本發(fā)明屬于儀器分析領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱及其在單克隆抗體電荷異構(gòu)體分離中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

單克隆抗體是一種在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊的蛋白類藥物，由于其良好的藥效、高選擇性、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于癌癥的治療。目前，大多數(shù)臨床應(yīng)用的單克隆抗體為免疫球蛋白類型，這些單克隆抗體(～150kDa)是四聚型的糖蛋白，由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈構(gòu)成，中間由若干個(gè)二硫鍵相連。

在生產(chǎn)、提取、形成和儲(chǔ)存過(guò)程中，單克隆抗體會(huì)經(jīng)過(guò)一系列轉(zhuǎn)譯后修飾過(guò)程，包括糖基化、聚合、破碎、脫酰氨基化等作用。盡管這些變化很小，但是會(huì)使單克隆抗體表現(xiàn)出多種類型的不均一性，進(jìn)而產(chǎn)生不同類型的變體，它們?cè)诜肿恿?、疏水性、電荷等理化性質(zhì)上存在差異。

在單克隆抗體不均一性分析中，對(duì)其電荷異構(gòu)體的分析研究最為廣泛。電荷異構(gòu)體通常依據(jù)其相對(duì)于主峰的等電點(diǎn)，分為酸性或堿性異構(gòu)體。一般地，酸性異構(gòu)體具有相對(duì)主峰較低的等電點(diǎn)，而堿性異構(gòu)體則具有相對(duì)主峰較高的等電點(diǎn)。

單克隆抗體的復(fù)雜性使得對(duì)其不均一性進(jìn)行表征變得比較困難。目前已發(fā)展了一些方法對(duì)單克隆抗體的不均一性進(jìn)行分析，如離子交換色譜、反相液相色譜、疏水色譜、體積排阻色譜、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管等電聚焦、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、質(zhì)譜等。在這些技術(shù)中，離子交換色譜被廣泛地應(yīng)用于單克隆抗體電荷異構(gòu)體的表征。在離子交換色譜中，電荷異構(gòu)體通常以小峰形式呈現(xiàn)，而這些電荷異構(gòu)體對(duì)于單克隆抗體的質(zhì)量和穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，開(kāi)發(fā)單克隆抗體電荷異構(gòu)體分析方法的關(guān)鍵就是將這些小的變體形式從主峰中區(qū)分開(kāi)來(lái)。

毛細(xì)管電色譜是一種高效的復(fù)合分離技術(shù)，其分離機(jī)理主要依據(jù)電泳遷移和色譜保留，因此它既具有高效液相色譜的高選擇性又具有毛細(xì)管電泳的高效性，在復(fù)雜生物樣品的分離領(lǐng)域極具潛力。色譜柱是毛細(xì)管電色譜的分離核心，在不同類型的電色譜柱中，開(kāi)管柱因其制備簡(jiǎn)單、操作方便、沒(méi)有氣泡產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，受到人們?cè)絹?lái)越多的青睞。

目前開(kāi)管柱的制備方法主要包括化學(xué)鍵合法、溶膠凝膠法、分子印跡法、多孔層法、物理吸附法和納米涂層法。在這些方法中，層層自組裝的方法由于其簡(jiǎn)便、穩(wěn)定和低成本的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被成功地應(yīng)用于納米級(jí)別的特殊功能化膜的制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，更好地分離單克隆抗體中以小峰形式出現(xiàn)的電荷異構(gòu)體，本發(fā)明的首要目的在于提供一種蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱的制備方法，該方法通過(guò)靜電自組裝的方式將不同類型的蛋白涂覆到預(yù)先用聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)修飾的開(kāi)管柱上得到不同蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱，該制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和，重現(xiàn)性好。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的開(kāi)管柱，該開(kāi)管柱表面含有豐富的作用位點(diǎn)，可以有效地抑制生物樣品的吸附，改善分離效果，提高分離選擇性。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述的蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱在單克隆抗體電荷異構(gòu)體分離中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱的制備方法，是將PDDA通過(guò)靜電自組裝方法固定在毛細(xì)管內(nèi)壁，再將蛋白通過(guò)靜電自組裝吸附在PDDA表面，得到蛋白固定相修飾開(kāi)管柱；

具體地，上述方法包括以下步驟：

(1)將PDDA和電解質(zhì)溶于Tris-HCl緩沖液中得到PDDA溶液，沖刷毛細(xì)管柱0.5～3h，再用水沖洗0.5～2h去除多余的PDDA，得到PDDA開(kāi)管柱；

(2)將蛋白溶解在Tris-HCl緩沖液中配成蛋白水溶液，注入步驟(1)制備好的PDDA開(kāi)管柱中，加熱保存10～14h，得到蛋白固定相修飾開(kāi)管柱；

