSS19.0中進行聚類分析和主成分分析可對不同來源的苦丁茶進行差異性評價，更全面的評價了苦丁茶的質(zhì)量。

3、同時，試驗表明采用相對保留值法對苦丁茶中待測成分進行色譜峰定位，簡便可行。具有方法良好，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好、可操作性強的優(yōu)點，對苦丁茶的質(zhì)量控制具有重要意義。

4、中藥一般被認為是多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮藥理作用，僅靠單一成分的檢測降低了不能全面反映中藥材的質(zhì)量。本發(fā)明使用“一測多評”法，快速、便捷，只需一個對照品即可實現(xiàn)多成分的含量測定，從而克服了對照品匱乏和稀缺的問題。化學模式識別能更客觀有效的識別特定品種并評價中藥之間的相似性和差異性。

附圖說明

圖1為15個產(chǎn)地藥材中各類組分含量總和(A-盧丁和其它兩組分了；B-酚酸類；C-皂苷類)。

圖2為本發(fā)明混合對照品和供試品不同波長下的色譜圖(A代表混合對照品260nm的色譜圖，A′代表供試品在260nm下的色譜圖)。

圖3為本發(fā)明混合對照品和供試品不同波長下的色譜圖(B代表混合對照品326nm的色譜圖，B′代表供試品在326nm下的色譜圖)。

圖4為本發(fā)明混合對照品和供試品不同波長下的色譜圖(C代表混合對照品210nm的色譜圖，C′代表供試品在210nm下的色譜圖)。

圖5為15批苦丁茶樣品的聚類分析(A)和主成分分析(B)。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1可同時實現(xiàn)苦丁茶中18個組份含量分析和相似度評價的質(zhì)量控制方法

1.儀器與試藥

1.1儀器:

Waters Alliance高效液相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀，Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀，Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，Waters Symmetry C18色譜柱and ACCHROM C18色譜柱。

1.2試劑和藥品:

蘆丁對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃、羥基酪醇葡萄糖苷、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，苦丁冬青甙A，大葉冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大葉冬青苷H由苦丁茶中分離而得。原兒茶酸，異綠原酸A，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸C購自中國藥品生物制品鑒定所或四川維克奇生物科技有限公司；15批苦丁茶來自中國廣東、廣西、上海、云南、?？?；試驗中用到的試劑均為色譜純，水為超純水。

附圖1所示為15個產(chǎn)地藥材中各類組分含量總和(A-蘆丁和其它兩組分；B-酚酸類；C-皂苷類)。

2.方法與結(jié)果

2.1溶液的制備：

供試品溶液的制備：取苦丁茶細粉0.2g，精密稱定，20.0ml甲醇室溫浸漬30min，冰浴超聲提取30min，放冷至室溫，補足重量，搖勻，0.45μm濾過，即得供試品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁(R4)標準品1.580mg、6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)標準品1.550mg、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)標準品0.760mg、原兒茶酸(R3)標準品0.225mg、苦丁冬青甙E(R5)標準品1.000mg、苦丁冬青甙D(R6)標準品1.010mg，異綠原酸A(C6)標準品2.730mg、新綠原酸(C1)標準品2.260mg、綠原酸(C2)標準品1.510mg、隱綠原酸(C3)標準品1.010mg、咖啡酸(C4)標準品1.060mg、異綠原酸B(C5)標準品1.640mg、異綠原酸C(C7)標準品0.970mg、苦丁冬青甙A(K3)標準品2.130mg、大葉冬青苷G(K1)標準品2.090mg、苦丁冬青甙G(K2)標準品1.830mg、苦丁茶冬青苷T(K4)標準品1.300mg和大葉冬青苷H(K5)標準品1.210mg，分別置于容量瓶中，先加甲醇溶解再定容，搖勻，即得對照品溶液儲備液；吸取各對照品儲備液，制成含蘆丁31.6μg·ml-1、6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃62.0μg·ml-1、羥基酪醇葡萄糖苷380.0μg·ml-1、原兒茶酸10.13μg·ml-1、苦丁冬青甙E 60.0μg·ml-1、苦丁冬青甙D 50.0μg·ml-1，異綠原酸A1365.0μg·ml-1、新綠原酸101.7μg·ml-1、綠原酸755.0μg·ml-1、隱綠原酸101.0μg·ml-1、咖啡酸106.0μg·ml-1、異綠原酸B106.6μg·ml-1、異綠原酸C485.0μg·ml-1、苦丁冬青甙A 1065.0μg·ml-1、大葉冬青苷G 1045.0μg·ml-1、苦丁冬青甙G 915.0μg·ml、苦丁茶冬青苷T 39.0μg·ml-1和大葉冬青苷H 199.7μg·ml-1的混合對照品溶液。

