本發(fā)明涉及質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種膽固醇含量的檢測方法。

背景技術(shù)：

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，尤以腦及神經(jīng)組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。其溶解性與脂肪類似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶劑。膽固醇是動(dòng)物組織細(xì)胞所不可缺少的重要物質(zhì)，它不僅參與形成細(xì)胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料。膽固醇經(jīng)代謝還能轉(zhuǎn)化為膽汁酸、類固醇激素、7-脫氫膽固醇，并且7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3。膽固醇主要來自人體自身的合成，食物中的膽固醇是次要補(bǔ)充。專家建議每天攝入50mg～300mg膽固醇為佳。過分忌食含膽固醇的食物，易造成貧血，降低人體的抵抗力；但長期大量攝入膽固醇，不利于身體健康，會(huì)使血清中的膽固醇含量升高，增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。所以，科學(xué)的飲食方法提倡適量攝入膽固醇。

動(dòng)物性食物(魚肉蛋奶等)普遍含有膽固醇，植物性食物則普遍不含膽固醇。日常食物如豬腦、動(dòng)物內(nèi)臟、蛋黃、魷魚、貝殼類及奶油、黃油、羊油、豬油、牛油等動(dòng)物油脂中含有較多膽固醇。動(dòng)物油脂中的飽和脂肪酸還可以促進(jìn)肝臟合成更多的膽固醇。雖然，飲食中膽固醇攝入并不是血液中膽固醇的主要來源，但控制飲食中膽固醇的攝入(避免攝入過多膽固醇)仍然是防治血脂異常、高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要措施。因此，檢測食品尤其是動(dòng)物油脂等高膽固醇含量食品中膽固醇的含量是必不可少的。

目前，膽固醇的定量分析方法主要包括比色法、酶法、氣相色譜法和高效液相色譜法。傳統(tǒng)的比色法由于操作手續(xù)繁雜，特別是樣品的前處理和樣品中脂肪的提取，而且所需試劑多，造成了比色結(jié)果的偏差和計(jì)算結(jié)果的復(fù)雜化，且成本高，從而限定了該方法的廣泛使用。酶法由于技術(shù)含量較高，特異性強(qiáng)。而其它兩種方法有需要特殊的設(shè)備，檢測時(shí)間較長，同時(shí)由于樣品中雜質(zhì)較多，導(dǎo)致分離效果差，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確率難以保證。因此，急需提供一種可快速、準(zhǔn)確檢測食品中膽固醇含量的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種膽固醇含量的檢測方法。該檢測方法可大幅度縮短檢測時(shí)間，提高檢測的準(zhǔn)確率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種膽固醇含量的檢測方法，包括如下步驟：

將待測樣品溶于有機(jī)溶劑，得到供試液，采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測供試液中膽固醇的含量；

有機(jī)溶劑為異辛烷、乙醚或正己烷中的一種或兩種以上的混合物。

作為優(yōu)選，以g/mL計(jì)，待測樣品與有機(jī)溶劑的用量比為(0.2～0.4)：10。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的進(jìn)樣口溫度為240～260℃，分流比為20:1。

優(yōu)選地，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的進(jìn)樣口溫度為250℃。

作為優(yōu)選，進(jìn)樣量為1～10μL。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，進(jìn)樣量為1μL。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的色譜柱為HP-5ms色譜柱。

作為優(yōu)選，色譜柱的規(guī)格為30m*0.25mm*0.25μm。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的流速為1.5～2.0mL/min。

優(yōu)選地，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的流速為1.5mL/min。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的柱溫為260～280℃，保持10～15min。

優(yōu)選地，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的柱溫為275℃，保持13min。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以氦氣為載氣。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，氦氣的純度為99.999％。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的接口溫度為280～300℃。

優(yōu)選地，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的接口溫度為280℃。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)所采用的離子源為EI離子源，離子源的電離電壓為70eV。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的質(zhì)譜特征離子的質(zhì)荷比為386、275、105。

作為優(yōu)選，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的電子倍增器電壓為在自動(dòng)諧調(diào)電壓值基礎(chǔ)上增加150～200V。

優(yōu)選地，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的電子倍增器電壓為在自動(dòng)諧調(diào)電壓值基礎(chǔ)上增加200V。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的檢測器為MSD檢測器。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，膽固醇的含量采用外標(biāo)法測定。

