本發(fā)明涉及口蹄疫合成肽疫苗檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定效力檢驗(yàn)必須采用本動(dòng)物進(jìn)行檢驗(yàn)，由于國(guó)家實(shí)行100％的強(qiáng)化免疫政策，很難選出易感的檢驗(yàn)用動(dòng)物，而且動(dòng)物攻毒對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)施要求高(BSL3級(jí)實(shí)驗(yàn)室)、耗時(shí)長(zhǎng)(一個(gè)月以上)、資金花費(fèi)大。如果采用血清中和試驗(yàn)選擇易感動(dòng)物，在技術(shù)上難以排除具有細(xì)胞免疫的非易感動(dòng)物，在檢驗(yàn)實(shí)際中經(jīng)常發(fā)生檢驗(yàn)數(shù)據(jù)不規(guī)律的問(wèn)題，影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的質(zhì)量檢測(cè)一直困擾著獸藥監(jiān)測(cè)部門(mén)和相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)。因此需要盡快研制體外檢驗(yàn)技術(shù)，代替現(xiàn)有的本動(dòng)物試驗(yàn)。

當(dāng)前國(guó)家對(duì)疫苗的檢驗(yàn)正逐步過(guò)渡到對(duì)疫苗內(nèi)抗原的檢測(cè)，而當(dāng)前較為普遍的方法為疫苗破乳后對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)將疫苗進(jìn)行破乳處理，使抗原轉(zhuǎn)移至水相中，繼而對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)分析。由于疫苗乳化過(guò)程中所使用的油佐劑中成分復(fù)雜，含有表面活性劑，免疫增強(qiáng)劑等物質(zhì)存在，破乳后的水相中往往會(huì)含有上述雜質(zhì)和破乳劑，行業(yè)內(nèi)并沒(méi)有能夠去除上述雜質(zhì)和破乳劑的方法，而雜質(zhì)及破乳劑等還會(huì)大大影響其后的檢測(cè)過(guò)程，造成信號(hào)掩蓋或干擾，壓低了抗原信號(hào)的強(qiáng)度，甚至無(wú)法有效檢測(cè)到其中的抗原，由于其中雜質(zhì)的隨機(jī)分配性，造成其檢測(cè)方法的重復(fù)性不佳，同時(shí)增加了儀器維護(hù)成本。

口蹄疫合成肽疫苗是一種通過(guò)人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成的保護(hù)性短肽?，F(xiàn)有定量測(cè)定方法通常有Lowry法、BCA法、HPLC等方法。且現(xiàn)有的定量方法中，由于疫苗破乳后，疫苗水相成分較復(fù)雜，待檢樣品通常需要耗費(fèi)大量時(shí)間純化后才能達(dá)到檢測(cè)要求，且很多常規(guī)方法檢測(cè)靈敏度有限。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)一起快速、方便、特異、可定量等優(yōu)點(diǎn)，在很多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。常規(guī)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA中，抗原與有限濃度的抗體同時(shí)加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進(jìn)行反應(yīng)，抗體與游離的抗原、固相化的抗原結(jié)合率概率為50％，得到的結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較低，這使得檢測(cè)靈敏度較低。不能很好的反應(yīng)口蹄疫合成肽疫苗中有效抗原含量。

目前，對(duì)于口蹄疫合成肽疫苗抗原含量定量檢測(cè)沒(méi)有通用準(zhǔn)確的方法。急需研發(fā)一直更加快速，有效，方便的油佐劑疫苗的定性定量檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法。通過(guò)將口蹄疫合成肽疫苗采用特殊的破乳方法進(jìn)行破乳，再對(duì)破乳后的水相抗原樣品直接進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，可準(zhǔn)確對(duì)疫苗進(jìn)行定性定量分析。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：將口蹄疫合成肽疫苗破乳，將破乳后的抗原樣品采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行定性定量檢測(cè)；

所述破乳方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競(jìng)爭(zhēng)劑混勻后，離心，即得抗原樣品。

優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑為氨基酸及其衍生物中的至少一種。

優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑為賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和脯氨酸中的一種。

