本發(fā)明涉及體外診斷試劑領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及提高免疫試劑檢測特異性的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

體外診斷試劑指用于對人體樣本(各種體液、細胞、組織樣本等)進行體外檢測的試劑、試劑盒、校準(zhǔn)品(物)、質(zhì)控品(物)等，其檢測結(jié)果對臨床診斷及醫(yī)生的用藥處方有非常重要的提示作用。

在體外診斷試劑中，以雙抗體夾心為技術(shù)基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法是一種非常常用的檢測抗原的方法，廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫法、膠體金法、化學(xué)發(fā)光法試劑中。而在各種雙抗體夾心法檢測試劑的原料中，猶以鼠源單克隆抗體(以下簡稱鼠單抗)應(yīng)用最為廣泛。該種抗體應(yīng)用優(yōu)勢非常明顯：技術(shù)成熟、生產(chǎn)得到的抗體特異性高、批間差異小、成本較低、可比較方便地放大生產(chǎn)。

但該種方法也面臨一些特殊樣本的挑戰(zhàn)。例如，某些患者其本身體內(nèi)并沒有被測項目的物質(zhì)，因生活環(huán)境中有鼠類出沒，或因接受單克隆抗體治療，在其血液或體液樣本中可能含有人抗鼠抗體(即HAMA)，此類抗體在雙鼠單抗夾心法的檢測系統(tǒng)中可聯(lián)接捕獲抗體和標(biāo)記抗體，從而產(chǎn)生陽性結(jié)果，即假陽性結(jié)果。同樣的情況還會出現(xiàn)在某些自身免疫疾病患者的樣本中。例如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的體內(nèi)含有類風(fēng)濕因子(RF)也能夠聯(lián)接捕獲抗體和標(biāo)記抗體，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。而此類假陽性結(jié)果均有可能對臨床診斷和醫(yī)生處方造成一定的誤導(dǎo)，并導(dǎo)致不能夠?qū)ΠY下藥或是貽誤病情。

對于雙鼠單抗，即，捕獲抗體與標(biāo)記抗體均是鼠源單克隆抗體易引起假陽性的問題，業(yè)內(nèi)已有關(guān)注，并提供了如下所述的多種解決方案。但目前看來，各方案均有各自缺陷，具體是：

1.使用其他種屬動物的多克隆抗體替代其中一株鼠單抗。但多克隆抗體的特異性往往差于單克隆抗體，且多克隆抗體不同批次之間的一致性會較單克隆抗體更差，因此在大規(guī)模生產(chǎn)時會有比較大的風(fēng)險。

2.使用其他種屬動物的單克隆抗體替代其中一株鼠單抗。目前有公開報道的除了鼠源單克隆抗體還有兔源單克隆抗體，但兔單抗的制備工藝并不成熟，目前只有少數(shù)公司擁有該種抗體的生產(chǎn)能力，且價格非常昂貴。

3.在試劑中添加更高濃度的無關(guān)游離鼠單抗通過競爭抑制的方法降低檢測值。該方法價格便宜，但并不能完全消除樣本帶來的假陽性。

4.部分公司可以提供與無關(guān)游離鼠單抗結(jié)構(gòu)類似或是在此基礎(chǔ)上加工而成的阻斷物質(zhì)，添加在試劑中通過競爭抑制的方法起到降低檢測值的作用。該方法是目前使用最普遍的方法，但其中也有相當(dāng)大的風(fēng)險存在。首先，商品化的阻斷物質(zhì)其成分組成并不完全公開，其保密的組分在試劑中是否會對其他類型的特殊樣本檢測結(jié)果有影響尚不得而知。其次，商品化的阻斷物質(zhì)只對部分特殊樣本有效。再者，這樣的阻斷物質(zhì)往往比較昂貴且用量較大，不利于試劑生產(chǎn)企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)時的成本控制。

綜上所述，在雙單抗夾心法測抗原為反應(yīng)體系的免疫檢測試劑中，如遇到樣本中含有HAMA或RF，則極易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，給臨床診斷及醫(yī)生處方帶來一定的困擾。而目前業(yè)內(nèi)常用的解決方案或是性能較差，對診斷試劑性能有影響；或是工藝不成熟，無法穩(wěn)定重復(fù)生產(chǎn)；或是成本偏高，對企業(yè)負擔(dān)較大。