作為優(yōu)選，在將待測樣品溶于有機(jī)溶劑與得到供試液之間還包括過濾的步驟。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，采用0.45μm水相濾膜過濾。

本發(fā)明提供了一種膽固醇含量的檢測方法。該檢測方法包括：將待測樣品溶于有機(jī)溶劑，得到供試液，采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測供試液中膽固醇的含量；有機(jī)溶劑為異辛烷、乙醚或正己烷中的一種或兩種以上的混合物。本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明檢測方法采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測樣品中膽固醇的含量，與現(xiàn)有的液相色譜技術(shù)方法相比，本發(fā)明檢測方法樣品處理流程簡化很多，無需皂化，只需要20min/批，而現(xiàn)有的液相色譜技術(shù)樣品處理時(shí)間為300min/批，本發(fā)明檢測方法可大幅度縮短檢測時(shí)間。

2、本發(fā)明檢測方法采用選擇離子掃描，專屬性強(qiáng)，目標(biāo)峰單一，排除雜質(zhì)干擾，同時(shí)能夠解決在皂化、衍生過程中造成提取不完全的問題，從而可提高檢測的準(zhǔn)確率；而現(xiàn)有方法由于樣品雜質(zhì)多，導(dǎo)致分離效果差，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率難以保證。

3、通過對本發(fā)明膽固醇含量的檢測方法進(jìn)行線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、空白、檢出限、定量限、回收率試驗(yàn)，均符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求，證明本發(fā)明方法科學(xué)有效，能對動(dòng)植物等樣品中的膽固醇含量起到質(zhì)量控制的目的。

附圖說明

圖1～5分別為標(biāo)準(zhǔn)序號為STD1～STD5對照品的色譜圖，示本發(fā)明檢測方法的線性關(guān)系；

圖6示根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)序號為STD1～STD5對照品中膽固醇的濃度繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

圖7～12為對照品溶液重復(fù)測定6次得到的色譜圖，示本發(fā)明檢測方法的精密度；

圖13～18為試樣重復(fù)測定6次得到的色譜圖，示本發(fā)明檢測方法的重復(fù)性；

圖19～24為對照品溶液在室溫下放置0h、2h、4h、6h、12h、24h后得到的色譜圖，示本發(fā)明檢測方法的穩(wěn)定性；

圖25示空白溶液的色譜圖；

圖26示本發(fā)明檢測方法的檢出限，其中，26-1和26-3為基線噪音圖；26-3顯示噪聲區(qū)域?yàn)?.62到10.49分鐘，最大噪聲41.0，最小噪聲40.0；26-2示目標(biāo)峰，信號區(qū)域?yàn)?.45到8.62分鐘，峰高43；

圖27示本發(fā)明檢測方法的定量限，其中，27-1和27-3為基線噪音圖；27-3顯示噪聲區(qū)域?yàn)?.62到10.49分鐘，最大噪聲41.0，最小噪聲40.0；27-2示目標(biāo)峰，信號區(qū)域?yàn)?.45到8.62分鐘，峰高63；

圖28～36為序號為1～9樣品(1-3為低濃度，4-6為中濃度，7-9為高濃度)的色譜圖，示本發(fā)明檢測方法的回收率；

圖37示采用本發(fā)明檢測方法檢測膽固醇濃度的圖譜；

圖38示對比例1檢測方法的圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種膽固醇含量的檢測方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明原理：試樣中的膽固醇用有機(jī)溶劑提取后，用氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測，并用外標(biāo)法定量。

本發(fā)明提供的膽固醇含量的檢測方法中所用標(biāo)準(zhǔn)品、試劑、儀器等均可由市場購得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1膽固醇含量的檢測

(一)檢測方法

儀器：安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀。

試劑試藥：

異辛烷(AR)；

膽固醇對照品來源：DR批號:00219純度:95.0％。

分析步驟：

(1)儀器參數(shù)

進(jìn)樣口：250℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比：20：1。

色譜柱：流速1.5mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱溫275℃，保持13min。

載氣：氦氣(99.999％)。

接口溫度：280℃。

電離模式：EI電離電壓：70eV。

選擇離子：386(定量)，275，105。

電子倍增器電壓：自動(dòng)調(diào)諧值增加200V。

檢測器：MSD。

(2)對照儲(chǔ)備液的配制：

精密稱取膽固醇對照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入異辛烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：

