本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。

背景技術(shù)：

據(jù)推斷，最開(kāi)始對(duì)于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應(yīng)答反應(yīng)可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關(guān)模式分子。這些損傷模式分子分別通過(guò)CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報(bào)。TAA本身通常被認(rèn)為是上述“危險(xiǎn)信號(hào)”的旁觀者，擔(dān)任抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)起始階段的佐劑。根據(jù)這個(gè)例子可以說(shuō)明，自發(fā)的免疫反應(yīng)是由于存在于癌細(xì)胞中11000個(gè)基因突變而產(chǎn)生的新肽所引起的。然而，迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)的TAA通常是非突變的自身蛋白。我們因此推斷，來(lái)自于一些已知的TAA的內(nèi)在因子也可能在體內(nèi)最初階段的抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著作用。

在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應(yīng)的內(nèi)在因子的過(guò)程中，我們將關(guān)注點(diǎn)放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強(qiáng)免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對(duì)于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)能夠在患有NY-ESO-1表達(dá)的腫瘤病人身上常常檢測(cè)的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。此外，自發(fā)性NY-ESO-1抗原在黑色素瘤中的減少，表明了抗NY-ESO-1的免疫反應(yīng)可能會(huì)影響腫瘤的自然史。與其他TAA相比，NY-ESO-1的免疫原性不是由于其更高的表達(dá)水平。事實(shí)上，至少在黑色素腫瘤中的NY-ESO-1的表達(dá)水平要顯著低于黑色素細(xì)胞分化抗原，如gp100，MART-1，TRP-1和TRP-2，，以及其他的腫瘤/睪丸抗原，如基于新鮮腫瘤樣本實(shí)時(shí)定量PCR分析的MAGE-1和MAGE-3。

我們最近研究了NY-ESO-1與在不成熟的樹(shù)突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞表面上補(bǔ)體Cq1受體（在文獻(xiàn)中被視為等同于鈣網(wǎng)織蛋白）間特殊的聯(lián)系，從而說(shuō)明了NY-ESO-1與先天性免疫系統(tǒng)之間的特異性相互作用。在這篇文章中，說(shuō)明了NY-ESO-1的免疫原性，與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4有關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

據(jù)推斷，最開(kāi)始對(duì)于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應(yīng)答反應(yīng)可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關(guān)模式分子。這些損傷模式分子分別通過(guò)CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報(bào)。TAA本身通常被認(rèn)為是上述“危險(xiǎn)信號(hào)”的旁觀者，擔(dān)任抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)起始階段的佐劑。在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應(yīng)的內(nèi)在因子的過(guò)程中，我們將關(guān)注點(diǎn)放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強(qiáng)免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對(duì)于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)能夠在患有NY-ESO-1表達(dá)的腫瘤病人身上常常檢測(cè)的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。但NY-ESO-1的免疫原性與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4之間的聯(lián)系尚未清楚。

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明第一方面提供NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，從細(xì)菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)（圖1A,B）。

本發(fā)明第二方面提供NY-ESO-1的聚合反應(yīng)由其分子間的二硫鍵介導(dǎo)。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。說(shuō)明NY-ESO-1的聚合反應(yīng)是由于其分子間的二硫鍵造成的。

本發(fā)明第三方面提供NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，NY-ESO-1野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。在癌細(xì)胞中存在的NY-ESO-1，同樣采用Western blot分析其在含有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中蛋白聚合情況，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1主要表現(xiàn)為三聚體及四聚體，很少發(fā)現(xiàn)存在二聚體及單體形式的現(xiàn)象（突變1C）。表明NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合是與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)的。

本發(fā)明第四方面提供TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合。

我們分別采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來(lái)的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)進(jìn)行NY-ESO-1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒(méi)有顯著的影響（圖2A）。作為NY-ESO-1與TLR4之間直接聯(lián)系的證據(jù)，顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來(lái)（圖2C）。與全細(xì)胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動(dòng)結(jié)合的。隨著聚合物的越來(lái)越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為NY-ESO-1能夠與人、鼠的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合是通過(guò)細(xì)胞表面的TLR4這一結(jié)論提供了依據(jù)。

本發(fā)明第五方面提供NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還可通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實(shí)驗(yàn)采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來(lái)的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)進(jìn)行NY-ESO-1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒(méi)有顯著的影響（圖2A）。因?yàn)镹Y-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還通過(guò)了鈣網(wǎng)蛋白的作用。

本發(fā)明第六方面提供聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，隨著聚合物的越來(lái)越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

