本發(fā)明涉及一種UPLC-MS/MS(超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，屬于分析化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

雌三醇、氫化可的松、17β-雌二醇、睪酮和孕酮等血甾體激素是人類許多內(nèi)分泌疾病診治的臨床常用檢測指標(biāo)，目前其檢測方法有免疫分析法和色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。免疫分析法如免疫熒光分析法等目前臨床應(yīng)用廣泛，可同時測定人血多種甾體激素，但其極易受背景干擾出現(xiàn)交叉反應(yīng)，且常常僅檢測游離激素等，故有時不能真正反映體內(nèi)實際水平；色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不存在免疫分析法的交叉反應(yīng)，樣本經(jīng)水解后可檢測游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的總甾體激素水平；色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)歷氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜、UPLC-MS/MS等，其檢測效能不斷提高，應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展。

然而測定人血甾體激素有一定的局限性。由于人體內(nèi)甾體激素分泌波動較大，故其單次血樣僅代表血液瞬間甾體激素水平，且血樣采集的有創(chuàng)性一定程度上影響了患者的依從性，也難以進(jìn)行有關(guān)流行病學(xué)的調(diào)研。尿甾體激素可反映機(jī)體一段時間內(nèi)其血中的平均水平，且尿樣采集的無創(chuàng)便捷等優(yōu)點明顯提高了臨床診療患者或流行病學(xué)人群調(diào)研的依從性。

UPLC-MS/MS的出現(xiàn)給快速同時檢測尿多種甾體激素帶來了新的機(jī)遇。目前有關(guān)UPLC-MS/MS同時檢測上述5種尿甾體激素的國內(nèi)外研究甚少，如國外Ming DS、Heathcote J.(2011)等建立了UPLC-MS/MS檢測尿游離和總的皮質(zhì)醇方法，該法為β-葡萄糖醛酸酶60℃水浴90min；國內(nèi)朱傳新、鄭艷容(2014)建立UPLC-MS/MS同時分析尿睪酮、雄烯二酮、孕酮和21α-羥化孕酮4種甾體激素()的方法，該法為β-葡萄糖醛酸酶37℃水浴7h以上；張彤杰、王建躍(2015)等建立了嬰兒尿液中睪酮和雄烯二酮的UPLC-MS/MS法，該法為葡萄糖醛酸酶37℃水浴過夜，2種雄激素的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，定量下限均為0.05μg/L，平均回收率范圍為74.7％～112.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6％～15.7％，提示該方法準(zhǔn)確可靠，適用于嬰兒尿液中睪酮和雄烯二酮的準(zhǔn)確測定。

綜上所述，國內(nèi)外未見應(yīng)用UPLC-MS/MS技術(shù)，同時快速(酶解時間小于7h)檢測5種尿甾體激素的研究方法報道。針對上述情況，本發(fā)明提出了一種酶解優(yōu)化法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)同時快速(酶解3h)檢測尿中常用5種甾體激素的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供了一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿雌三醇、氫化可的松、17β-雌二醇、睪酮和孕酮5種甾體激素的方法，使其應(yīng)用于人體尿液甾體激素，為了解機(jī)體的生理過程、疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及個性化治療方案提供有效信息和依據(jù)。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足尿5種甾體激素同時檢測的要求。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，采用β-葡萄糖醛酸酶酶解法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)快速同時檢測人尿5種甾體激素，步驟如下：

第一步，收集尿樣，離心除雜質(zhì)后保存；

第二步，取第一步得到的離心尿樣0.5mL，加入10μL睪酮-d3作為內(nèi)標(biāo)，1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液、1800～2200Uβ-葡萄糖醛酸酶水溶液，蓋上瓶蓋密封，于50～60℃水浴3h；

第三步，采用SPE小柱提取酶解后尿總甾體激素，用甲醇洗脫，氮氣吹干；

第四步，加溶解液渦旋溶解殘渣，經(jīng)0.22μm濾膜濾過后，等待UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析；

第五步，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析尿5種甾體激素。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，第一步中，所述尿樣以10,000rpm/min離心5min，離心尿樣的保存溫度為-20℃。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，第三步中，SPE小柱為SampliQ ODS-C18固相萃取柱，按其填料質(zhì)量和空柱管的體積，規(guī)格為500mg/6mL，洗脫步驟為：

