本發(fā)明涉及比色免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種方便檢測腫瘤標(biāo)志物的比色免疫分析方法。

背景技術(shù)：

免疫分析是一種基于抗原-抗體之間的高特異性免疫識別作用而發(fā)展起來的高選擇性、高靈敏分析方法。免疫分析的理論基礎(chǔ)是抗原-抗體之間的特異性反應(yīng)，即免疫反應(yīng)。比色免疫分析一般利用抗體或抗原來作為生物敏感元件，在將其固定于某些載體表面后，通過載體表面的抗原-抗體免疫反應(yīng)來定量捕獲示蹤標(biāo)記物，再利用示蹤標(biāo)記物與特定檢測試劑生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)，憑借肉眼或紫外-可見分光光度計(jì)等簡單儀器來比較或測量有色物質(zhì)溶液深度來建立起定量分析關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對特定的靶向分析物的準(zhǔn)確檢測。

癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)是一種存在于結(jié)腸癌、正常胚胎腸道、胰腺和肝內(nèi)的一種蛋白多糖復(fù)合物?？蓮V泛存在于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后是一個較好的腫瘤標(biāo)志物。

目前，檢測腫瘤標(biāo)志物普遍采用的是電分析化學(xué)和熒光、化學(xué)發(fā)光、電致化學(xué)發(fā)光等光學(xué)免疫分析方法。與這些方法相比，比色免疫分析所使用的儀器更加簡單，且可與磁珠分析平臺相結(jié)合，操作更加方便、高效。傳統(tǒng)比色免疫分析主要采用基于金/銀納米粒子聚集和基于酶/模擬酶催化底物顯色反應(yīng)這兩種比色檢測策略，前者靈敏度一般較低，后者在酶催化反應(yīng)中通常面臨著檢測試劑較為昂貴，顯色穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。因此，建立一種成本更加低廉，靈敏度更高，且可方便、快速檢測腫瘤標(biāo)志物的免疫分析方法是本技術(shù)領(lǐng)域亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是針對目前檢測腫瘤標(biāo)志物的儀器昂貴、操作繁雜、檢測試劑成本高等問題，提供一種方便檢測腫瘤標(biāo)志物的比色免疫分析方法，該方法操作簡便，成本低廉，不需要昂貴的儀器和試劑，靈敏度高，反應(yīng)時間短。

本發(fā)明的一種方便檢測腫瘤標(biāo)志物的比色免疫分析方法，包括以下步驟：

（1）功能化磁珠的制備

取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁場的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液沖洗三遍，向沖洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和0.2M 的N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液200μL，室溫震蕩反應(yīng)30min以活化磁珠表面的羧酸基團(tuán)，將活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液沖洗三遍后重新分散于400μL濃度為50mM，pH=6.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中，再加入10μL濃度為1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗體，室溫震蕩反應(yīng)3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室溫震蕩封閉反應(yīng)1h，在外部磁場作用下，將已進(jìn)行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗凈，重新分散于400μL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（2）脲酶功能化金納米探針的制備

取1mL直徑為13nm的金納米粒子于樣品管中，用濃度為0.1M Na₂CO₃溶液調(diào)節(jié)至pH=8.5，依次加入5μL濃度為1mg/mL的癌胚抗原CEA標(biāo)記抗體和100μL濃度為2mg/mL的脲酶，混勻組裝1.5h后4℃下放置過夜，再將所得產(chǎn)物離心，除去多余的癌胚抗原CEA標(biāo)記抗體和脲酶，將產(chǎn)物重新分散于0.8mL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室溫封閉反應(yīng)1h后，將得到的脲酶功能化的金納米粒子經(jīng)過離心洗凈，分散于1mL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液中CEA含量的檢測

分別取制備好的功能化磁珠40μL置于6個樣品管中，將濃度為1mg/mL CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液用50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分別稀釋成濃度梯度為0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，依次將上述6個不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)儲備液100μL分別置于上述6個樣品管中，在37℃震蕩培育20min，在外部磁場作用下，用含0.05%（w/v）吐溫的濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗凈，再分別向每個樣品管加入100μL的脲酶功能化金納米探針，在37℃震蕩培育20min，將所得產(chǎn)物在外部磁場作用下洗滌三次后，再向樣品管中加入濃度為0.25M的尿素和濃度為0.5M的Cu²⁺混合液100μL，37℃恒溫震蕩反應(yīng)10min，再將所得產(chǎn)物用濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干凈，再向其中加入10μL濃度為0.1M HCl溶液，靜置反應(yīng)5min后向其中加入100μL濃度為10μM銅離子檢測試劑，所述銅離子檢測試劑是溶于Tris-HCl和四氫呋喃體積比為1/9的溶液中，首先通過肉眼初步觀察顏色變化，初步判斷標(biāo)準(zhǔn)品中CEA的濃度，再在外部磁場作用下，磁分離取上層清液在紫外可見分光光度計(jì)測定標(biāo)準(zhǔn)品中CEA的含量；

（4）樣品中CEA含量的檢測

取臨床血清樣品，每個樣品分別進(jìn)行5個平行試驗(yàn)，樣品的處理方法同上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測血清樣品中CEA的含量。

本發(fā)明中的一種方便檢測腫瘤標(biāo)志物的比色免疫分析方法在檢測腫瘤標(biāo)志物中的應(yīng)用，所述腫瘤標(biāo)志物為甲胎蛋白（AFP）、胰胚胎抗原（POA）、同工酶（NSE）、激素（HCG）等。