本發(fā)明第七方面提供免疫球抗體反應(yīng)由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，ESOcs1的引起的抗體的效價(jià)有某些程度上的減弱，然而ESOcs2， ESOcs3所引起的抗體其效價(jià)幾乎檢測(cè)不到。在TLR4基因敲除的小鼠中（圖3B），由野生型質(zhì)粒所編碼誘導(dǎo)的NY-ESO-1抗體的效價(jià)也有明顯的減弱，而β-gal特異性抗體的效價(jià)始終與在野生型小鼠中保持一致。表明NY-ESO-1抗體反應(yīng)的TLR4依賴性。在抗體效價(jià)測(cè)定中顯示，在野生型小鼠中NY-ESO-1聚合體結(jié)果突變（半胱氨酸-絲氨酸替換）與抗體效價(jià)有某些聯(lián)系，但是在TLR4基因敲除的小鼠中，這種聯(lián)系沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái)，例如，ESOcs1 在野生型小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生相當(dāng)高的抗體反應(yīng)，而在TLR4基因敲除的小鼠中卻沒(méi)有此現(xiàn)象，從而假設(shè)ESOcs1與野生型 NY-ESO-1與的免疫原性相同。與此相反，ESOcs2所誘導(dǎo)的抗體在TLR4基因敲除的小鼠中表現(xiàn)了高的抗體效價(jià)，而在野生型小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到抗體，此現(xiàn)象與野生型的NY-ESO-1不同，但很像HMGB-1的免疫原性很像。ESOcs3在兩種小鼠中只展現(xiàn)出了很小的免疫原性。說(shuō)明免疫球抗體反應(yīng)的是由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4來(lái)參與的。

本發(fā)明第八方面提供Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達(dá)。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)Art與NY-ESO-1融合表達(dá)時(shí)，能夠顯著提高wtArt的免疫原性，并且使免疫反應(yīng)加快，注射完抗原后加快轉(zhuǎn)入到產(chǎn)生抗體的階段（圖4A）。另外，NY-ESO-1與人的CA9基因融合表達(dá)的質(zhì)粒，pcDNA-CA9-ESO，與單獨(dú)編碼CA9基因的質(zhì)粒pcDNA-CA9，通過(guò)肌肉注射使產(chǎn)生免疫反應(yīng)，比較兩者的免疫程度。結(jié)果顯示，通過(guò)注射融合質(zhì)粒Balb/c所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了高效價(jià)的NY-ESO-1抗體，而CA9抗體的效價(jià)相對(duì)較弱，反過(guò)來(lái)，在同樣的情況下只編碼CA9基因的質(zhì)粒并沒(méi)有產(chǎn)生任何抗體反應(yīng)。因?yàn)閜cDNA-CA9, pcDNA-ESO這兩種質(zhì)粒在之間相同的條件下，也并沒(méi)有引起任何的免疫反應(yīng)，從而說(shuō)明了這種CA9基因免疫原性的提高是依賴于于NY-ESO-1基因進(jìn)行了融合表達(dá)。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實(shí)了TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應(yīng)由其分子間的二硫鍵介導(dǎo)； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還可通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應(yīng)由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達(dá)。表明TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。

附圖說(shuō)明：

圖1：NY-ESO-1的DC-結(jié)合特性與它由二硫鍵支撐的聚合物結(jié)構(gòu)有關(guān)。

A：用質(zhì)粒編碼NY-ESO-1轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞（第1列），GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞（第2列和第4列），融合了N-末端FLAG標(biāo)簽的NY-ESO-1 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞(FLAG-ESO,第3列)。將細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，免疫印跡與mab131（第1列和第2列）和M2單克隆抗體（第3列和第4列）分別對(duì)NY-ESO-1和FLAG抗原決定基發(fā)生特異反應(yīng)。值得注意的是，NY-ESO-1單體（單箭頭注明）的分子量為18 kDa；而它的二聚體（雙箭頭注明）和四聚體分別在免疫印跡中出現(xiàn)36和72 kDa的條帶。

B：部分純化的野生型（第4列），esocs1 NY-ESO-1，esocs2，和esocs3蛋白（分別為1–3列），用免疫印跡（Western blot）分析。所有的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-tuPAGE），然后使131抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。值得注意的是，他的標(biāo)簽NY-ESO-1單體及其變體均出現(xiàn)20 kDa。