1)SPE小柱先用10mL甲醇平衡；

2)然后用10mL去離子水水洗；

3)上樣：酶解后尿樣上樣至SPE小柱上；

4)淋洗：正壓條件下用2mL 20％的甲醇水溶液淋洗1次；

5)洗脫：正壓條件下用5mL 100％甲醇溶液分2次洗脫。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，第四步中，加入的溶解液為200μL 30％乙腈水溶液，渦旋時間為2分鐘；UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析體積約為100μL。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，第五步中，UPLC-MS/MS分析所用色譜條件：色譜柱為WatersACQUITYUPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm，美國Waters公司)，流動相為0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液和0.1％(v/v)甲酸水溶液，恒定流速：0.3mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：1μL。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，第五步中，UPLC-MS/MS分析所用質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源；毛細(xì)管電壓：3.5kV；射頻透鏡電壓：0.3V；離子源溫度：130℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：600L/h；錐孔氣流量：50L/h；脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣；碰撞氣為高純氬氣，流量：0.10mL/min。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，所述的人尿5種甾體激素為：雌三醇、氫化可的松、17β-雌二醇、睪酮和孕酮。

上述的一種UPLC-MS/MS技術(shù)快速檢測尿甾體激素的方法，以3倍基線噪聲所對應(yīng)的濃度為檢出限時，檢出限為0.1～1.0 ng/mL； 以10倍基線噪聲所對應(yīng)的濃度為定量限時，其定量限為0.3～3.0 ng/mL。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點或者有益效果：

1)本發(fā)明所采用的優(yōu)化酶解法酶解時間只需3h，較現(xiàn)有技術(shù)快速；并可滿足尿5種甾體激素同時檢測的要求，檢測范圍覆蓋面廣；

2)本發(fā)明所采用的方法檢出限為0.1～1.0ng/mL，定量限為0.3～3.0ng/mL，具有靈敏度高、特異性好等特點。

3)本發(fā)明所采用的方法5種甾體激素的平均回收率為84.7％～106.0％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5％～9.8％，具有精密度高，準(zhǔn)確性高等特點。

表1為尿甾體激素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限。

表2為尿甾體激素的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 尿甾體激素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

注：y：被測組分與內(nèi)標(biāo)定量色譜峰峰面積之比；x：被測甾體激素的濃度，ng/mL。

表2 尿甾體激素的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝5)

附圖說明

圖1是5種甾體激素標(biāo)準(zhǔn)混合液及內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖(EIC)，數(shù)字代表的激素名詞分別為：a.雌三醇，b.氫化可的松，c.17β-雌二醇，d.睪酮-d3，e.睪酮，f.孕酮。

圖2是混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100ng/mL)和尿樣被測物總離子流色譜圖。數(shù)字代表的激素名詞分別為：1.雌三醇，2.氫化可的松，3.17β-雌二醇，4.睪酮-d3，5.睪酮，6.孕酮。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明，但在本發(fā)明保護(hù)范圍不限于下述的實施例。

SPE小柱為SampliQ ODS-C18柱，填料顆粒直徑45μm，填料量500mg。

實施例1

取-20℃凍融的雌三醇、氫化可的松、17β-雌二醇、睪酮和孕酮5種甾體激素()的混合甲醇溶液，濃度均為100ng/mL。取500μL尿液加入10μL的睪酮-d3作為內(nèi)標(biāo)、1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液、1800～2200Uβ-葡萄糖醛酸酶水溶液，于50～60℃水浴3h后過SPE小柱。SPE小柱的具體流程為：1)SPE小柱先用10mL甲醇平衡；2)然后用10mL去離子水水洗；3)上樣：將酶解后尿樣上樣至SPE小柱上；4)淋洗：正壓條件下用2mL 20％的甲醇水溶液淋洗1次；5)洗脫：正壓條件下用5mL100％甲醇溶液分2次洗脫。氮氣吹干溫度為60℃，時間約為15min。殘渣用200μL體積濃度為30％乙腈-水溶液渦旋溶解，經(jīng)0.22μm濾膜濾過后，等待UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。結(jié)果如附圖2a所示。5種甾體激素可以得到很好的分離。

實施例2

取-20℃凍融的女性尿液500μL，加入10μL的睪酮-d3作為內(nèi)標(biāo)、1.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖液、1800～2200Uβ-葡萄糖醛酸酶水溶液，于50～60℃水浴3h后過SPE小柱。SPE小柱的具體流程為：1)SPE小柱先用10mL甲醇平衡；2)然后用10mL去離子水水洗；3)上樣：將酶解后尿樣上樣至SPE小柱上；4)淋洗：正壓條件下用2mL 20％的甲醇水溶液淋洗1次；5)洗脫：正壓條件下用5mL100％甲醇溶液分2次洗脫。氮氣吹干溫度為60℃，時間約為15min。殘渣用200μL體積濃度為30％乙腈-水溶液渦旋溶解，經(jīng)0.22μm濾膜濾過后，等待UPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。結(jié)果如附圖2b所示。5種甾體激素可以得到很好的分離。