本發(fā)明涉及一種布魯氏菌抗體檢測試紙條，屬生物制品檢測技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌或稱布魯氏菌(Brucella)引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的人獸共患病，嚴(yán)重地威脅著人和多種動物的生命健康。本病不但對動物的繁殖和生產(chǎn)性能具有嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，從而造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此在布魯氏菌流行的國家，消除布病一直是公共衛(wèi)生計劃中最重要的目標(biāo)之一。

布病在世界存在已有久遠(yuǎn)的歷史，人類對該病的研究認(rèn)識逐步加深，診斷水平不斷提高，隨著動物布病的研究進(jìn)展，動物布病血清學(xué)的檢測方法不斷改進(jìn)和提高。傳統(tǒng)的凝集試驗(yàn)(如：虎紅抗原平板凝集試驗(yàn)、試管抗原凝集試驗(yàn)、乳環(huán)凝集試驗(yàn))逐漸被敏感性高、特異性強(qiáng)的ELISA方法、熒光偏振試驗(yàn)(FPA)等新的檢測技術(shù)所取代。

凝集試驗(yàn)是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、乳環(huán)沉淀試驗(yàn)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)，其中經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(STAT)、平板凝集試驗(yàn)(PAT)，以上方法在發(fā)達(dá)國家已經(jīng)基本停止使用，取而代之的是緩沖布魯氏菌抗原凝集試驗(yàn)如虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價格便宜，操作方便，檢測快速，適于動物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗(yàn)，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。乳環(huán)沉淀試驗(yàn)依然是乳牛布魯氏菌監(jiān)測的主要方法，該方法直接對牛乳進(jìn)行檢測，可以對奶牛群體進(jìn)行篩檢，該方法簡便快速。

在布魯氏菌病血清學(xué)檢驗(yàn)中一致認(rèn)為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)在特異性上優(yōu)于其他方法，常被用來對試管凝集試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測為陽性或可疑的病例進(jìn)行定性檢測。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一直被認(rèn)為是最有效的布病診斷方法，至今尚沒有一種診斷方法能取代補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)在血清學(xué)診斷中的地位。但補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)所需要的溶血素的制備困難，試驗(yàn)操作繁瑣，難以在臨床上普遍使用，而且由于豬體內(nèi)的補(bǔ)體會干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致敏感性下降。

ELISA是一種與CFT效果相當(dāng)?shù)脑\斷方法，該方法操作方便，靈敏度高，特異性較好，一次可以完成大量樣品的檢測，既可以作為篩選試驗(yàn)應(yīng)用于動物群體檢疫，還可以作為確診試驗(yàn)。ELISA不僅可以應(yīng)用于血清抗體的檢測，還可應(yīng)用于乳樣中抗體的檢測。牛的布魯氏菌病ELISA檢測方法已是國際貿(mào)易中指定的檢測方法之一，其他種布魯氏菌的ELISA檢測方法也是研究的熱點(diǎn)。目前，用于布魯氏菌病檢測的ELISA有間接ELISA(iELISA)和競爭ELISA(cELISA)兩種。專利申請人也已成功開發(fā)了上述兩種試劑盒，并獲得國家新獸藥證書(2015新獸藥證字67號，2016新獸藥證字6號)，其中動物布魯氏菌病競爭ELISA抗體檢測試劑盒已獲得國家發(fā)明專利(專利號：ZL201310213811.5)，牛布魯氏菌間接ELISA抗體檢測試劑盒已經(jīng)申報國家發(fā)明專利(201510477116.9)。