因此，本領(lǐng)域急需一種提高單克隆抗體在免疫類體外診斷試劑應(yīng)用中的特異性，從而減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種免疫檢測的方法，所述方法能夠提高單克隆抗體在免疫類體外診斷試劑應(yīng)用中的特異性，從而減少假陽性結(jié)果產(chǎn)生。

在第一方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)利用胃蛋白酶處理鼠源單克隆抗體；和

(b)利用經(jīng)過步驟(a)處理得到的鼠源單克隆抗體進行免疫檢測。

在具體的實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間還包括對經(jīng)過步驟(a)處理的鼠源單克隆抗體進行可檢測標(biāo)記的步驟。

在優(yōu)選的實施方式中，利用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、金顆粒、吖啶酯、免疫熒光標(biāo)記物；更優(yōu)選辣根過氧化物酶進行可檢測標(biāo)記。

在具體的實施方式中，所述步驟(b)是將經(jīng)過步驟(a)處理得到的鼠源單克隆抗體與稀釋液混合，然后用于免疫檢測；

其中所述稀釋液是以氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0～8.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，其中含有酪蛋白、硫酸鎂和復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD。

在第二方面，本發(fā)明提供一種稀釋液，所述稀釋液是4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，其中含有酪蛋白、硫酸鎂和復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD，以氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0～8.0。

在第三方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測試劑，所述免疫檢測試劑包含經(jīng)過胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體。

在具體的實施方式中，所述免疫檢測試劑還包含本發(fā)明第二方面所述的稀釋液。

在第四方面，本發(fā)明提供經(jīng)過胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體或本發(fā)明第二方面所述的稀釋液在制備免疫檢測試劑盒或免疫檢測試劑中的應(yīng)用。

在第五方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測試劑盒，所述試劑盒裝有經(jīng)過胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體。

在具體的實施方式中，所述試劑盒還裝有權(quán)利要求4所述的稀釋液。

在優(yōu)選的實施方式中，所述試劑盒還裝有使用說明書。

在第六方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測方法，所述方法包括利用本發(fā)明第三方面所述的免疫檢測試劑或本發(fā)明第五方面所述的免疫檢測試劑盒進行免疫檢測。

在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測方法可以是非診斷目的的。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了鼠源單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖譜，所述鼠源單克隆抗體經(jīng)胃蛋白酶處理并經(jīng)凝膠過濾層析純化以及分段收集。其中，M泳道為高分子Marker，分子量由上往下依次是97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD；1-6號泳道為凝膠過濾層析時不同時間收集的抗體；7號泳道為完整鼠源單克隆抗體；8號泳道為經(jīng)試驗驗證有較好檢測結(jié)果的抗體留樣；9號泳道為經(jīng)胃蛋白酶處理后未經(jīng)凝膠過濾純化的抗體。

具體實施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)利用特定的蛋白酶處理鼠源單克隆抗體后可以顯著減少免疫檢測的假陽性結(jié)果；同時配套使用本發(fā)明的稀釋液，可進一步降低假陽性樣本的檢測值，同時提高經(jīng)處理的鼠源單克隆抗體標(biāo)記物在工作濃度保存時的生物學(xué)穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的術(shù)語

本文所用的術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解相同或相似的含義。例如，HAMA是指人抗鼠抗體(Human Anti Mouse Antibody)；HAMA效應(yīng)是指因人抗鼠抗體引起的假陽性；RF是指類風(fēng)濕因子(Rheumatoid Factor)；S/COV是指樣本檢測值與臨界值(CutOff Value)的比值，用于對樣本進行定性判斷。

本發(fā)明的提高免疫試劑檢測特異性的方法

為解決采用雙鼠單抗夾心法進行免疫檢測易產(chǎn)生假陽性結(jié)果的缺陷，本發(fā)明人創(chuàng)造性地利用特定的蛋白酶處理鼠源單克隆抗體，從而顯著減少采用雙鼠單抗夾心法進行免疫檢測產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