C：分別為NY-ESO-1在黑色素瘤株397，624，2984，HEK293，黑色素瘤株M202，f5.1，f5.4，和F5.6（從第1列到第8列）中的Western blot分析。單體和二聚體分別以單雙箭頭注明。經(jīng)過(guò)PCR后，HEK293，M202，和f5.1均檢測(cè)不到NY-ESO-1表達(dá)。GAPDH表示在每列蛋白總數(shù)數(shù)量相等的陽(yáng)性對(duì)照。

D：相比較于野生型NY-ESO-1聚合蛋白，由半胱氨酸到絲氨酸的突變引起的NY-ESO-1低聚物變體能夠降低小鼠和人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合。ESO(1–74)有可通過(guò)單克隆抗體mAb131識(shí)別的B細(xì)胞表位，用于檢測(cè)并作為陰性對(duì)照。用蛋白酶K處理的NY-ESO-1蛋白可作為另一個(gè)對(duì)照。等NY-ESO-1摩爾濃度的gp100蛋白也作為陰性對(duì)照（數(shù)據(jù)未顯示）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)使用從三個(gè)不同的捐助者獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞。未成熟的DC與NY-ESO-1在體外的明顯結(jié)合的范圍通常從8到80%不等，很大程度上是由于供體差異和實(shí)驗(yàn)之間的變化。因此，通常在樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合分析中沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)差。

E: NY-ESO-1結(jié)合人類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞的點(diǎn)陣圖顯示在（E）圖中，包括散點(diǎn)圖。MW，分子量。

圖2: 鼠及人的TLR4 參與到NY-ESO-1與未成熟樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合的過(guò)程中

A：從野生型，TLR2基因敲除和 TLR4基因敲除的骨髓中獲得的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞用來(lái)研究與NY-ESO-1的結(jié)合，按照之前所介紹的濃度。用FITC標(biāo)記的抗體mAb131，來(lái)能夠穩(wěn)定的檢測(cè)到細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果要是三個(gè)平行的帶有方差的平均值，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。當(dāng)p值<0.05時(shí)，視為差異顯著，當(dāng)p值<0.01時(shí)，視為差異極顯著。這個(gè)實(shí)驗(yàn)要從三只不同的老鼠身上至少重復(fù)出兩次以上的同樣的結(jié)果。然而，實(shí)驗(yàn)中存在一定的實(shí)驗(yàn)差異，盡管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的是樹(shù)突細(xì)胞與NY-ESO-1的相對(duì)比率。

B：抑制NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合是通過(guò)使用人的TLR4及CRT多克隆抗體來(lái)進(jìn)行的，但是并沒(méi)有控制對(duì)照β-actin進(jìn)行處理。樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是在3u g/ml的NY-ESO-1蛋白條件下進(jìn)行的，單獨(dú)的使用抗體或結(jié)合。實(shí)驗(yàn)至少得到一次同樣得重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

C：聚合物NY-ESO-1與鼠得TLR4和CRT形成復(fù)雜得大分子結(jié)構(gòu)。Myc-Cap細(xì)胞的裂解產(chǎn)物與Myc標(biāo)記的NY-ESO-1結(jié)合,用來(lái)做免疫共沉淀反應(yīng)，用c-Myc的多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為每組的第一列。然而總的細(xì)胞裂解液在每組的第二行。利用非變性的聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)用來(lái)進(jìn)行wb，左邊的組用了抗－NY-ESO-1抗體，中間組是用了兔的抗TLR4抗體，右邊組用了兔的抗CRT抗體。請(qǐng)觀察NY-ESO-1，TLR4，CRT在沉淀復(fù)合物及細(xì)胞裂解液中的位置。

D：共同沉淀下來(lái)的NY-ESO-1和鼠的TLR4與多聚物NY-ESO-1聯(lián)系。在每一組，1-4到包含了Myc-Cap細(xì)胞的裂解產(chǎn)物與編碼NY-ESO-1，ESOcs1，ESOcs2，ESOcs3基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合。沉淀產(chǎn)物也難怪抗c-Myc抗體來(lái)分離出NY-ESO-1及它的突變體，之后用兔的TLR4抗體（左上方），NY-ESO-1及它的突變體的mAb131抗體（左下方），TLR4在全細(xì)胞裂解液中在底部的圖中