上述各種布病檢測方法各有其自身的特點(diǎn)，但存在的共同缺陷是以上各種檢驗(yàn)都必須在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。一般需要先分離血清，然后按照各種方法的操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。而免疫膠體金技術(shù)克服了上述缺陷，可以直接采血后，滴加到膠體金試紙條加樣孔內(nèi)，現(xiàn)場就能判定是否為布魯氏菌感染。雖然已有相關(guān)膠體金發(fā)明專利的報道，如中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所王興龍等、吉林大學(xué)閆廣謀等(申請?zhí)?CN200710055740.5，CN200710055741.X，CN200810051726.2)采用以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標(biāo)抗體，由于SPA具有非特異性吸附IgG分子的能力，因此可用于對多種不同動物進(jìn)行診斷，但對不同動物體內(nèi)IgG吸附能力各不相同，因此對采用同一個試紙條對不同動物進(jìn)行布病檢測，其敏感性并不穩(wěn)定。新疆石河子大學(xué)陳創(chuàng)夫等(申請?zhí)?CN201210254837.X)同樣采用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標(biāo)抗體，只是體外表達(dá)的布魯氏菌特異性蛋白(OMP31和BP26)替代布魯氏菌LPS作為檢測抗原，并不能從根本上解決對不同動物診斷的敏感性問題。杭州迪恩科技有限公司張明洲等(申請?zhí)?CN201310033074.0)，采用布魯氏菌菌體抗原作為質(zhì)控線包被抗原，再利用一種抗紅細(xì)胞的單克隆抗體作為競爭用的單抗，吸附干燥的膠體金蛋白(流動帶)，建立了夾心法檢測牛布魯氏菌抗原的檢測試紙卡，由于布魯氏菌與一些革蘭氏陰性細(xì)菌，特別是耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157具有較強(qiáng)的菌體抗原相似性，而該專利中使用布魯氏菌菌體抗原作為膠體金顆粒的吸附抗原，理論上其檢測結(jié)果會存在一定的非特異性。

申請人也于2015年采用抗牛IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金成功開發(fā)了牛布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條，以及采用抗羊IgG Fc端的單克隆抗體標(biāo)記膠體金成功開發(fā)了羊布魯氏菌膠體金抗體檢測試紙條，并申請了國家發(fā)明專利(申請?zhí)柗謩e為20151047774.8、201510477800.7)。上述兩種試紙條均基于間接法原理開發(fā)而成，主要檢測血清中IgG類抗體。相對間接法而言，采用針對布魯氏菌特異性單克隆抗體開發(fā)的競爭法試紙條，不僅能對多種動物進(jìn)行布病檢測，而且由于單抗本身的特異性，以及能同時檢測血清中的IgG和IgM類抗體，因此試紙條在敏感性和特異性方面具有更明顯的優(yōu)勢。發(fā)明人依托自主制備的單抗，研發(fā)出一種敏感性和特異性均較好，可以同時檢測牛羊布魯氏菌病抗體，且價格低廉的國產(chǎn)布魯氏菌抗體檢測試紙條。

本發(fā)明專利具有操作簡單，結(jié)果快捷，易于判斷和保存等優(yōu)點(diǎn)，同時無需任何儀器設(shè)備，非常適合臨床快速診斷。由于該試紙條既可檢測牛，也可檢測羊，特別是基層農(nóng)村和小規(guī)模養(yǎng)殖場的布病檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種簡便快捷、能對多種不同動物實(shí)施現(xiàn)場快速檢測、且能排除小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157干擾的膠體金試紙條。

本發(fā)明的技術(shù)方案

1.一種布魯氏菌抗體檢測試紙條，其特征在于該試紙條由布魯氏菌抗體檢測試紙條和塑料吸頭組成。檢測試紙條由PVC底板、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊組成。金標(biāo)墊為膠體金標(biāo)記的光滑型布魯氏菌S2株脂多糖(LPS)和膠體金標(biāo)記的鼠源抗Flag標(biāo)簽的單克隆抗體；檢測線為布魯氏菌單克隆抗體3E4；質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。

2.如權(quán)利要求1所述一種布魯氏菌抗體檢測試紙條，其特征在于試紙條檢測線使用了布魯氏菌特異性單克隆抗體3E4，制備的布魯氏菌單克隆抗體3E4細(xì)胞株已于2013年05月送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNO.7706；該單克隆抗體能夠特異性識別布魯氏菌LPS,有效排除小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157對布魯氏菌病檢測的干擾。