在本發(fā)明的具體的實施方式中，利用胃蛋白酶對單克隆抗體進行處理，將經(jīng)處理的鼠源單克隆抗體用于雙鼠單抗夾心法免疫檢測，顯著減少了產(chǎn)生的假陽性結(jié)果。

進一步地，可以純化得到經(jīng)處理的鼠源單克隆抗體。在具體的實施方式中，本發(fā)明提供一種純化加工鼠單抗的方法，包括：在酸性緩沖液環(huán)境中，利用胃蛋白酶對鼠源單克隆抗體進行處理，使用凝膠過濾層析對處理后的鼠源單克隆抗體溶液進行純化。

為進行免疫檢測，可對經(jīng)處理的鼠源單克隆抗體進行可檢測標(biāo)記。例如，可利用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、金顆粒、吖啶酯、免疫熒光標(biāo)記物進行可檢測標(biāo)記；更優(yōu)選地，利用辣根過氧化物酶進行可檢測標(biāo)記。

在獲得胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體之余，本發(fā)明人進一步地發(fā)現(xiàn)，將本發(fā)明制得的稀釋液與純化的、胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體標(biāo)記酶結(jié)合物配套使用，可以進一步降低假陽性樣本的檢測值。在具體的實施方式中，本發(fā)明的稀釋液是以氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0～8.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，其中含有酪蛋白、硫酸鎂、復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD(西寶生物科技(上海)股份有限公司，貨號：ACE0073A)。

在具體的實施方式中，本發(fā)明提供這樣一種方法：以氫氧化鈉溶液調(diào)整4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液的pH至7.0～8.0，加入酪蛋白、硫酸鎂、復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD，混勻后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的經(jīng)胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體。

本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)點在于：

1)利用特定的蛋白酶處理常規(guī)的鼠源單克隆抗體；

2)在稀釋液的配制過程中使用了能夠較長時間控制恒定的pH范圍的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，并配以一定濃度的酪蛋白、硫酸鎂、復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD作為輔助原料，確保該稀釋液能夠?qū)?jīng)處理的鼠源單克隆抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶起到足夠的輔助作用，以保證最終的體外診斷試劑不會對含有HAMA或RF的特殊樣本有假陽性反應(yīng)；

通過上述二點可在雙鼠單抗夾心法的檢測體系中顯著降低HAMA樣本以及RF樣本的檢測值，從而達到避免因此二類情況導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。

本發(fā)明的經(jīng)胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體可用于制備免疫檢測試劑或免疫檢測試劑盒，利用這種所述免疫檢測試劑或免疫檢測試劑盒進行免疫檢測能夠有效降低假陽性結(jié)果。在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測試劑還包含本發(fā)明的稀釋液；或者所述免疫試劑盒還裝有稀釋液。在進一步優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測試劑盒還裝有使用說明書。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可利用本發(fā)明的免疫檢測試劑或免疫檢測試劑盒進行免疫檢測。但實施這種免疫檢測方法可以是診斷目的，也可以是非診斷目的；例如，僅僅為科研目的，或僅僅提供商業(yè)檢測服務(wù)。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1.本發(fā)明以成本非常低廉的方法有效地減少因HAMA效應(yīng)引起的假陽性檢測結(jié)果；

2.本發(fā)明的方法可以在普通實驗室中完成全部操作過程，因此非常簡便；

3.利用本發(fā)明的稀釋液，經(jīng)處理的鼠源單克隆抗體標(biāo)記物在工作濃度保存時能夠具備優(yōu)異的生物學(xué)穩(wěn)定性；和

4.本發(fā)明的方法使用到的化學(xué)或生物試劑大多為普通實驗室常規(guī)試劑，因此具備極好的適用性。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或本領(lǐng)域已知的文獻，例如各種教科書中所述的條件，例如分子克隆實驗指南(第二版)(J.薩姆布魯克等著)中所述的條件；或者按照市售可得儀器或試劑的使用說明書，或按照制造廠商所建議的條件。

材料與方法

材料

本申請的實施例中涉及的材料，例如各種試劑均是市售可得的試劑。

方法

純化加工鼠源單克隆抗體的方法：

1使用胃蛋白酶處理鼠源單克隆抗體；

2對經(jīng)過上一步驟處理的單克隆抗體進行標(biāo)記，可以減少樣本中的HAMA或RF導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。

