本發(fā)明涉及口蹄疫疫苗檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定效力檢驗(yàn)必須采用本動(dòng)物進(jìn)行檢驗(yàn)，由于國(guó)家實(shí)行100％的強(qiáng)化免疫政策，很難選出易感的檢驗(yàn)用動(dòng)物，而且動(dòng)物攻毒對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)施要求高(BSL3級(jí)實(shí)驗(yàn)室)、耗時(shí)長(zhǎng)(一個(gè)月以上)、資金花費(fèi)大。如果采用血清中和試驗(yàn)選擇易感動(dòng)物，在技術(shù)上難以排除具有細(xì)胞免疫的非易感動(dòng)物，在檢驗(yàn)實(shí)際中經(jīng)常發(fā)生檢驗(yàn)數(shù)據(jù)不規(guī)律的問(wèn)題，影響檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的質(zhì)量檢測(cè)一直困擾著獸藥監(jiān)測(cè)部門(mén)和相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)。因此需要盡快研制體外檢驗(yàn)技術(shù)，代替現(xiàn)有的本動(dòng)物試驗(yàn)。
當(dāng)前國(guó)家對(duì)疫苗的檢驗(yàn)正逐步過(guò)渡到對(duì)疫苗內(nèi)抗原的檢測(cè)，而當(dāng)前較為普遍的方法為疫苗破乳后對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)將疫苗進(jìn)行破乳處理，使抗原轉(zhuǎn)移至水相中，繼而對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)分析。眾所周知，疫苗是由抗原與佐劑以一定比例、按特定程序乳化而成的，然而佐劑卻為疫苗破乳檢測(cè)帶來(lái)了巨大障礙。
由于疫苗乳化過(guò)程中所使用的油佐劑中成分復(fù)雜，含有表面活性劑，免疫增強(qiáng)劑等物質(zhì)存在，破乳后的水相中往往會(huì)含有上述雜質(zhì)和破乳劑，行業(yè)內(nèi)并沒(méi)有能夠去除上述雜質(zhì)和破乳劑的方法，而雜質(zhì)及破乳劑等還會(huì)大大影響其后的檢測(cè)過(guò)程，造成信號(hào)掩蓋或干擾，壓低了抗原信號(hào)的強(qiáng)度，甚至無(wú)法有效檢測(cè)到其中的抗原，由于其中雜質(zhì)的隨機(jī)分配性，造成其檢測(cè)方法的重復(fù)性不佳，同時(shí)增加了儀器維護(hù)成本。在疫苗行業(yè)內(nèi)，如何對(duì)油佐劑疫苗進(jìn)行破乳并對(duì)疫苗內(nèi)成分進(jìn)行檢測(cè)和鑒定是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的技術(shù)難點(diǎn)，由于油佐劑疫苗成分復(fù)雜，其中又含有大量的表面活性劑及免疫增強(qiáng)劑等物質(zhì)，會(huì)對(duì)所有檢測(cè)方法造成干擾，甚至無(wú)法檢測(cè)，不能反映出疫苗內(nèi)抗原的真實(shí)狀態(tài)。
雖然業(yè)內(nèi)已有破乳方法，但其效率和效果均不佳，傳統(tǒng)的破乳方法破乳后會(huì)有種種問(wèn)題，例如破乳不完全、水相和油相分界不清晰、水相中檢測(cè)不到抗原等問(wèn)題一直困擾著業(yè)界。如何去尋找一種高效的破乳方法成了業(yè)內(nèi)亟待解決的問(wèn)題。
ZIPTIP方法為一種簡(jiǎn)易的質(zhì)譜前除鹽的方法，在分析檢測(cè)中用于鹽類(lèi)物質(zhì)的去除?，F(xiàn)有技術(shù)中尚未有將該方法用于抗原純化的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：
將油佐劑疫苗破乳后，所得水相抗原樣品進(jìn)行ZIPTIP純化，純化后的樣品進(jìn)行定性定量檢測(cè)；
所述破乳的方法為：將油佐劑疫苗與正丁醇混合，然后加入競(jìng)爭(zhēng)劑，振蕩混勻后，離心，即得水相抗原樣品。
優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑包括氨基酸及其衍生物中的至少一種。
優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑為賴(lài)氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和脯氨酸中的一種。
優(yōu)選地，所述競(jìng)爭(zhēng)劑的加入量為：每1ml油佐劑疫苗中加入1-40mg競(jìng)爭(zhēng)劑，更優(yōu)選1-20mg競(jìng)爭(zhēng)劑。所述競(jìng)爭(zhēng)劑的濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)劑飽和析出，影響超濾過(guò)程；濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致競(jìng)爭(zhēng)效果不佳，無(wú)法釋放足夠檢測(cè)的抗原。
優(yōu)選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為9：1～5：5。
更優(yōu)選地，所述油佐劑疫苗與正丁醇的體積比為1:1。油佐劑疫苗與正丁醇的體積相同，可更好的保證疫苗完全破乳。
優(yōu)選地，所述ZIPTIP純化的具體步驟如下：
A1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
A2.吸取樣品吸排數(shù)次；
A3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
A4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品，即可。
優(yōu)選地，所述純化后的樣品進(jìn)行凍干或濃縮。
優(yōu)選地，采用電泳后染色的方法進(jìn)行抗原樣品的定量定性檢測(cè)。
采用本發(fā)明的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原樣品無(wú)需進(jìn)一步純化，即可直接用于抗原的定量定性檢測(cè)。
現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