分別精密移取膽固醇儲(chǔ)備液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得工作標(biāo)準(zhǔn)液。

(4)試樣制備：

精密稱取樣品0.3g，置于10mL容量瓶中，加異辛烷溶解并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，即得供試液。

(5)結(jié)果計(jì)算：

X＝C×V/M×K

式中：X—樣品膽固醇的含量，mg/g；

M—樣品的質(zhì)量，g；

K—單位轉(zhuǎn)換系數(shù)(K＝1)；

V—樣品的稀釋倍數(shù)，mL；

C—樣品溶液中膽固醇的濃度，mg/mL。

(二)方法學(xué)驗(yàn)證

(1)線性范圍確認(rèn)

①試驗(yàn)數(shù)據(jù)(色譜圖見附圖1～5)：

表1膽固醇的線性關(guān)系試驗(yàn)數(shù)據(jù)

②標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖：

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖6所示。

③線性試驗(yàn)結(jié)論：

線性評價(jià)：膽固醇的相關(guān)系R²為0.999，所以用該方法測定膽固醇在濃度0.06061mg/mL至0.6061mg/mL之間呈現(xiàn)良好的線性，符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求相關(guān)系數(shù)R≥0.99】。

(2)精密度試驗(yàn)

①試驗(yàn)方法：

將膽固醇的對照品溶液按第4部分的色譜條件重復(fù)測定6次，計(jì)算其峰面積RSD(％)。

②試驗(yàn)數(shù)據(jù)(色譜圖見附圖7～12)：

表2膽固醇的精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

③試驗(yàn)結(jié)論：

膽固醇重復(fù)測定6次峰面積的RSD(％)為0.4％，表明該方法有較好的精密度。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

①試驗(yàn)方法：

稱取6份樣品，按第4部分的試樣制備方法處理樣品，檢測樣品含量，計(jì)算其RSD(％)。

②試驗(yàn)數(shù)據(jù)(色譜圖見附圖13～18)：

表3膽固醇的重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

③試驗(yàn)結(jié)論：

6份樣品膽固醇含量的RSD(％)為1.4％，表明該方法有較好的重復(fù)性，符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤5.3％】。

(4)穩(wěn)定性試驗(yàn)

①試驗(yàn)方法：

將膽固醇對照品溶液分別在室溫下放置0h、2h、4h、6h、12h、24h后，按第4部分的色譜條件測定峰面積，計(jì)算其RSD(％)。

②試驗(yàn)數(shù)據(jù)(色譜圖見附圖19～24)：

表4膽固醇的穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

③試驗(yàn)結(jié)論：

膽固醇對照品溶液分別在室溫下放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后，RSD(％)為0.6％，表明膽固醇對照品溶液在室溫下12小時(shí)內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

(5)空白試驗(yàn)

①試驗(yàn)方法：

不稱取樣品，按第4部分的試樣制備方法處理空白溶液，按其色譜條件測定空白溶液，與膽固醇對照品溶液的出峰時(shí)間對比。

②試驗(yàn)結(jié)果見圖25。

③試驗(yàn)結(jié)論：

空白溶液在膽固醇的出峰時(shí)間處均無吸收峰，表明空白對測定結(jié)果基本無干擾。

(6)檢出限與定量限試驗(yàn)

分析方法的定量限和檢出限由信噪比(S/N)計(jì)算。

當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí)，膽固醇檢出限為0.12μg/mL，得到方法的膽固醇檢出限為0.004mg/g(圖26)。

當(dāng)信噪比(S/N)為10時(shí)，膽固醇定量限為0.43μg/mL，得到方法的膽固醇定量限為0.014mg/g(圖27)。

(7)回收率試驗(yàn)

①試驗(yàn)方法：

加標(biāo)：精密稱取約0.3g樣品9份(已知膽固醇含量：5.70mg/g)，置于10mL容量瓶中，分成3組，每組3份，各組分別精密加入膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)液(濃度為0.39805mg/mL)4.0mL、5.0mL、6.0mμL。按第4部分的試樣制備方法處理樣品。