3.如權(quán)利要求1所述一種布魯氏菌抗體檢測試紙條，其特征在于試紙條金標(biāo)墊中用于檢測布魯氏菌抗體的為膠體金顆粒標(biāo)記的光滑型布魯氏菌S2株脂多糖(LPS)，該LPS對常見的布魯氏菌病原抗體均具有良好的特異性和敏感性。

4.權(quán)利要求1所述的布魯氏菌抗體檢測試紙條的應(yīng)用，其特征在于使用該試紙條能對豬、牛、羊布魯氏菌進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。

本發(fā)明具體實(shí)施方式

1.選擇豬種布魯氏菌S2株(CVCC70502)作為試紙條LPS制備的生產(chǎn)菌種。

S2是我國最廣泛使用的疫苗株，該疫苗株免疫原性良好，是我國目前生產(chǎn)的三種布病疫苗株(S2株、A19株和M5株)中，毒力最弱、安全性最好的疫苗株。另外，我國布病試管凝集試驗(yàn)國家參照品、虎紅平板凝集試驗(yàn)國家參照品、布病全乳環(huán)狀凝集試驗(yàn)抗原國家參照品，以及同類布病診斷抗原，均采用S2株作為生產(chǎn)用菌種?；诳乖约吧锇踩治觯驹嚰垪l生產(chǎn)抗原用菌種為豬種布魯氏菌S2株(CVCC70502)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存和供應(yīng)。

2.選擇布魯氏菌單克隆抗體3E4作為試紙條的競爭抗體。

單克隆抗體對抗原反應(yīng)的特異性在很大程度上決定了本試劑盒的特異性和敏感性。對本試劑盒使用的單克隆抗體3E4特異性鑒定結(jié)果顯示，該單抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清或制備的腹水)與豬種布魯氏菌S1330抗原、牛種布魯氏菌A99、羊種布魯氏菌16M抗原均發(fā)生凝集反應(yīng)，與都柏林沙門氏菌不發(fā)生凝集反應(yīng)，且與布魯氏菌存在較強(qiáng)血清學(xué)交叉反應(yīng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157抗原均不發(fā)生凝集，這也是本試紙條能最終能鑒別診斷布魯氏菌與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157的根本原因。

3.采用膠體金標(biāo)記的Flag單抗作為試紙條免疫擴(kuò)散系統(tǒng)有效性的指示。

本研究制備的試紙條是基于競爭法建立的檢測方法，其原理為在檢測線上包埋抗布魯氏菌LPS單克隆抗體，金標(biāo)墊則噴有LPS膠體金溶液。樣品加入后，由于吸水紙的虹吸作用，金標(biāo)墊上的LPS膠體金溶液向檢測線方向擴(kuò)散，若待檢樣品不含布魯氏菌抗體，LPS與檢測線處包埋的單克隆抗體2C7發(fā)生反應(yīng)，從而檢測區(qū)(T)上出現(xiàn)紫紅色條帶，判為陰性。若待檢樣品中含有布魯氏菌抗體，抗體將與LPS膠體金溶液發(fā)生反應(yīng)，封閉LPS抗原位點(diǎn)，致使LPS無法與檢測線上包被的單克隆抗體2C7發(fā)生反應(yīng)，從而檢測區(qū)(T)上不出現(xiàn)紫紅色條帶，從而判為陽性。為了確認(rèn)免疫擴(kuò)散系統(tǒng)的有效性(排除由于免疫擴(kuò)散系統(tǒng)失效而導(dǎo)致的檢測線無條帶)，基于競爭法制備的試紙條需要選擇另外一套獨(dú)立的抗原抗體系統(tǒng)來驗(yàn)證。為此，本研究對免疫擴(kuò)散驗(yàn)證系統(tǒng)的抗原抗體進(jìn)行選擇。

通過綜合比較多種商品化單克隆抗體，申請人發(fā)現(xiàn)Sigma公司生產(chǎn)的Flag單抗效價高，背景低，價格低。此外，由于其包裝為5ml，一支即可滿足本研究制備一批試紙條的需求，從而避免了由于使用不同批次及不同包裝抗體具有差異性而導(dǎo)致各試紙條質(zhì)量不一致?；谕瑯拥脑?，我們選擇了Sigma公司生產(chǎn)的羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線包被抗體，與鼠源Flag單抗構(gòu)成對應(yīng)的免疫擴(kuò)散驗(yàn)證系統(tǒng)。