本發(fā)明基于比色免疫分析的特點(diǎn)，開展了一種快速檢測CEA的新型比色免疫分析方法。所述比色免疫分析平臺通過抗體功能化磁珠而構(gòu)建，樣品中的腫瘤標(biāo)記物CEA通過免疫反應(yīng)被定量捕獲到磁珠表面，進(jìn)一步通過夾心免疫反應(yīng)定量捕獲脲酶功能化金納米探針于其表面形成免疫復(fù)合物，固定在金納米粒子表面的高含量脲酶催化尿素底物水解，生成的產(chǎn)物與溶液中游離態(tài)的銅離子在金納米粒子表面礦化生成堿式碳酸銅沉淀，外部磁場作用進(jìn)行分離之后在稀酸的作用下釋放出銅離子，加入高效顯色劑使溶液產(chǎn)生顏色的變化，從而演變成可測的光信號，該信號與待測樣品中CEA的濃度成正相關(guān)，通過工作曲線即可得到樣品中CEA的含量。本發(fā)明中使用的銅離子高效顯色劑在專利《一種吡啶腙類化合物及其制備方法和用途》，公布號為CN104529887A中公開。

本發(fā)明具有操作簡單，成本低廉，反應(yīng)快速的特點(diǎn)，對待測物的定量檢測僅需通過肉眼或者簡單的紫外-可見分光光度計(jì)即可進(jìn)行，因而對推廣比色免疫分析在醫(yī)藥分析、食品安全等方面的實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。

附圖說明

圖1是功能化磁珠的制備及其CEA免疫識別示意圖；

圖2是脲酶功能化金納米探針的制備示意圖；

圖3是CEA比色免疫檢測原理示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 一種方便檢測腫瘤標(biāo)志物CEA的比色免疫分析方法，包括以下步驟：

（1）功能化磁珠的制備

取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁場的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液沖洗三遍，向沖洗后的磁珠中加入0.2M 的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和0.2M 的N-羥基丁二酰亞胺（NHS）的混合溶液200μL，室溫震蕩反應(yīng)30min以活化磁珠表面的羧酸基團(tuán)，將活化后的磁珠用50mM Tris-HCl溶液沖洗三遍后重新分散于400μL濃度為50mM，pH=6.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液中，再加入10μL濃度為1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗體，室溫震蕩反應(yīng)3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris-甘氨酸溶液，室溫震蕩封閉反應(yīng)1h，在外部磁場作用下，將已進(jìn)行功能化的磁珠用Tris-HCl溶液洗凈，重新分散于400μL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用；

（2）脲酶功能化金納米探針的制備

取1mL直徑為13nm的金納米粒子于樣品管中，用濃度為0.1M Na₂CO₃溶液調(diào)節(jié)至pH=8.5，依次加入5μL濃度為1mg/mL的癌胚抗原CEA標(biāo)記抗體和100μL濃度為2mg/mL的脲酶，混勻組裝1.5h后4℃下放置過夜，再將所得產(chǎn)物離心，除去多余的癌胚抗原CEA標(biāo)記抗體和脲酶，將產(chǎn)物重新分散于0.8mL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，再向其中加入200μL含2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室溫封閉反應(yīng)1h后，將得到的脲酶功能化的金納米粒子經(jīng)過離心洗凈，分散于1mL濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中，于4℃保存待用。

實(shí)施例2 標(biāo)準(zhǔn)溶液中CEA含量的檢測

分別取制備好的功能化磁珠40μL置于6個樣品管中，將濃度為1mg/mL CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液用50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液分別稀釋成濃度梯度為0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，依次將上述6個不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)儲備液100μL分別置于上述6個樣品管中，在37℃震蕩培育20min，在外部磁場作用下，用含0.05%（w/v）吐溫的濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液和Tris-HCl溶液交替洗凈，再分別向每個樣品管加入100μL的脲酶功能化金納米探針，在37℃震蕩培育20min，將所得產(chǎn)物在外部磁場作用下洗滌三次后，再向樣品管中加入濃度為0.25M的尿素和濃度為0.5M的Cu²⁺混合液100μL，37℃恒溫震蕩反應(yīng)10min，再將所得產(chǎn)物用濃度為50mM，pH=7.4的Tris-HCl溶液中清洗干凈，再向其中加入10μL濃度為0.1M HCl溶液，靜置反應(yīng)5min后向其中加入100μL濃度為10μM銅離子檢測試劑，所述銅離子檢測試劑是溶于Tris-HCl和四氫呋喃體積比為1/9的溶液中，首先通過肉眼初步觀察顏色變化，初步判斷標(biāo)準(zhǔn)品中CEA的濃度，再在外部磁場作用下，磁分離取上層清液在紫外可見分光光度計(jì)測定標(biāo)準(zhǔn)品中CEA的含量，得到的CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，見下表1。

表1 CEA標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線

實(shí)施例3 人血清中CEA含量的檢測

取三個臨床血清樣品，每個樣品分別進(jìn)行5個平行試驗(yàn)，樣品的處理方法同上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)檢測樣品中CEA的濃度見下表2，將上述三個臨床血清樣品使用本實(shí)施例方法與貝克曼化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的測定結(jié)果比較，結(jié)果下表2。

表2 本實(shí)施例與貝克曼化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的測定結(jié)果比較

從上表2可以看出，本實(shí)施例測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.8-5.6%，相對誤差為-3.7-3.1%，說明本實(shí)施例的免疫分析方法具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。將本實(shí)施例的測試結(jié)果與貝克曼化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測結(jié)果相比較，1號樣品的相對誤差為-2.2%，2號樣品的相對誤差為3.1%，3號樣品的相對誤差為-3.7%，由此可見，本實(shí)施例的免疫分析方法具有較高的準(zhǔn)確度。