②試驗(yàn)數(shù)據(jù)如下(色譜圖見附圖28～36)：

表5膽固醇的回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

測得加入量＝加標(biāo)樣品測得量-樣品測得量

回收率(％)＝測得加入量/理論加入量

③試驗(yàn)結(jié)論：

膽固醇平均回收率為：99.2％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7％，符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率為90—110％】。

結(jié)論：

通過對膽固醇的含量測定方法進(jìn)行線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、空白、檢出限、定量限、回收率試驗(yàn)，均符合GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求，證明含量測定方法科學(xué)有效，能對動(dòng)植物中的膽固醇含量起到質(zhì)量控制的目的。

實(shí)施例2膽固醇含量的檢測

分析步驟：

(1)儀器參數(shù)

進(jìn)樣口：240℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比：20：1。

色譜柱：流速1.8mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱溫260℃，保持13min。

載氣：氦氣(99.999％)。

接口溫度：290℃。

電離模式：EI電離電壓：70eV。

選擇離子：386(定量)，275，105。

電子倍增器電壓：自動(dòng)調(diào)諧值增加150V。

檢測器：MSD。

(2)對照儲(chǔ)備液的配制：

精密稱取膽固醇對照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入乙醚溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：

分別精密移取膽固醇儲(chǔ)備液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得工作標(biāo)準(zhǔn)液。

(4)試樣制備：

精密稱取樣品0.3g(5.21mg/g)，置于10mL容量瓶中，加乙醚溶解并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，即得供試液(膽固醇濃度為0.1563mg/mL)。

(5)結(jié)果計(jì)算與實(shí)施例1相同。

X＝C×V/M×K

式中：X—樣品膽固醇的含量，mg/g；

M—樣品的質(zhì)量，g；

K—單位轉(zhuǎn)換系數(shù)(K＝1)；

V—樣品的稀釋倍數(shù)，mL；

C—樣品溶液中膽固醇的濃度，mg/mL。

表6膽固醇含量檢測結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果：采用本實(shí)施例檢測方法測定的膽固醇濃度與預(yù)期相近，表明本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測樣品中膽固醇的含量。

實(shí)施例3膽固醇含量的檢測

分析步驟：

(1)儀器參數(shù)

進(jìn)樣口：260℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比：20：1。

色譜柱：流速2.0mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm。

柱箱：柱溫280℃，保持13min。

載氣：氦氣(99.999％)。

接口溫度：300℃。

電離模式：EI電離電壓：70eV。

選擇離子：386(定量)，275，105。

電子倍增器電壓：自動(dòng)調(diào)諧值增加180V。

檢測器：MSD。

(2)對照儲(chǔ)備液的配制：

精密稱取膽固醇對照品20mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入正己烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：

分別精密移取膽固醇儲(chǔ)備液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得工作標(biāo)準(zhǔn)液。

(4)試樣制備：

精密稱取樣品0.3g(5.21mg/g)，置于10mL容量瓶中，加正己烷溶解并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，即得供試液(膽固醇濃度為0.1563mg/mL)。

(5)結(jié)果計(jì)算與實(shí)施例1相同。

X＝C×V/M×K

式中：X—樣品膽固醇的含量，mg/g；

M—樣品的質(zhì)量，g；

K—單位轉(zhuǎn)換系數(shù)(K＝1)；

V—樣品的稀釋倍數(shù)，mL；

C—樣品溶液中膽固醇的濃度，mg/mL。

表7膽固醇含量檢測結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果：采用本實(shí)施例檢測方法測定的膽固醇濃度與預(yù)期相近，表明本發(fā)明檢測方法能夠準(zhǔn)確檢測樣品中膽固醇的含量。

實(shí)施例4檢測實(shí)例

分析步驟：

1儀器參數(shù)

進(jìn)樣口：250℃；進(jìn)樣量：1μL；分流比：20：1；

色譜柱：流速1.5mL/min；HP-5ms 30m*0.25mm*0.25μm；

柱箱：柱溫275℃，保持13min；

載氣：氦氣(99.999％)；

接口溫度：280℃；

電離模式：EI電離電壓：70eV；

選擇離子：386(定量)，275，105；

電子倍增器電壓：自動(dòng)調(diào)諧值增加200V。

2對照儲(chǔ)備液的配制：

精密稱取膽固醇對照品20-30mg，置于10mL棕色容量瓶中，加入異辛烷溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制：