圖3：NY-ESO-1和它的野生型變體以及TLR4基因敲除小鼠的免疫原性。

從C57BL / 10（A）和TLR4和C57BL／10scnj（B）免疫小鼠產(chǎn)生的分級(jí)轉(zhuǎn)化IgG抗體，是通過(guò)基因槍引入無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒產(chǎn)生的。繪制每組三只小鼠平均OD值是基于用ELISA對(duì)特異性抗體的目標(biāo)的檢測(cè)，即NY-ESO-1，HMGB-1，GAL蛋白。將前、后免疫血清都用ELISA稀釋五倍。如果在免疫之后對(duì)特定的抗原目標(biāo)OD值增加超過(guò)2倍，，表明血清為陽(yáng)性。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次，獲得了類(lèi)似的結(jié)果，而關(guān)鍵免疫做了第三次重復(fù)。

圖4：NY-ESO-1的體內(nèi)免疫佐劑作用

A：基因槍注射質(zhì)粒，造成免疫反應(yīng)，產(chǎn)生艾蒿花粉主要過(guò)敏原Art 1抗體之后的兩周，將收集到的血清稀釋1-50倍。在第二次免疫之后餓兩周，將血清稀釋1-1250倍。編碼wtArt， wtArt –ESO融合，及密碼子替換的Art（重組）Art質(zhì)粒用來(lái)造成每組3只小鼠的免疫，同樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果要重復(fù)兩次。

B：CA9特定的抗體是由pcDNA-CA9-ESO編碼產(chǎn)生的CA9-ESO融合蛋白所產(chǎn)生的，并不是是由pcDNA-CA9所編碼的產(chǎn)生的單獨(dú)的CA9基因所產(chǎn)生的。免疫小鼠所產(chǎn)生的血清與帶有g(shù)fp質(zhì)粒（第1列），CA9基因的質(zhì)粒（第2，4列），NY-ESO-1基因的質(zhì)粒（第3，5列）的293細(xì)胞裂解液進(jìn)行wb。全CA9以及NY-ESO-1蛋白都在圖中展示出來(lái)，在第2列的顏色稍微淡一些的陽(yáng)性條帶可能是CA9的轉(zhuǎn)錄變體。每組3只老鼠，從采用三組老鼠血清池獲得結(jié)果。

C：從3只老鼠／每組獲得的抗CA9抗體通過(guò)ELISA來(lái)分析重組的人CA9。一種以pcDNA-CA9為基礎(chǔ)的質(zhì)粒編碼，在相對(duì)于在鹽離子存在下pcDNA-CA9或是在pcDNA-CA9與pcDNA-ESO共同存在的情況下，CA9-ESO融合基因能夠顯著提高抗體的效價(jià)。所有的無(wú)內(nèi)毒素的質(zhì)粒都是經(jīng)過(guò)肌肉注射到Balb/c小鼠體內(nèi)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)1次。

圖5. 一種假定的機(jī)制在癌癥患者中NY-ESO-1蛋白的免疫原性

在癌癥環(huán)境中，從壞死的癌細(xì)胞中產(chǎn)生的NY-ESO-1與鈣網(wǎng)蛋白－Toll樣受體4（CRT-TLR4 ）復(fù)合物在樹(shù)突細(xì)胞表面發(fā)生聯(lián)系。由于CRT沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，與TLR4進(jìn)行復(fù)合。NY-ESO-1與CRT-TLR4復(fù)合物連接，從而引起了吞噬反應(yīng)及產(chǎn)生危險(xiǎn)信號(hào)。樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生了NY-ESO-1短肽以及分泌出促炎癥因子和趨化因子。NY-ESO-1不會(huì)在健康人的身上引起免疫反應(yīng)，因?yàn)樗谋磉_(dá)最開(kāi)始室受到睪丸免疫特權(quán)區(qū)域的限制。

具體實(shí)施方式：

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的相關(guān)融合質(zhì)粒構(gòu)建法，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，Western blotting，免疫共沉淀，ELISA，樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合法，數(shù)據(jù)分析及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