2.2高效液相色譜分析：

精密吸取供試品溶液和對照品溶液20μl，進樣；色譜條件：色譜柱為Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱4.6mm×250mm,5μm；流動相為0.05％磷酸-H₂O(A)，乙腈(B)，甲醇(C)，梯度洗脫方式為：時間0.1min，A相94％，B相6％；時間5min，A相94％，B相6％；時間15min，A相88％，B相12％；時間25min，A相84％，B相16％；時間26min，A相77％，B相20％，C相3％；時間45min，A相77％，B相20％，C相3％；時間50min，A相74％，B相26％；時間70min，A相74％，B相26％；時間85min，A相71％，B相29％；時間110min，A相54％，B相46％；時間110.01min，A相10％，B相90％；時間120min，A相10％，B相90％；檢測波長：210nm、260nm、326nm；流速：1.0ml·min-1；分別得到混合對照品的高效液相色譜圖和供試品的高效液相色譜圖，如附圖2～4所示。

2.3共有峰的確定：

將上述15批供試品的高效液相色譜圖經(jīng)不同波長下進行比較，呈現(xiàn)21個共有峰，取具有特征性信息的18個成分峰進行分析，在圖2～4中標出。

2.4方法學考察

2.4.1線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品溶液，逐級稀釋，得系列標準品溶液。取系列標準品溶液各進樣20μl，記錄并分析峰面積，以對照品質(zhì)量濃度(μg·ml-1)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，以最小二乘法求得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察

2.4.2精密度、重復性、穩(wěn)定性考察

精密吸取“2.4.1”項下混合對照品溶液20μl，重復進樣測定6次，記錄峰面積計算精密度；取同一份供試品溶液分別在1、2、4、6、8、12小時內(nèi)進樣記錄分析峰面積；取同一批苦丁茶，制成供試品溶液，平行制備6份，進樣計算含量，結(jié)果見表2。

2.4.3加樣回收率試驗

取6份苦丁茶細粉0.1g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，自加入20.0ml甲醇按“供試品溶液制備”項下操作，即得，進樣分析后計算待測成分的加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2.精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察結(jié)果

2.5相對校正因子

2.5.1相對校正因子的測定

在線性范圍內(nèi)，苦丁茶中成分的量與檢測器的響應成正比，蘆丁、異綠原酸A和苦丁冬青甙A為內(nèi)參物，計算蘆丁(R4)對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃(R1)、羥基酪醇葡萄糖苷(R2)、原兒茶酸(R3)、苦丁冬青甙E(R5)、苦丁冬青甙D(R6)，異綠原酸A(C6)對新綠原酸(C1)、綠原酸(C2)、隱綠原酸(C3)、咖啡酸(C4)、異綠原酸B(C5)、異綠原酸C(C7)，以及苦丁冬青甙A(K3)對大葉冬青苷G(K1)、苦丁冬青甙G(K2)、苦丁茶冬青苷T(K4)和大葉冬青苷H(K5)的相對校正因子，根據(jù)校正因子(RCF，f)的計算公式：

${\mathrm{RCF}}_x=\frac{f_x}{f_i}=\frac{A_x/C_x}{A_i/C_i}---\left(1\right)$

$C_x=\frac{C_i}{{\mathrm{RCF}}_x}\×\frac{A_x}{A_i}---\left(2\right)$

$C_x\×{\mathrm{RCF}}_x=\frac{A_x}{(A_i/C_i)}---\left(3\right)$

其中A_x為內(nèi)參物對照品峰面積，C_x為內(nèi)參物對照品濃度，Ai為待測成分對照品峰面積；Ci為待測成分對照品濃度。

試驗得到蘆丁對6-羥基-7,7a-二氫-2(6H)-苯并呋喃、羥基酪醇葡萄糖苷、原兒茶酸、苦丁冬青甙E、苦丁冬青甙D，異綠原酸A對新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸C以及苦丁冬青甙A對大葉冬青苷G、苦丁冬青甙G、苦丁茶冬青苷T和大葉冬青苷H的相對校正因子，分別為3.194、1.680、1.570、1.039、1.066；0.775、0.836、0.709、1.753、1.731、1.280以及0.423、0.137、0.635、0.349。

2.5.2耐用性和系統(tǒng)適用性評價

(1)溫度對RCFx的影響

采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，分別考察了不同柱溫(25℃，28℃，30℃)對供試品溶液待測成分相對校正因子的影響，結(jié)果待測成分相對校正因子RSD<5.31％，表明柱溫對各成分RCFx無顯著影響，結(jié)果見表3。