優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑的加入量為：每1ml油佐劑疫苗中加入1-40mg競(jìng)爭(zhēng)劑，更優(yōu)選1-20mg競(jìng)爭(zhēng)劑。所述競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)劑飽和析出，影響超濾過(guò)程；濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)效果不佳，無(wú)法釋放足夠檢測(cè)的抗原。

優(yōu)選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為9:1-5:5。

更優(yōu)選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為1:1。油佐劑疫苗與正丁醇的體積相同，可更好的保證疫苗完全破乳。

采用所述的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原樣品無(wú)需進(jìn)一步純化，即可直接用于抗原的定量定性檢測(cè)。

優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法采用的步驟如下：

抗原包被：將已知濃度人工合成的口蹄疫抗原固相化吸附到ELISA板子上；

稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)贵w稀釋后效價(jià)為1:250000-1:1100000；

抗原稀釋?zhuān)涸谘逑♂尠迳?，用稀釋液將待檢抗原樣品稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行不同比例稀釋形成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋液；

抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原樣品的定量檢測(cè)：將稀釋好的待檢抗原樣品和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋液分別與稀釋好的抗體在稀釋板中進(jìn)行完全反應(yīng)，然后將各完全反應(yīng)后的反應(yīng)液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，各加入酶標(biāo)記物、底物依次反應(yīng)，再各加入終止液終止，測(cè)定OD值，采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原的OD值繪制抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待檢抗原樣品的OD值對(duì)應(yīng)到所述抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得待測(cè)抗原樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，除以破乳效率，即為待測(cè)抗原樣品中抗原實(shí)際含量。

優(yōu)選地，抗原包被步驟中，所述人工合成的口蹄疫抗原濃度為0.5μg/mL-5μg/mL。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原樣品的定量檢測(cè)步驟中，所述完全反應(yīng)的時(shí)間大于等于60min，反應(yīng)溫度為37℃。該反應(yīng)時(shí)間可盡可能的保證反應(yīng)完全。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原樣品的定量檢測(cè)步驟中，所述各完全反應(yīng)后的反應(yīng)液分別加入到固相化抗原的ELISA板子中繼續(xù)反應(yīng)大于等于30min，反應(yīng)溫度為37℃。該反應(yīng)時(shí)間若小于30min，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不徹底，最終OD值偏低，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

優(yōu)選地，抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及待檢抗原樣品的定量檢測(cè)步驟中，所述酶標(biāo)記物為SPA-HRP，或者為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。

更優(yōu)選地，所述酶標(biāo)記物為羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP。采用羊抗豬生物素-IgG和親和素-HRP作為酶標(biāo)記物，由于生物素親和素之間高親和力的牢固結(jié)合及多級(jí)放大效應(yīng)，可使抗原的檢測(cè)限更低。

優(yōu)選地，所述稀釋后酶標(biāo)記物的用量為100μL，稀釋比例為1:5000-1:10000。

優(yōu)選地，所述底物為：TMB溶液。

優(yōu)選地，所述終止液為2mol/L的H₂SO₄溶液。

本發(fā)明的原理是：通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)劑與表面活性劑競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而將油佐劑疫苗中的抗原釋放至水相中，從而大大提高了水相中的抗原回收率。再將破乳后得到的水相抗原樣品采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，使抗原樣品與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應(yīng)，待抗原抗體反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液加入到固相吸附有抗原的ELISA板子中進(jìn)行反應(yīng)，之后加入酶標(biāo)記物進(jìn)行反應(yīng)，最后與底物顯色進(jìn)行檢測(cè)。最終的檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為抗原濃度越高，顯色后檢測(cè)的OD值越低，成反比關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行不同比例稀釋進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)聯(lián)從而達(dá)到定性定量的要求。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1)本發(fā)明通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)劑與表面活性劑競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而將油佐劑疫苗中的抗原釋放至水相中，與不加競(jìng)爭(zhēng)劑相比，大大提高了水相中的抗原回收率。