據(jù)推斷，最開(kāi)始對(duì)于腫瘤特異性抗原（TAA）的自身免疫應(yīng)答反應(yīng)可能有先天性免疫系統(tǒng)受體的參與。壞死腫瘤細(xì)胞會(huì)釋放內(nèi)源性因子或是例如熱休克蛋白，高遷移率族蛋白B1（HMGB-1），尿酸這樣的損傷相關(guān)模式分子。這些損傷模式分子分別通過(guò)CD91，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體，TLR2/TLR4，以及白介素-1（IL-1）受體向先天免疫系統(tǒng)發(fā)出警報(bào)。TAA本身通常被認(rèn)為是上述“危險(xiǎn)信號(hào)”的旁觀者，擔(dān)任抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)起始階段的佐劑。在尋找那些宿主和腫瘤中有助于促成抗腫瘤的免疫反應(yīng)的內(nèi)在因子的過(guò)程中，我們將關(guān)注點(diǎn)放在了NY-ESO-1身上。NY-ESO-1是一種具有超強(qiáng)免疫原性的非突變腫瘤睪丸抗原。針對(duì)于NY-ESO-1的自發(fā)性抗體以及T細(xì)胞免疫反應(yīng)能夠在患有NY-ESO-1表達(dá)的腫瘤病人身上常常檢測(cè)的到，這些病人包括那些免疫能力低的癌癥晚期的老年患者。但NY-ESO-1的免疫原性與它自身的聚合結(jié)構(gòu)以及小鼠體內(nèi)中的TLR4之間的聯(lián)系尚未清楚。

NY-ESO-1與在不成熟的樹(shù)突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞表面上補(bǔ)體Cq1受體間存在特殊的聯(lián)系，NY-ESO-1與先天性免疫系統(tǒng)之間的特異性相互作用。通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應(yīng)由其分子間的二硫鍵介導(dǎo)； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還可通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應(yīng)由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達(dá)。證實(shí)了TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。

相關(guān)融合質(zhì)粒構(gòu)建法

在之前的文章中介紹過(guò)的只有1-74位氨基酸殘基的NY-ESO-1，被稱為ESO（1-74）。為了在NY-ESO-1 cDNA中引入定點(diǎn)突變，利用PCR擴(kuò)增來(lái)將75，76,78位的半胱氨酸換成絲氨酸。使用下列的一對(duì)磷酸化的引物：正向引物， 5-TCCTCCAGATCCGGGGCCAGGGGGCCGGAGAG（下劃線表示突變）和反向引物，5-TCCATTCAGCCCTGAAGCCGCGCCGCCAT。PCR的模板為之前介紹過(guò)的表達(dá)載體PET-28-NY-ESO-1，用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)（Invitrogen）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物連接在載體上使其形成一個(gè)能夠編碼ESOcs1的新的質(zhì)粒。用同樣的方法引入在氨基酸152和165號(hào)位上從半胱氨酸到絲氨酸的突變，被稱為ESOcs2，使用下列一對(duì)引物：正向引物，5-TTGATGTGGATCACGCAGTCCTTTCTGCCCGTG，反向引物，5-CAGGGAAAGCTGCTGGAGAGAGGAGCTGATG（下劃線部分表示突變的核苷酸）。同樣，能夠產(chǎn)生以上5種75,76,78,152及165位半胱氨酸-絲氨酸替換突變的質(zhì)粒（命名為ESOcs3），也用上述方法進(jìn)行構(gòu)建。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法

HEK293及黑色素瘤細(xì)胞系397,624,2984從美國(guó)國(guó)家癌癥研究所獲得，均保存在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。黑色素瘤細(xì)胞系M202，F(xiàn)5.1，F(xiàn)5.4及F5.6原發(fā)腫瘤細(xì)胞的早期培養(yǎng)物，由Ali Jazirehi (UCLA)贈(zèng)與。利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）系統(tǒng)轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到293細(xì)胞中。Western blotting實(shí)驗(yàn)利用ECL發(fā)光系統(tǒng)（R&D公司，Minneapolis, MN）

免疫印跡法（Western blotting）

免疫印跡法（Western blotting）實(shí)驗(yàn)利用ECL發(fā)光系統(tǒng)（R&D公司，Minneapolis, MN）。

免疫共沉淀法

免疫共沉淀是小鼠的Myc-CaP細(xì)胞系進(jìn)行的，即能夠表達(dá)小鼠的TLR4及CRT，此細(xì)胞是Charles Sawyers(Memorial Sloan Kettering Cancer Institute, New York, NY)贈(zèng)與。Myc-Cap是通過(guò)導(dǎo)入了逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)編碼NY-ESO-1基因，并且這個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒融合了c-Myc標(biāo)簽。從10cm的培養(yǎng)皿中獲得細(xì)胞，并用含有蛋白酶抑制劑的50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2/CaCl2來(lái)裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解液與抗體過(guò)夜孵育，采用特異性結(jié)合有c-Myc標(biāo)簽磁珠將特異性蛋白分離了出來(lái)，通過(guò)非變性凝膠或是還原型SDS-PAGE來(lái)分析全蛋白。