分別精密移取膽固醇儲(chǔ)備液200μL、500μL、1000μL、1500μL、2000μL于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得工作標(biāo)準(zhǔn)液。

4試樣制備：

精密稱取樣品0.2-0.4g，置于10mL容量瓶中，加異辛烷溶解并定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm的水相濾膜過濾，即得供試液。

5結(jié)果計(jì)算：

X＝C×V/M×K

式中：X—樣品膽固醇的含量，mg/g；

M—樣品的質(zhì)量，g；

K—單位轉(zhuǎn)換系數(shù)(K＝1)；

V—樣品的稀釋倍數(shù)，mL；

C—樣品溶液中膽固醇的濃度，mg/mL。

試驗(yàn)結(jié)果：

表8膽固醇含量檢測結(jié)果

對比例1液相色譜檢測方法

原理：試樣中的膽固醇經(jīng)有機(jī)溶劑提取，用液相色譜儀分析，采用外標(biāo)法定量。

分析方法：

1色譜參考條件

1.1色譜柱：以十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑(柱長25cm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑5μm)或同等性能的色譜柱；

1.2柱溫：35℃；

1.3檢測波長：205nm；

1.4流速：1.0mL/min；

1.5流動(dòng)相：甲醇。

2溶液制備

2.1對照品溶液的制備：精密稱取膽固醇對照品適量(精確至0.01mg)，置50mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.2mg膽固醇的對照品溶液，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，即得。

2.2供試品溶液制備：取試樣20粒(片)或10g(若試樣為膠囊，應(yīng)取內(nèi)容物)，混合均勻，稱取樣品0.25g～10g(膽固醇含量約為0.5mg～5mg，精確至0.1mg)于250mL平底燒瓶中，加入30mL無水乙醇，10mL60％氫氧化鉀溶液，混勻。將試液在100℃磁力攪拌水浴加熱皂化回流1h，不時(shí)振蕩防止試樣粘附在瓶壁上，皂化結(jié)束，用5mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取下平底燒瓶，冷卻至室溫。

2.3樣品提取處理：定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于250mL分液漏斗中，用30mL水分2次～3次沖洗燒瓶，洗液并入分液漏斗，再用40mL石油醚和乙醚混合液(1+1，體積比)分2次～3次沖洗平底燒瓶并入分液漏斗，振搖2min，靜置，分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個(gè)分液漏斗，再用30mL石油醚和乙醚混合液(1+1，體積比)重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并三次有機(jī)相，用蒸餾水每次100mL洗滌提取液至中性，初次水洗時(shí)輕輕旋搖，防止乳化，提取液通過約10g無水硫酸鈉脫水，轉(zhuǎn)移至150mL燒瓶中。

2.4樣品濃縮：將上述燒瓶中的提取液在真空條件下蒸發(fā)至近干，用無水乙醇溶解定容至25mL，溶液通過0.45μm過濾膜過濾，收集清夜于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)色譜測定。

3測定

分別精密吸取對照品溶液2μL、5μL、10μL、20μL、30μL與供試品溶液20μL，注入高效液相色譜儀，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時(shí)間相同的色譜峰定量。

4結(jié)果計(jì)算

X＝V×C/M

式中：

X—樣品中膽固醇含量，mg/g；

C—樣品溶液中膽固醇的濃度，mg/mL；

M—樣品的質(zhì)量，g；

V—樣品稀釋的體積，mL。

5試驗(yàn)結(jié)果

表9膽固醇含量檢測結(jié)果

結(jié)論：

通過對比例1舊方法與實(shí)施例4氣質(zhì)方法對比，結(jié)果顯示：氣質(zhì)方法樣品處理流程簡化很多，舊方法處理時(shí)間為300min/批，而氣質(zhì)方法只需要20min/批，大幅度縮短檢測時(shí)間。且舊方法由于樣品雜質(zhì)多，導(dǎo)致分離效果差，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率難以保證；而氣質(zhì)方法采用選擇離子掃描，專屬性強(qiáng)，目標(biāo)峰單一，更能提高檢測的準(zhǔn)確率。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。