4.對試紙條生產(chǎn)工藝進(jìn)行多因素優(yōu)化。

在布魯氏菌抗體檢測試紙條制備過程中，發(fā)明人對各個反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。對膠體金顆粒大小、膠體金標(biāo)記最佳pH值、膠體金溶液最佳標(biāo)記量、檢測線抗體和質(zhì)控線抗體包被濃度均作了比較試驗(yàn)，通過評價試驗(yàn)結(jié)果，最終確定當(dāng)往100ml蒸餾水中加入1ml 1％氯金酸溶液和1.5ml 1％檸檬酸鈉水溶液后，膠體金顆粒大小為40nm左右(40±4nm)，符合研究要求；金標(biāo)記最適pH值為7.5；膠體金溶液最佳標(biāo)記量為每毫升膠體金溶液中加入LPS溶液(1mg/mL)14μL，每毫升膠體金加入Flag單克隆抗體10μg；檢測線包被抗體(布魯氏菌單克隆抗體3E4，競爭ELISA效價為1：20000)作1:200稀釋，質(zhì)控線包被抗體(羊抗鼠IgG抗體)，濃度為0.5mg/ml。

5.采用一定規(guī)模、背景清楚的陰性和陽性樣本對試紙條的特異性和敏感性進(jìn)行評價。

(1)將近年間課題組收集的400余份田間樣本，經(jīng)虎紅凝集試驗(yàn)初篩后，再用試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測，共確定了143份(其中牛血清73份、羊血清70份)三種方法均檢測為布病陽性的血清。將這143份血清采用3批試紙條進(jìn)行檢測，陽性率均為100％。由此確定本試紙條對田間樣本的敏感性為100％。

(2)將近年間課題組收集的400余份田間樣本，經(jīng)虎紅凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測，共確定了134份(其中牛血清71份、羊血清63份)用三種方法均檢測為布病陰性的血清。將這134份血清用采用3批試紙條進(jìn)行檢測，陰性率均為99.25％。由此確定本試紙條對田間樣本的特異性為99.25％。

附圖說明

圖1 LPS抗原特異性檢查結(jié)果圖圖中顯示：2條特異性PCR條帶，大小分別為178bp和285bp。

圖2膠體金顆粒電鏡照片(100 000×)

圖3免疫膠體金試紙條的組裝示意圖1為樣品墊，2為金標(biāo)墊，3為硝酸纖維素膜，4為吸水紙，5為檢測線，6為質(zhì)控線，7為PVC板。

本發(fā)明微生物資源信息

本發(fā)明所涉及的微生物為：豬種布魯氏菌(BrucellaSuis)S2株(CVCC70502)，來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，系豬種布魯氏菌生物1型，是布魯氏菌病弱毒活疫苗株。羊種布魯氏菌(BrucellaMelitensis)M28株(CVCC70003)，來自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，系羊種布魯氏菌生物1型，是布魯氏菌病活疫苗效力評價檢驗(yàn)用強(qiáng)毒參考株。兩個菌株均由北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心鑒定、保管和供應(yīng)(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p35、p32)。布魯氏菌單克隆抗體3E4細(xì)胞株已于2013年05月送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.7706(見中國專利ZL 201310213811.5)。

本發(fā)明的積極意義

本發(fā)明涉及一種布魯氏菌抗體檢測試紙條。本發(fā)明具有以下意義：(1)豐富了我國布魯氏菌病診斷方法；(2)為我國布病診斷提供了一種簡便快捷、能對多種不同動物實(shí)施現(xiàn)場快速檢測的新方法；(3)本試紙條克服了常規(guī)布病診斷方法不能排除小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157抗血清對布魯氏菌抗體的干擾，提高了布病檢測的特異性。

實(shí)施例

以下實(shí)施例為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不對本發(fā)明構(gòu)成限制。