細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法

Verikine TM鼠干擾素α酶聯(lián)免疫試劑盒從PBL InterferonSource公司（皮斯卡塔韋，新澤西州）購(gòu)買(mǎi)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，利用該試劑盒測(cè)定細(xì)胞因子水平。

樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合法

人的樹(shù)突狀細(xì)胞是從孤立的CD14(Miltenyi Biotech)得到的，即在1000單位/毫升人的GM-CSF (Amgen,Thousand Oaks, CA)和1000單位/毫升人的IL-4(Schering-Plough, San Francisco, CA)中保存6天的陽(yáng)性單核細(xì)胞。在Iscove’s medium (Invitrogen)培養(yǎng)液中加入10%人類(lèi)雄性血清(BioCheMed, Winchester, VA)用于樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)。按照之前的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，小鼠的樹(shù)突狀細(xì)胞是從C57BL／10小鼠和相應(yīng)的TLR2和TLR4基因敲除小鼠的骨髓細(xì)胞產(chǎn)生的(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)。

按照之前的描述，所有的樹(shù)突狀細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)都在冰上進(jìn)行，以防止由不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞導(dǎo)致的目標(biāo)蛋白的內(nèi)部活化。如果沒(méi)有特別注明，我們使用的蛋白濃度分別為3, 10, 和1μg/ml，目的是維持NY-ESO-1以及它的突變體,gp100, ESO(1–74)這些蛋白所使用的摩爾濃度保持一致。大約105從鼠和人中獲得的預(yù)先預(yù)冷的，不成熟的樹(shù)突細(xì)胞與上述蛋白在50ul的含有5%的胎牛血清的PBS緩沖液中混合，來(lái)消除非特異性反應(yīng)。在冰上孵育20min后，將樣品洗兩次，然后加入FITC標(biāo)記的二次抗體，此單克隆抗體要么是針對(duì)NY-ESO-1的抗體要么是針對(duì)多組氨酸標(biāo)簽(Sigma/Aldrich)的抗體。細(xì)胞孵育20min,清洗2遍，并進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

相關(guān)數(shù)據(jù)分析方法

實(shí)施例1

NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從細(xì)菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得的NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)（圖1A,B）。

實(shí)施例2

NY-ESO-1的聚合反應(yīng)由其分子間的二硫鍵介導(dǎo)。

將75,76,78,152及165位的氨基酸殘基中的半胱氨酸替換成絲氨酸。三種帶有氨基酸替換的NY-ESO-1分別為：在75,76,78位半胱氨酸-絲氨酸替換的ESOcs1，在152,165位替換的ESOcs2以及以上五個(gè)位點(diǎn)都替換突變的ESOcs3。將這些蛋白進(jìn)行純化并用Western blot來(lái)比較它們之間的齊聚反應(yīng)狀態(tài)(圖1B)。結(jié)果顯示出，野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了NY-ESO-1的聚合反應(yīng)是由于其分子間的二硫鍵造成的。

實(shí)施例3

NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)。

將這些蛋白進(jìn)行純化并用Western blot來(lái)比較它們之間的齊聚反應(yīng)狀態(tài)(圖1B)。結(jié)果顯示出，野生型蛋白清楚的顯示出了存在二聚體，四聚體甚至130 kDa的多聚體的形式。ESOcs1、ESOcs2顯示出的主要為單體及二聚體結(jié)構(gòu)形式，而ESOcs3的結(jié)果顯示出主要為單體。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了NY-ESO-1的聚合反應(yīng)是由于其分子間的二硫鍵造成的。在癌細(xì)胞中存在的NY-ESO-1，同樣采用Western blot分析其在含有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中蛋白聚合情況，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1主要表現(xiàn)為三聚體及四聚體，很少發(fā)現(xiàn)存在二聚體及單體形式的現(xiàn)象（突變1C）。實(shí)驗(yàn)表明NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合是與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)的。