具體步驟如下所述：

(1)取鼠源單克隆抗體腹水，按照常規(guī)正辛酸-硫酸銨沉淀法純化，獲得鼠源單克隆抗體；

其中，鼠源單克隆抗體腹水可以按照本領(lǐng)域已知的通用鼠單抗制備過程獲得，其過程大致如下所述：

小鼠免疫

按常規(guī)方法對小鼠進行抗原免疫，三次免疫后測靜脈血效價，如果效價達到10萬，進行尾靜脈加強免疫，三天后處死小鼠取脾臟融合。

細胞融合

骨髓瘤細胞制備

在融合前7-10天復(fù)蘇SP2/0細胞，擴大培養(yǎng)，融合前一天傳代調(diào)整細胞密度，使之第二天處于對數(shù)生長期。收集5×107個骨髓瘤細胞在離心管中，用37℃溫浴的無血清1640培養(yǎng)基離心洗細胞三次。

免疫小鼠脾細胞制備

免疫的小鼠眼眶放血，斷頸處死。用75％酒精浸泡，超凈臺內(nèi)無菌打開腹腔，取脾臟，去結(jié)締組織，眼科剪刀剪成糊狀過尼龍網(wǎng)，收集脾細胞。脾細胞加溫浴的無血清1640培養(yǎng)基離心洗三次。

細胞融合

將制備好的脾細胞和SP2/0細胞混勻，離心沉淀。彈松細胞團，置于37℃水浴，用玻璃吸管滴加0.7-1ml PEG1500，邊加邊緩慢攪拌，再加10ml培養(yǎng)基終止細胞融合。離心去上清，融合細胞懸浮到完全培養(yǎng)基中，加96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

單抗細胞株的篩選和克隆

單抗細胞株的篩選

融合板細胞完全培養(yǎng)基中37℃連續(xù)培養(yǎng)7-10天，換培養(yǎng)液。第二天間接ELISA檢測融合板的細胞培養(yǎng)上清，挑選OD值大于1.0的孔進行亞克隆。

單抗細胞株的克隆

取融合板陽性孔的細胞，顯微鏡計數(shù)，用完全培養(yǎng)基梯度稀釋成200個/10ml，100個/10ml，50個/10ml，25個/10ml，按0.2ml/孔加到96孔板各24孔，放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7-10天后仍然用ELISA間接法檢測亞克隆(同上融合板檢測)。之后陽性孔換完全培養(yǎng)基，連續(xù)亞克隆，直到單克隆細胞株陽性率連續(xù)兩次達到100％為止。

建株和凍存

96孔板的單克隆細胞株擴大培養(yǎng)到24孔板，細胞培養(yǎng)瓶，取對數(shù)生長期的細胞，臺盼藍染色，活細胞比例達到90％以上的細胞株離心凍存，加凍存液(20％1640培養(yǎng)基+10％DMSO)調(diào)整細胞密度為3-5×106，注入凍存管中，每管1ml，置于-80℃冰箱，24小時后移入液氮罐中。

單抗細胞株及其抗體的分析

細胞株的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)

常規(guī)復(fù)蘇細胞，從液氮罐中取出細胞，立即投入37℃水浴中迅速融化，加細胞到10ml完全培養(yǎng)基中離心，去上清，取細胞傳到培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)。每2-3天傳代一次。

小鼠腹水生產(chǎn)

提前一周在F1代小鼠腹腔注射佛氏不完全佐劑，收集上述培養(yǎng)細胞，0.01MPBS調(diào)整細胞密度在1×106個/ml，0.5ml/只注射F1小鼠腹腔中，一般小鼠于7-10天開始采集腹水。

(2)取純化后的鼠源單克隆抗體置于pH3.0～4.0，濃度為5～10mM的醋酸-醋酸鈉緩沖液(以下簡稱醋酸緩沖液)中透析2-5小時；

(3)自透析液中取出后，在鼠源單克隆抗體中加入使用醋酸緩沖液溶解的胃蛋白酶，每10～20mg鼠源單克隆抗體抗加入1mg胃蛋白酶(公司：SIGMA-ALDRICH，貨號：77160)，混勻后置37℃反應(yīng)16-22小時；