實(shí)施例1

——試紙條的制備

1.試紙條LPS抗原的制備

選取布魯氏菌疫苗S2株作為抗原生產(chǎn)種子，將S2經(jīng)TSA培養(yǎng)后，提取的LPS，經(jīng)純化和定量后，用于固定于膠體金試紙條的硝酸纖維素膜對應(yīng)檢測線的位置。

(1)建立LPS抗原制備用布魯氏菌S2豬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1)菌落形態(tài)菌落邊緣整齊、圓潤，露滴狀，斜光照射，逆光觀察微帶藍(lán)色乳光。

2)染色形態(tài)為球桿菌，單個散在，不形成芽孢和莢膜。大小在0.3～0.6μm之間。革蘭氏染色為陰性，柯氏染色為紅色。

3)純粹按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)純粹。

4)特異性

①血清學(xué)特異性以培養(yǎng)物制成抗原，與光滑型布魯氏菌陽性血清應(yīng)出現(xiàn)凝集，與粗糙型血清不出現(xiàn)凝集。

②PCR特異性合成如下4條引物，將其配成引物混合儲存液，各引物濃度均為25μM。

Feri：5’-GCGCCGCGAA GAACTTATC A A-3’21(序列1)

Reri:5’-CGCCATGTTA GCGGCGGTGA -3’20(序列2)

F_suis：5’-GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG-3’23(序列3)

R_IS711:5’-TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT-3’24(序列4)

模板：S2培養(yǎng)菌落或試劑盒提取的S2基因組DNA。

PCR反應(yīng)體系：50μL的反應(yīng)體系中，含5μL 10×Buffer，8μL2.5mMdNTPs，混合引物儲存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少許)。

PCR反應(yīng)程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min進(jìn)行28個循環(huán)，最后72℃10min。

結(jié)果：擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，應(yīng)出現(xiàn)2條特異性PCR條帶，大小分別為178bp和285bp(見附圖1)。

2.確定標(biāo)記LPS膠體金顆粒的大小

(1)膠體金顆粒的制備取250ml圓底燒瓶，量取100ml蒸餾水并加1ml 1％氯金酸溶液，攪拌加熱至煮沸。加入0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml等不同體積1％檸檬酸鈉水溶液至上述氯金酸水溶液中，攪拌混勻，并保持沸騰10min。10min后停止加熱，待溶液冷卻后，補(bǔ)加蒸餾水定容至100ml，此即膠體金溶液。將制備好的膠體金溶液置于2～8℃保存。用支持膜的鎳網(wǎng)蘸取金標(biāo)溶液，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察，計算100個膠體金蛋白顆粒的平均直徑，同時用1×PBS緩沖液(含1％BSA)將膠體金溶液作1:20稀釋后測定OD_520nm值。

(2)膠體金顆粒大小的選擇膠體金顆粒大小與檸檬酸鈉的加入量成反比(表1)。加入1.5ml 1％檸檬酸鈉于100ml 0.01％的氯金酸溶液中制備的膠體金顏色為酒紅色，顆粒大小比較均一(電鏡觀察膠體金顆粒，如圖2所示)，符合要求。根據(jù)康熙雄主編的《免疫膠體金技術(shù)臨床應(yīng)用》的要求以及本實(shí)驗(yàn)室制備的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，確認(rèn)本研究中使用的膠體金顆粒平均直徑約為40nm(40±4nm)，膠體金溶液OD_520nm在0.2～0.3之間。

表1膠體金制備過程中檸檬酸三鈉加入量與膠體金顆粒大小之間的關(guān)系

3.確定膠體金試紙條的主要工藝確定

(1)膠體金溶液最佳標(biāo)記量的確定分別取待標(biāo)記的光滑型布魯氏菌S2株脂多糖和商品化Flag單抗(濃度均為1mg/ml)0μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入1ml膠體金中，作用45分鐘后加入100μL 10％NaCl，2～8℃靜置2小時。酒紅色LPS膠體金溶液未發(fā)生顏色改變的最少含量為12μL，因此，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上加20％，即每毫升膠體金溶液中含LPS 14μL(1mg/mL)。酒紅色商品化Flag單抗膠體金溶液未發(fā)生顏色變化的最少含量為8μL，即含商品化Flag單抗8μg，因此，在此基礎(chǔ)上加20％，即每毫升膠體金溶液中含F(xiàn)lag單抗10μg。