實(shí)施例4

TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合。

我們分別采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來(lái)的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)進(jìn)行NY-ESO-1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒(méi)有顯著的影響（圖2A）。因?yàn)镹Y-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還通過(guò)了鈣網(wǎng)蛋白的作用，它能夠使TLR4基因敲除的小鼠依然保持著與樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合的作用。采用抗-TLR4抗體處理能夠阻止NY-ESO-1與人，鼠的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合，此現(xiàn)象也可以通過(guò)采用抗-CRT抗體處理（圖2B）；同時(shí)，采用β-actin的抗體作為陰性對(duì)照，此抗體對(duì)NY-ESO-1與樹(shù)突細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響。在與上述相同的實(shí)驗(yàn)條件下，用兩種抗體同時(shí)對(duì)TLR4及CRT進(jìn)行處理，并沒(méi)有顯示出明顯對(duì)NY-ESO-1/DC細(xì)胞之間聯(lián)系的協(xié)同抑制作用。作為NY-ESO-1與TLR4之間直接聯(lián)系的證據(jù)，顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來(lái)（圖2C）。與全細(xì)胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動(dòng)結(jié)合的。這一結(jié)果與研究不同突變的NY-ESO-1（圖1D）與未成熟的DC細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果一致，隨著聚合物的越來(lái)越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為NY-ESO-1能夠與人、鼠的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合是通過(guò)細(xì)胞表面的TLR4這一結(jié)論提供了依據(jù)。

實(shí)施例5

NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還可通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實(shí)驗(yàn)采用了從野生型小鼠及TLR4和TLR2基因敲除的小鼠骨髓中提取出來(lái)的樹(shù)突細(xì)胞來(lái)進(jìn)行NY-ESO-1的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，從而進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示出了TLR4主要影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合，而TLR2則沒(méi)有顯著的影響（圖2A）。因?yàn)镹Y-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還通過(guò)了鈣網(wǎng)蛋白的作用。

實(shí)施例6

聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，鼠的TLR4與野生型NY-ESO-1聚合物及鈣網(wǎng)蛋白形成明顯的高分子聚合物一起沉淀下來(lái)（圖2C）。與全細(xì)胞裂解液中的情況相比，這些高分子聚合物所包含的多聚體NY-ESO-1并不是以單體或者低分子量的結(jié)構(gòu)域與CRT和TLR4移動(dòng)結(jié)合的。這一結(jié)果與研究不同突變的NY-ESO-1（圖1D）與未成熟的DC細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果一致，隨著聚合物的越來(lái)越低聚化，TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量也隨之減少(圖2D)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量。

實(shí)施例7

免疫球抗體反應(yīng)由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與。

我們采用標(biāo)準(zhǔn)的基因槍程序方法將無(wú)內(nèi)毒素的編碼野生型NY-ESO-1基因以及其不同突變基因的質(zhì)粒（包括自然存在的變種LAGE-1b）轉(zhuǎn)入到C57BL/10及C57BL/10ScNJ(TLR4-/-)中，來(lái)使動(dòng)物產(chǎn)生免疫。質(zhì)粒所編碼的β-gal及膜錨定蛋白HMGB-1作為對(duì)照。每間隔兩個(gè)星期做一次免疫反應(yīng)，共兩次。在第二次免疫反應(yīng)后的兩周，將小鼠處死，取其血清來(lái)分析其抗體效價(jià)。野生型小鼠的抗原特異性，抗體分類(lèi)可通過(guò)質(zhì)粒編碼的NY-ESO-1序列及陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pSport-β-gal快速而有效的區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖3A）。注意到了ESO(1-74)蛋白中，其包含了被NY-ESO-1及其變體共享的占主導(dǎo)地位的B細(xì)胞表位，用來(lái)測(cè)定抗體，并通過(guò)由低聚變體誘導(dǎo)的抗體來(lái)使與野生型NY-ESO-1相結(jié)合的潛在差異降到最低。ESOcs1的引起的抗體的效價(jià)有某些程度上的減弱，然而ESOcs2， ESOcs3所引起的抗體其效價(jià)幾乎檢測(cè)不到。在TLR4基因敲除的小鼠中（圖3B），由野生型質(zhì)粒所編碼誘導(dǎo)的NY-ESO-1抗體的效價(jià)也有明顯的減弱，而β-gal特異性抗體的效價(jià)始終與在野生型小鼠中保持一致。表明NY-ESO-1抗體反應(yīng)的TLR4依賴性，而免疫的過(guò)程（皮膚）和原理（基因槍將質(zhì)粒注入體內(nèi)）不受TLR4支配。奇怪的是，一種早前報(bào)道過(guò)的與TLR4有某些聯(lián)系的蛋白HMGB－1，由編碼HMGB-1基因的質(zhì)粒做引起的免疫反應(yīng)只引起了TLR4基因缺失小鼠體內(nèi)的少量的抗體（從圖3B中可以看出，HMGB-1的抗體ELISA結(jié)果比NY-ESO-1, β-gal的背景小很多），但是在能夠與TLR4反應(yīng)的野生型小鼠體內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到抗體。在抗體效價(jià)測(cè)定中顯示，在野生型小鼠中NY-ESO-1聚合體結(jié)果突變（半胱氨酸-絲氨酸替換）與抗體效價(jià)有某些聯(lián)系，但是在TLR4基因敲除的小鼠中，這種聯(lián)系沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái)，例如，ESOcs1 在野生型小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生相當(dāng)高的抗體反應(yīng)，而在TLR4基因敲除的小鼠中卻沒(méi)有此現(xiàn)象，從而假設(shè)ESOcs1與野生型 NY-ESO-1與的免疫原性相同。與此相反，ESOcs2所誘導(dǎo)的抗體在TLR4基因敲除的小鼠中表現(xiàn)了高的抗體效價(jià)，而在野生型小鼠中沒(méi)有檢測(cè)到抗體，此現(xiàn)象與野生型的NY-ESO-1不同，但很像HMGB-1的免疫原性很像。ESOcs3在兩種小鼠中只展現(xiàn)出了很小的免疫原性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了免疫球抗體反應(yīng)的是由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4來(lái)參與的。