2)本發(fā)明采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，先將抗原與有限濃度的抗體先在稀釋板中反應(yīng)，抗體與待檢抗原先完全中和，達(dá)到完全抑制的目的。在隨后固相化吸附有抗原的ELISA板中，固相化抗原與抗體結(jié)合隨之減少，使得固相化抗原、待測(cè)抗原與抗體結(jié)合機(jī)會(huì)不均等。因此，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率會(huì)大于常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)法，從而大大提高檢測(cè)靈敏度。

2)由于疫苗破乳后，水相成分較復(fù)雜。該方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，破乳后水相樣品無(wú)需進(jìn)行純化處理即可進(jìn)行測(cè)定，相比較其他檢測(cè)方法花費(fèi)時(shí)間較短。

3)競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA對(duì)試劑的要求非常少，不管是單抗還是多抗都可以用于實(shí)驗(yàn)，更重要的是不管被檢對(duì)象是大分子物質(zhì)還是多肽、小分子藥物、小分子激素等只有一個(gè)表位的分子不能使用夾心ELISA的都可以使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。

4)由于抗原抗體反應(yīng)具有較高特異性，當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易去除，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，采用本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)法達(dá)到可檢測(cè)目的。同時(shí)反應(yīng)抗體稀釋后濃度較低，降低了非特異反應(yīng)和交叉反應(yīng)的干擾。

5)本發(fā)明采用間接法，利用很少量的酶可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng)，產(chǎn)生可供觀察的顯色現(xiàn)象，使得抗原能在較低濃度下進(jìn)行定量，靈敏度較高，且重復(fù)性好。

附圖說(shuō)明

通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為實(shí)施例1的抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為實(shí)施例2的抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為對(duì)比例1的方法破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測(cè)圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，具體采用以下步驟：

1)將市售的豬口蹄疫合成肽疫苗(疫苗抗原濃度為50μg/mL)按照如下方法破乳處理：

取10ml待檢疫苗與正丁醇以體積比1:1混合，加入50mg組氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。

本實(shí)施例采用的市售的豬口蹄疫合成肽疫苗與理論抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，對(duì)其HPLC檢測(cè)圖譜樣品出峰位置進(jìn)行積分，其積分信息如表1所示，樣品中抗原含量以積分峰面積的形式體現(xiàn)，其積分峰面積為1826453。對(duì)本實(shí)施例采用Butanol+His破乳后水相中抗原樣品濃度的HPLC檢測(cè)圖譜樣品出峰位置進(jìn)行積分，其積分信息如表2所示，樣品中抗原含量以積分峰面積形式體現(xiàn)，其積分峰面積為1676683。對(duì)比表1和表2的結(jié)果可知，將兩者積分信息對(duì)比后，其抗原回收率為91.8％，即破乳效率為91.8％。

表1

表2

2)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)

2.1抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.2稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行一定比例稀釋?zhuān)♂尯罂贵w效價(jià)為1:250000；

2.3待檢抗原(所述待檢抗原為步驟1得到的水相抗原樣品)與標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋?zhuān)涸谘逑♂尠迳?，用稀釋液將待檢抗原按1:100稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)抗原分別按稀釋后濃度為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL進(jìn)行稀釋?zhuān)?/p>

2.4抗原抗體反應(yīng)：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原中分別加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

2.5孵育結(jié)束后，將血清稀釋板中的各反應(yīng)液分別吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

2.6孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL 1:10000稀釋好的SPA-HRP，于37℃下孵育30min；

2.7孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL TMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

2.8顯色結(jié)束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；

2.9根據(jù)測(cè)定的OD值，將各標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度以10為底對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)得的OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝-0.3611x+1.4586，如圖1所示；將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，抗原實(shí)際含量＝[(對(duì)應(yīng)抗原濃度×稀釋倍數(shù))/破乳效率]/2即為樣品中抗原實(shí)際含量。即為樣品中抗原實(shí)際含量。本實(shí)施例中，測(cè)得待檢抗原的OD值為0.404，計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為45.30μg/mL。

注：由于疫苗破乳后，油相與水相分離，水相中實(shí)際抗原濃度增大1倍，計(jì)算疫苗實(shí)際抗原濃度需除以2。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，具體采用以下步驟：