在本發(fā)明中，固定相蛋白可以是酸性蛋白或堿性蛋白；當(dāng)固定相蛋白是酸性蛋白時(shí)，制得的開(kāi)管柱可用于堿性蛋白的分離；當(dāng)固定相蛋白是堿性蛋白時(shí)，制得的開(kāi)管柱可用于酸性蛋白的分離；

所述的酸性蛋白優(yōu)選牛血清白蛋白、牛血紅蛋白；

所述的堿性蛋白優(yōu)選溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A；

步驟(1)中所述的PDDA溶液中的鹽離子可通過(guò)對(duì)PDDA聚電解質(zhì)分子鏈上離子化基團(tuán)的屏蔽作用，使PDDA分子以蜷縮狀態(tài)組裝成膜，通過(guò)調(diào)節(jié)鹽離子濃度可調(diào)節(jié)膜的厚度；

步驟(1)PDDA溶液中的鹽離子濃度為0.1～2.0M；

步驟(1)中所述的Tris-HCl緩沖液優(yōu)選pH值為8.3；

步驟(1)中所述的PDDA溶液，PDDA的濃度優(yōu)選5～20mg/mL；

步驟(1)中所述的電解質(zhì)優(yōu)選氯化鈉和/或氯化鉀；

步驟(2)中所述的蛋白水溶液，蛋白濃度優(yōu)選4～10mg/mL；

步驟(2)中所述的Tris-HCl緩沖液優(yōu)選pH值為7.4；

步驟(2)中所述的加熱保存是加熱至30～50℃。

由上述方法制得的蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱可應(yīng)用于單克隆抗體電荷異構(gòu)體、酸性蛋白或堿性蛋白的分離中，該開(kāi)管柱表面含有豐富的作用位點(diǎn)，可以有效地抑制蛋白的吸附，改善分離效果，提高了分離選擇性。

本發(fā)明的蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱，依據(jù)于簡(jiǎn)便實(shí)用的靜電自組裝方法完成開(kāi)管柱的構(gòu)筑。首先通過(guò)靜電自組裝方法制備得到PDDA修飾的開(kāi)管柱，然后將蛋白固定到PDDA修飾的開(kāi)管柱上，得到蛋白固定相修飾的開(kāi)管柱。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明的開(kāi)管柱以蛋白作為色譜固定相，其表面豐富的作用位點(diǎn)，有效抑制蛋白的吸附，改善分離效果，提高了分離選擇性。

(2)本發(fā)明的開(kāi)管柱制備條件溫和、操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

(3)本發(fā)明的開(kāi)管柱對(duì)單克隆抗體的電荷異構(gòu)體表現(xiàn)了特殊的選擇性。西妥昔單抗的七種不同形式的電荷異構(gòu)體獲得成功分離，利妥昔單抗的兩種堿性異構(gòu)體和一種酸性異構(gòu)體以及曲妥珠單抗的兩種堿性電荷異構(gòu)體和四種酸性異構(gòu)體被成功地從主峰中分離。

附圖說(shuō)明

圖1為堿性蛋白分離的毛細(xì)管電色譜譜圖：其中，1為溶菌酶，2為細(xì)胞色素C，3為核糖核酸酶A。

圖2為西妥昔電荷異構(gòu)體分離的毛細(xì)管電色譜譜圖：其中，1～7為西妥昔單抗的不同電荷異構(gòu)體。

圖3為利妥昔單抗電荷異構(gòu)體分離的毛細(xì)管電色譜譜圖：其中，b1、b2為利妥昔單抗堿性電荷異構(gòu)體，a1為利妥昔單抗酸性電荷異構(gòu)體。

圖4為曲妥珠單抗電荷異構(gòu)體分離的毛細(xì)管電色譜譜圖：其中，b1、b2為曲妥珠單抗堿性電荷異構(gòu)體，a1～a4為曲妥珠單抗酸性電荷異構(gòu)體。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

牛血清白蛋白(BSA)修飾的開(kāi)管柱，由以下步驟制得：

(1)PDDA開(kāi)管柱的制備：取PDDA和氯化鈉溶解到20mM Tris-HCl(pH值8.3)中得到PDDA濃度為20mg/mL的PDDA溶液，其中的鹽離子濃度是0.1M，然后以10μL/min的流速?zèng)_刷毛細(xì)管柱1h。最后用去離子水去掉多余的PDDA溶液。

(2)PDDA@BSA開(kāi)管柱的制備：PDDA開(kāi)管柱制備成功以后，取BSA加入20mM Tris-HCl(pH值7.4)中配成5mg/mL的均一溶液，然后將其以10μL/min的流速注入制備好的PDDA開(kāi)管柱中，在40℃的烘箱中靜置保存12h。最后，用去離子水去除多余的BSA，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下烘干，得到PDDA@BSA開(kāi)管柱。