(2)檢測線抗體和質(zhì)控線抗體包被濃度的確定布魯氏菌單克隆抗體3E4作為硝酸纖維素膜上的檢測線包被抗體。將布魯氏菌單抗腹水(競爭ELISA效價為1:20000)用劃膜包被液(含有3％甲醇、1％蔗糖、0.05％疊氮鈉的0.02M磷酸鹽緩沖液，pH7.4)作1:100、1:200、1:400、1:800稀釋，用點(diǎn)膜儀(Bio-Dot,USA)以0.1μl/mm噴到黏附在PVC板上硝酸纖維素膜的檢測線(T線)的位置。隨著抗體包被濃度的增加，檢測線的顏色也逐漸加深，當(dāng)布魯氏菌單抗腹水用劃膜包被液作1:200稀釋，檢測線顏色鮮艷、明顯、易于判讀，因此確定為檢測線最佳抗體包被濃度。

(3)硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線包被抗體濃度確定用劃膜包被液將羊抗鼠IgG抗體稀釋至0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL，用點(diǎn)膜儀以0.1μl/mm分別噴到黏附在PVC板上硝酸纖維素膜質(zhì)控線(C線)位置。試驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著抗體包被濃度的增加，質(zhì)控線的顏色也逐漸加深，當(dāng)羊抗鼠IgG抗體濃度為0.5mg/ml時，質(zhì)控線顏色鮮艷、明顯、易于判讀，因此確定為質(zhì)控線最佳抗體包被濃度。

4.試紙條的組裝

(1)免疫膠體金系統(tǒng)的組裝如圖3所示，先將硝酸纖維素膜(3)粘貼到PVC板(7)的相應(yīng)位置，然后將樣品墊(1)，金標(biāo)墊(2)，吸水紙(4)依次粘貼到PVC板(7)的相應(yīng)位置。使金標(biāo)墊(2)與硝酸纖維素膜(3)部分接觸，約1～2mm；使吸水紙(4)與硝酸纖維素膜(3)部分接觸，約2～3mm。用切條機(jī)將其切成3mm寬的小條，放置上下蓋板內(nèi)。

(2)試紙條的組裝用鋁箔袋將1個試紙條，1支滴管及一包干燥劑密封包裝成布魯氏菌抗體檢測試紙條；每10個試紙條和1份說明書，包裝成1盒。

實(shí)施例2

——布魯氏菌抗體檢測試紙條部分主要原輔料的來源及檢驗(yàn)方法

1.Flag單克隆抗體購自Sigma公司，對于不同批次的Flag單克隆抗體，在使用前需對其進(jìn)行如下檢驗(yàn)：

(1)性狀無色澄明液體。

(2)供應(yīng)商提供的產(chǎn)品分析報告對供應(yīng)商提供的產(chǎn)品分析報告進(jìn)行檢查，核實(shí)其蛋白含量、克分子比、特異性等參數(shù)是否在規(guī)定范圍內(nèi)。

(3)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。

(4)檢驗(yàn)報告見表2。

表2鼠源Flag單克隆抗體檢驗(yàn)報告

2.羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司，對于不同批次的羊抗鼠IgG抗體，在使用前需對其進(jìn)行如下檢驗(yàn)：

(1)性狀淡黃色粉末。

(2)供應(yīng)商提供的產(chǎn)品分析報告對供應(yīng)商提供的產(chǎn)品分析報告進(jìn)行檢查，核實(shí)其蛋白含量、克分子比、特異性等參數(shù)是否在規(guī)定范圍內(nèi)。

(3)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無細(xì)菌生長。

(4)檢驗(yàn)報告見附表3。

表3羊抗鼠IgG抗體檢驗(yàn)報告

實(shí)施例3

——競爭ELISA方法測定單抗(3E4)腹水效價測定

1.腹水稀釋將制備的腹水用1×PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000和1:40000稀釋。