1)將市售的豬口蹄疫合成肽疫苗(疫苗抗原濃度為50μg/mL)按照如下方法破乳處理：

取10ml待檢疫苗與正丁醇以體積比1:1混合，加入10mg苯丙氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。

采用本實(shí)施例的方法對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，破乳效率為88.4％。

2)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)

2.1抗原包被：將3μg/mL人工合成口蹄疫抗原，每孔100μL，固相化到ELISA板子上；

2.2稀釋抗體：將已知效價(jià)的抗體進(jìn)行一定比例稀釋?zhuān)♂尯罂贵w效價(jià)為1:1100000；

2.3待檢抗原(所述待檢抗原為步驟1得到的水相抗原樣品)與標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋?zhuān)涸谘逑♂尠迳?，將待檢抗原用稀釋液按1:100稀釋?zhuān)阎獦?biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行稀釋?zhuān)♂対舛确謩e為1000ng/mL、500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL；

2.4抗原抗體反應(yīng)：在稀釋板中，將100μL稀釋好的待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原中加入等量稀釋好的抗體并混勻，于37℃下孵育60min；

2.5孵育結(jié)束后，將血清稀釋板中的反應(yīng)液吸取100μL到固相化有抗原的ELISA板中，于37℃下孵育30min；

2.6孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL 1:10000稀釋好的羊抗豬生物素-IgG，于37℃下孵育30min；

2.7孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL 1:5000稀釋好的親和素-HRP，于37℃下孵育30min；

2.8孵育結(jié)束后，以PBST為洗液，洗板5次并拍干板中液體，向ELISA板中加入100μL TMB溶液，于37℃下避光顯色15min；

2.9顯色結(jié)束后，向ELISA板中加入100μL 2mol/LH₂SO₄溶液終止反應(yīng)，并于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；

2.10根據(jù)測(cè)定的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度以10為底對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，OD450為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝-0.4001x+1.5138，如圖2所示；將待檢抗原的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出待測(cè)對(duì)應(yīng)抗原濃度，抗原實(shí)際含量＝[(對(duì)應(yīng)抗原濃度×稀釋倍數(shù))/破乳效率]/2即為樣品中抗原實(shí)際含量。本實(shí)施例中，測(cè)得待檢抗原的OD值為0.338，計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為49.26μg/mL。

注：由于疫苗破乳后，油相與水相分離，水相中實(shí)際抗原濃度增大1倍，計(jì)算疫苗實(shí)際抗原濃度需除以2。

采用本實(shí)施例方法對(duì)該樣品的10個(gè)平行樣進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，其結(jié)果的波動(dòng)范圍在±0.80內(nèi)，說(shuō)明其重復(fù)性良好。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，具體采用以下步驟：

1)將實(shí)施例1所述的市售的豬口蹄疫合成肽疫苗(疫苗抗原濃度為50μg/mL)按照如下方法破乳處理：

取10ml待檢疫苗與正丁醇以體積比1:1混合，每管加入200mg脯氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。

采用本實(shí)施例的方法對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，破乳效率為95.6％。

2)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)

采用的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法與實(shí)施例2相同。計(jì)算得樣品中抗原的實(shí)際含量為48.96μg/mL。

對(duì)比例1

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗(采用實(shí)施例1的疫苗)的快速定性定量檢測(cè)方法，與實(shí)施例1的方法基本相同，不同之處僅在于：本對(duì)比例中不加入競(jìng)爭(zhēng)劑。

采用本對(duì)比例的方法測(cè)得水相中的抗原實(shí)際含量為零。該對(duì)比例采用正丁醇破乳后的水相中抗原濃度HPLC檢測(cè)圖譜如圖3所示，從該圖中可看出，在抗原理論保留時(shí)間內(nèi)并未檢出抗原，說(shuō)明樣品中含有的抗原量極低，抗原回收率基本為零，其破乳效率基本為零。因此無(wú)法滿足后續(xù)檢測(cè)要求。

本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。