實(shí)施例2

牛血清白蛋白(BSA)修飾的開(kāi)管柱，由以下步驟制得：

(1)PDDA開(kāi)管柱的制備：取PDDA和氯化鉀溶解到20mM Tris-HCl(pH值8.3)中得到PDDA濃度為10mg/mL的PDDA溶液，其中的鹽離子濃度是1.0M，然后以10μL/min的流速?zèng)_刷毛細(xì)管柱0.5h。最后用去離子水去掉多余的PDDA溶液。

(2)PDDA@BSA開(kāi)管柱的制備：PDDA開(kāi)管柱制備成功以后，取BSA加入20mM Tris-HCl(pH值7.4)中配成10mg/mL的均一溶液，然后將其以10μL/min的流速注入制備好的PDDA開(kāi)管柱中，在40℃的烘箱中靜置保存12h。最后，用去離子水去除多余的BSA，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下烘干，得到PDDA@BSA開(kāi)管柱。

實(shí)施例3

牛血紅蛋白(BHb)修飾的開(kāi)管柱，由以下步驟制得：

(1)PDDA開(kāi)管柱的制備：取PDDA和氯化鈉溶解到20mM Tris-HCl(pH值8.3)中得到PDDA濃度為20mg/mL的PDDA溶液，其中的鹽離子濃度是2.0M，然后以10μL/min的流速?zèng)_刷毛細(xì)管柱3h。最后用去離子水去掉多余的PDDA溶液。

(2)PDDA@BHb開(kāi)管柱的制備：PDDA開(kāi)管柱制備成功以后，取BHb加入20mM Tris-HCl(pH值7.4)中配成5mg/mL的均一溶液，然后將其以10μL/min的流速注入制備好的PDDA開(kāi)管柱中，在40℃的烘箱中靜置保存12h。最后，用去離子水去除多余的BHb，40℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下烘干，得到PDDA@BHb開(kāi)管柱。

實(shí)施例4

實(shí)施例1制得的PDDA@BSA開(kāi)管柱的應(yīng)用

將溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A混合溶于去離子水中，通過(guò)電色譜的方法進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖1。分離條件為：色譜柱內(nèi)徑為50μm，總長(zhǎng)為63.5cm，有效長(zhǎng)度為37cm，流動(dòng)相為40mM(pH值7.0)的磷酸緩沖液，分離電壓為20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方式為高度進(jìn)樣。

由圖1可見(jiàn)，三種堿性蛋白在PDDA@BSA開(kāi)管柱上獲得了很好的分離效果，峰型尖銳，說(shuō)明該開(kāi)管柱可有效用于堿性蛋白的分離，極大地抑制了蛋白的吸附，改善了分離效果。

實(shí)施例5

實(shí)施例1制得的PDDA@BSA開(kāi)管柱的應(yīng)用

將離心、稀釋后的西妥昔單抗溶于水中，通過(guò)電色譜的方法進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖2。分離條件為：色譜柱內(nèi)徑為50μm，總長(zhǎng)為63.5cm，有效長(zhǎng)度為37cm，流動(dòng)相為40mM(pH值6.0)的磷酸緩沖液，分離電壓為20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方式為高度進(jìn)樣。

由圖2可見(jiàn)，西妥昔單抗的七種不同形式的電荷異構(gòu)體在PDDA@BSA開(kāi)管柱上獲得了很好的分離效果，峰型尖銳。說(shuō)明該涂層柱能夠有效地應(yīng)用于西妥昔單抗電荷異構(gòu)體的的識(shí)別。

實(shí)施例6

實(shí)施例2制得的PDDA@BSA開(kāi)管柱的應(yīng)用

將離心、稀釋后的利妥昔單抗溶于水中，通過(guò)電色譜的方法進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖3。分離條件為：色譜柱內(nèi)徑為50μm，總長(zhǎng)為63.5cm，有效長(zhǎng)度為37cm，流動(dòng)相為40mM(pH值6.0)的磷酸緩沖液，分離電壓為20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方式為高度進(jìn)樣。

由圖3可見(jiàn)，利妥昔單抗的兩種堿性異構(gòu)體和一種酸性異構(gòu)體成功地從主峰中分離，說(shuō)明BSA涂層對(duì)利妥昔單抗的電荷異構(gòu)體具有很好的選擇性。

實(shí)施例7

實(shí)施例2制得的PDDA@BSA開(kāi)管柱的應(yīng)用

將離心、稀釋后的曲妥珠單抗溶于水中，通過(guò)電色譜的方法進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖4。分離條件為：色譜柱內(nèi)徑為50μm，總長(zhǎng)為63.5cm，有效長(zhǎng)度為37cm，流動(dòng)相為40mM(pH值5.5)的磷酸緩沖液，分離電壓為20kV，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，進(jìn)樣方式為高度進(jìn)樣。

由圖4可見(jiàn)，曲妥珠單抗的兩種堿性電荷異構(gòu)體和四種酸性電荷異構(gòu)體成功地從主峰中分離，說(shuō)明BSA涂層對(duì)曲妥珠單抗的電荷異構(gòu)體具有很好的選擇性。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。