實(shí)施例8

Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達(dá)。

我們利用小鼠研究了NY-ESO-1對(duì)于過(guò)敏原免疫反應(yīng)的分子佐劑的作用。一個(gè)NY-ESO-1基因與艾蒿花粉主要過(guò)敏原基因融合表達(dá)的質(zhì)粒通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)入到了Balb/c小鼠內(nèi)。眾所周知，Art v1(wtArt)在體內(nèi)小鼠有著很低的免疫原性，例如，將野生型的Art基因疫苗注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，并沒(méi)有展示出其免疫原性，但是可以通過(guò)改變某些密碼子來(lái)變?yōu)椴溉閯?dòng)物能夠編碼的密碼子及可得到克服（重組Art）。當(dāng)Art與NY-ESO-1融合表達(dá)時(shí)，能夠顯著提高wtArt的免疫原性，并且使免疫反應(yīng)加快，注射完抗原后加快轉(zhuǎn)入到產(chǎn)生抗體的階段（圖4A）。并且，通過(guò)這個(gè)一次免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體比通過(guò)重組Art產(chǎn)生抗體更具有深遠(yuǎn)的意義，因?yàn)閮烧弋a(chǎn)生的抗體都達(dá)到了同樣的水平，但后者是通過(guò)兩次免疫才產(chǎn)生抗體。

另一個(gè)例子，NY-ESO-1與人的CA9基因融合表達(dá)的質(zhì)粒，pcDNA-CA9-ESO，與單獨(dú)編碼CA9基因的質(zhì)粒pcDNA-CA9，通過(guò)肌肉注射使產(chǎn)生免疫反應(yīng)，比較兩者的免疫程度。結(jié)果顯示，通過(guò)注射融合質(zhì)粒Balb/c所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生了高效價(jià)的NY-ESO-1抗體，而CA9抗體的效價(jià)相對(duì)較弱，反過(guò)來(lái)，在同樣的情況下只編碼CA9基因的質(zhì)粒并沒(méi)有產(chǎn)生任何抗體反應(yīng)。因?yàn)閜cDNA-CA9, pcDNA-ESO這兩種質(zhì)粒在之間相同的條件下，也并沒(méi)有引起任何的免疫反應(yīng)，從而說(shuō)明了這種CA9基因免疫原性的提高是依賴于于NY-ESO-1基因進(jìn)行了融合表達(dá)。

綜上所述，本發(fā)明發(fā)明人證實(shí)了TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1蛋白甚至在存在有常規(guī)濃度的β-巰基乙醇的loading buffer中也能形成多聚結(jié)構(gòu)；NY-ESO-1的聚合反應(yīng)由其分子間的二硫鍵介導(dǎo)； NY-ESO-1在體外與人的及鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合與其自身的聚合結(jié)構(gòu)有關(guān)；TLR4影響了NY-ESO-1與骨髓中DC細(xì)胞的體外結(jié)合；NY-ESO-1與人和鼠的未成熟的樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合還可通過(guò)鈣網(wǎng)蛋白的作用；聚合物低聚化減少了TLR4與NY-ESO-1的結(jié)合量；免疫球抗體反應(yīng)由NY-ESO-1的聚合體結(jié)構(gòu)和宿主體內(nèi)的TLR4參與；Art v1(wtArt)和CA9基因免疫原性的提高依賴于NY-ESO-1基因融合表達(dá)。表明TLR4介導(dǎo)NY-ESO-1引起的小鼠體內(nèi)抗體反應(yīng)。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。