2.cELISA測定取抗原包被板(根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用)，以1×洗滌液300μl/孔洗板1次，棄去洗滌液。將稀釋好的陽性對照血清和陰性對照血清分別加入到ELISA板中，50μl/孔，其中陽性及陰性對照血清各做2個重復(fù)。加樣結(jié)束后，加入已稀釋好的單克隆抗體，每孔50μl，振蕩混勻5min。37℃孵育30min后，取出反應(yīng)板，棄去反應(yīng)液，每孔加入300μl 1×洗滌液，洗滌3次后，甩干。將HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體用相應(yīng)的稀釋液作1:100稀釋后，每孔加入100μl，37℃孵育30min后，同上方法洗滌3次，甩干。將底物溶液A和B按1:1(V/V)混合后，立即加入到ELISA反應(yīng)板中，100μl/孔，室溫避光顯色15min后，每孔加50μl終止液終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀測定OD_450nm值。

3.計算公式PI(抑制率)＝(陰性對照OD_450nm－陽性對照OD_450nm)/陰性對照OD_450nm×100％

4.效價判定腹水各稀釋度中使陽性對照血清的PI平均值≥90％的最高稀釋度作為腹水的效價。

實(shí)施例4

——試紙條的敏感性試驗(yàn)

1.對梯度稀釋的布魯氏菌抗體質(zhì)控陽性血清的靈敏度試驗(yàn)

將布魯氏菌抗體陽性血清進(jìn)行2倍梯度稀釋后，用3批實(shí)驗(yàn)室自制試紙條進(jìn)行檢測，確定該試紙條對梯度稀釋的陽性對照血清的靈敏度，結(jié)果見表4。

表4對梯度稀釋的陽性對照血清的靈敏度檢測

注：布魯氏菌抗體檢測試紙條的判定標(biāo)準(zhǔn)為：僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在檢測區(qū)(T)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)，判為陽性(標(biāo)為“P”)；當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)均出現(xiàn)紫紅色條帶時，判為陰性(標(biāo)為“N”)。

由表4可見，3批試紙條檢測梯度稀釋質(zhì)控陽性血清的結(jié)果一致，均可檢測至作1:64倍稀釋的質(zhì)控陽性血清。

2.對已知陽性樣本的敏感性試驗(yàn)

采用3批布魯氏菌抗體檢測試紙條對143份布魯氏菌抗體陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。計算每批試紙條的敏感性，結(jié)果見表5。

表5對已知陽性樣本的敏感性檢測

注：1.布魯氏菌抗體檢測試紙條的判定標(biāo)準(zhǔn)為：僅質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紫紅色條帶，在檢測區(qū)(T)內(nèi)無紫紅色條帶出現(xiàn)，判為陽性(標(biāo)為“P”)；當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)(T)均出現(xiàn)紫紅色條帶時，判為陰性(標(biāo)為“N”)。2.編號1～73為牛血清樣本；74～143為羊血清樣本。

由表5可見，對于143份牛、羊布魯氏菌抗體陽性血清，實(shí)驗(yàn)室制備的3批試紙條檢驗(yàn)結(jié)果均為陽性。3批試紙條檢測結(jié)果分析見表6。

表6對已知陽性血清的敏感性分析

表6表明，實(shí)驗(yàn)室制備的3批布魯氏菌抗體檢測試紙條對143份布病陽性樣本的敏感性均為100％，表明試紙條敏感性較高，作為臨床檢測時不易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。

序列表

<110> 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

<120> 布魯氏菌抗體檢測試紙條

<130>

<160> 4

<170> Patentin version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 對人工序列的描述：引物Feri

<400> 1

GCGCCGCGAA GAACTTATCA A 21（序列1）

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 對人工序列的描述：引物Reri

<400> 2

CGCCATGTTA GCGGCGGTGA 20（序列2）

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 對人工序列的描述：引物Fsuis

<400> 3

GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG 23（序列3）

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 對人工序列的描述：引物RIS711

<400> 4

TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT 24（序列4）

1