表3 不同柱溫對校正因子的影響

(2)流速對RCFx的影響

采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，分別考察了流動相不同流速(0.8ml/min，0.9ml/min，1.0ml/min)對供試品溶液中待測成分相對校正因子的影響，結(jié)果待測成分的相對校正因子RSD<6.24％，表明流速對各成分f無顯著影響，結(jié)果見表4。

表4 不同流速對校正因子的影響

(3)不同儀器對RCFx的影響

采用WatersE2695、Agilent 1260、Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，考察不同儀器對待測成分相對校正因子的影響，結(jié)果整體相對校正因子RSD<5.17％，不同儀器對相對校正因子無顯著影響，結(jié)果見表5。

表5 不同儀器對校正因子的影響

(4)不同色譜柱對對RCFx的影響

采用Waters高效液相色譜系統(tǒng)和Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，Waters Symmetry C18色譜柱and ACCHROM C18色譜柱來考察色譜柱對供試品溶液中待測成分校正因子的影響，結(jié)果整體待測成分相對校正因子的RSD<4.86％,表明色譜柱對相對校正因子無顯著影響，結(jié)果見表6。

表6 色譜柱對相對校正因子的影響

2.6待測組分色譜峰定位

試驗中應用Waters Alliance高效液相色譜儀，Agilent 1260高效液相色譜儀，Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀，Phenomenex Synergi Hydro-RP C18色譜柱，Waters Symmetry C18色譜柱and ACCHROM C18色譜柱來考察了保留時間差和相對保留值的重現(xiàn)性，結(jié)果表明采用相對保留值波動較小，因此采用相對保留值法對供試品溶液中待測成分進行色譜峰定位。相對保留值指各待測成分與內(nèi)參物s之間保留時間的比值，計算公式：ras＝tRa/tRs。(tRa待測成分保留時間，tRs內(nèi)參物保留時間)

結(jié)果待測成分的相對保留值RSD<5％，表明次色譜條件下利用相對保留值對色譜峰定位可行，結(jié)果見表7、表8。

表7 QAMS法待測成分色譜峰定位-色譜柱

表8 QAMS法待測成分色譜峰定位-儀器

2.7一測多評法與外表法結(jié)果比較

采用外標法(ES)和一測多評法(QAMS)計算待測物成分的含量，結(jié)果見表9和表10，顯示采用兩種方法所得含量無顯著差異。注：SMD＝(CQAMS-CES)/CQAMS

表9 一測多評法與外標法結(jié)果比較

表10

2.8主成分分析、聚類分析與相似度評價

將15個不同來源計算得到的18個化合物含量信息導入SPSS19.0中，進行聚類分析和主成份分析。結(jié)果見圖5，表11。

結(jié)果顯示：1號藥材表現(xiàn)出明顯的差異性，被單獨聚為一類，與各類組分含量總和計算結(jié)果相一致；其余14批藥材相似度較高，被聚為一類。

采用歐式距離法，可以看到不同產(chǎn)地的苦丁茶相似度≥0.90，1號藥材的相似度為0.90，其余產(chǎn)地相似度在0.95以上，1號藥材在總體相對一致的趨勢下表現(xiàn)出比較明顯的差異性。

表11 15批苦丁茶樣品的相似度分析結(jié)果

3.小結(jié)

3.1一測多評法待測峰的定位

一測多評是利用一定線性范圍內(nèi)成分的量與檢測器響應成正比的原理，通過測定一個成分實現(xiàn)多個成分的同步測定，能夠緩解中藥多成分定量中存在的對照品缺乏問題，同時還可以實現(xiàn)多指標同步質(zhì)量控制。待測成分色譜峰的定位是應用一測多評法的前提，本實驗表明采用相對保留值法進行色譜峰的定位較為可行。

3.2相對校正因子重現(xiàn)性

本實驗考察了不同柱溫、不同流速，不同色譜柱和不同儀器對f的影響，結(jié)果表明，相對校正因子有較好的重現(xiàn)性。一測多評法與外標法測得的含量基本一致表明QAMS法較為準確可行，可以對苦丁茶中多成分進行定量測定。

3.3相似度分析

試驗中聚類分析、主成分分析和相似度分析結(jié)果一致，表明相似度分析方法穩(wěn)定，可行。采用一測多評法測得的成分含量的同時，也可對藥材的相似性進行分析，方法方便、快捷，可以用于苦丁茶質(zhì)量的綜合控制手段。