(4)反應(yīng)結(jié)束后，使用1M氫氧化鈉溶液調(diào)整該鼠源單克隆抗體溶液pH至8.0～8.5，終止反應(yīng)；之后置于pH為8.0～8.5的20mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(以下簡稱Tris緩沖液)中透析16～22小時；

(5)透析結(jié)束后，使用凝膠過濾層析對鼠源單克隆抗體溶液進行純化，層析填料為Sephadex G50，平衡液為Tris緩沖液。使用平衡液對層析柱平衡3-5個柱體積，上樣后繼續(xù)以平衡液淋洗，并在280nm波長紫外燈檢測下收集第一個蛋白峰；

(6)測定蛋白濃度后備用，可根據(jù)應(yīng)用的不同方法學(xué)選擇標(biāo)記辣根過氧化物酶、金顆粒、堿性磷酸酶或吖啶酯等標(biāo)記物。

含有標(biāo)記的鼠源單克隆抗體的稀釋液的配制：

1.配制4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，并以氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7.0～8.0；

2.在上述緩沖液中加入酪蛋白0.1～0.3％(質(zhì)量體積比)、硫酸鎂0.05～0.25％(質(zhì)量體積比)、復(fù)合酶穩(wěn)定劑DPD 0.5～3％(體積比)攪拌溶解、定容并混勻即可得稀釋液；

3.將制得的抗體標(biāo)記辣根過氧化物酶后，根據(jù)其生物活性，按比例加入稀釋液中，即可制得含有標(biāo)記的鼠源單克隆抗體的稀釋液。

實施例1.

根據(jù)以上材料與方法所述，制備鼠源單克隆抗體、經(jīng)胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體、以及經(jīng)凝膠過濾層析純化的經(jīng)處理鼠源單克隆抗體。對這些樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果示于圖1。圖中，M泳道為高分子Marker，分子量由上往下依次是97.2KD，66.4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD；1-6號泳道為凝膠過濾層析時不同時間收集的抗體；7號泳道為完整的鼠源單克隆抗體；8號泳道為經(jīng)試驗驗證有較好檢測結(jié)果的抗體留樣；9號泳道為經(jīng)胃蛋白酶處理后未經(jīng)凝膠過濾純化的抗體。

具體地說，電泳圖譜中，66.4KD附近的條帶是完整的鼠源單克隆抗體長鏈，44.3KD附近的條帶是經(jīng)胃蛋白酶處理的鼠源單克隆抗體長鏈，20.1KD附近的條帶是胃蛋白酶處理得到的雜蛋白等等。

使用1號泳道對應(yīng)的抗體溶液標(biāo)記辣根過氧化物酶后，使用本發(fā)明所述配方配制成的稀釋液稀釋至工作濃度。檢測HAMA樣本、RF樣本，以及陽性質(zhì)控品，結(jié)果如下表所示：

注：各項數(shù)值為s/cov的值，≥1為陰性，<1為陽性。

其中：

1-4^#HAMA樣本為公司內(nèi)部樣本，使用表中原工藝從健康人群樣本中篩選得到；

5-6^#為Roche公司提供的樣本，分別為：HAMA Serum，TYPE I(貨號：11767275103)以及HAMA Serum，TYPE II(貨號：05167060103)；

RF樣本來自SeraCare，貨號分別為：9248590和9268426。

由表中數(shù)據(jù)可見，按照本發(fā)明所述的方法制備得到的試劑，在檢測陽性樣本時(分別來自衛(wèi)生部臨檢中心、中國食品藥品檢定研究院以及我公司內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品)，檢測值基本無差異，從而能夠滿足陽性樣本檢測要求。

在檢測疑問樣本時(包括RF樣本和HAMA樣本)，檢測值均降至臨界值以下，即，檢測為陰性結(jié)果。

因此，本發(fā)明的方法可以有效地降低疑問樣本的檢測值，并消除了假陽性的結(jié)果。

對比例

發(fā)明人進一步利用其它蛋白酶處理鼠源單克隆抗體。當(dāng)利用得到的鼠源單克隆抗體檢測疑問樣本時(包括RF樣本和HAMA樣本)，得到假陽性結(jié)果。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。