1)本發(fā)明通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)劑與表面活性劑競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而將油佐劑疫苗中的抗原釋放至水相中，與不加競(jìng)爭(zhēng)劑相比，大大提高了水相中的抗原回收率。
2)本方法采用ZIPTIP純化方法，可有效去除抗原樣品中的雜質(zhì)，通過(guò)特異性吸附抗原，除去復(fù)雜樣品中的表面活性劑等雜質(zhì)，同時(shí)其洗脫后得到的樣品可以直接用于高精度儀器的分析檢測(cè)。
附圖說(shuō)明
通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
圖1為對(duì)比例1的方法破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，加入50mg組氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進(jìn)行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數(shù)次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測(cè)
將通過(guò)步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進(jìn)行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進(jìn)行對(duì)比，抗原條帶出現(xiàn)在理論分子量大小區(qū)域，可對(duì)其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(shù)(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測(cè)得濃度69.3ug/ml結(jié)果相符。
本實(shí)施例采用的市售的豬口蹄疫合成肽疫苗與理論抗原濃度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，對(duì)其HPLC檢測(cè)圖譜樣品出峰位置進(jìn)行積分，其積分信息如表1所示，樣品中抗原含量以積分峰面積的形式體現(xiàn)，其積分峰面積為2738690。對(duì)本實(shí)施例采用Butanol+His破乳后水相中抗原樣品濃度的HPLC檢測(cè)圖譜樣品出峰位置進(jìn)行積分，其積分信息如表2所示，樣品中抗原含量以積分峰面積形式體現(xiàn)，其積分峰面積為2530549。對(duì)比表1和表2的結(jié)果可知，將兩者積分信息對(duì)比后，其抗原回收率為92.4％，即破乳效率為92.4％。
表1
表2
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，加入10mg苯丙氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
采用本實(shí)施例的方法對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，破乳效率為87.6％。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進(jìn)行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數(shù)次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測(cè)
將通過(guò)步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進(jìn)行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進(jìn)行對(duì)比，抗原條帶出現(xiàn)在理論分子量大小區(qū)域，可對(duì)其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(shù)(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測(cè)得濃度65.7ug/ml結(jié)果相符。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗的快速定性定量檢測(cè)方法，采用以下步驟：
1)樣品破乳將按照如下方法破乳處理：
取10ml待檢疫苗(市售的豬口蹄疫合成肽疫苗，濃度為75ug/ml)與正丁醇以體積比1:1混合，每管加入200mg脯氨酸，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000r/min離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，即得水相抗原樣品。
采用本實(shí)施例的方法對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，破乳效率為94.8％。
2)樣品的ZIPTIP純化
2.1將步驟1)制得的水相抗原樣品凍干或濃縮，使用ZIPTIP進(jìn)行純化，其步驟如下：
1.使用50％ACN吸排活化ZIPTIP；
2.吸取樣品吸排數(shù)次；
3.使用0.05％TFA水吸排清洗ZIPTIP；
4.使用含0.05％TFA的ACN洗脫樣品。
3)定性定量檢測(cè)
將通過(guò)步驟2)純化后的樣品體積為破乳后水相的1/10(即0.5ml)，即濃度提高10倍，進(jìn)行電泳后染色，分析其條帶，與其理論分子量進(jìn)行對(duì)比，抗原條帶出現(xiàn)在理論分子量大小區(qū)域，可對(duì)其初步定性，由條帶灰度值可知其蛋白量約為10-15ug，上樣量為10ul樣品，其上樣樣品濃度為1-1.5mg/ml，折算其濃縮倍數(shù)(除以10)及破乳后體積變化(除以2)原始濃度為50-75ug/ml，與液相色譜測(cè)得濃度71.7ug/ml結(jié)果相符。
對(duì)比例1
本對(duì)比例提供了一種口蹄疫疫苗的破乳方法，與實(shí)施例1的方法基本相同，不同之處僅在于：本對(duì)比例中不加入競(jìng)爭(zhēng)劑。
采用本對(duì)比例的方法對(duì)口蹄疫疫苗進(jìn)行破乳，該對(duì)比例采用正丁醇破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測(cè)圖譜如圖1所示，從該圖中可看出，在抗原理論保留時(shí)間(23-28min)內(nèi)并未檢出抗原，說(shuō)明樣品中含有的抗原量極低，即本對(duì)比例中的抗原回收率基本為零，其破乳效率基本為零，破乳效率為0％。進(jìn)行ZIPTIP純化后，進(jìn)行定性定量檢測(cè)，無(wú)法獲得目標(biāo)蛋白條帶。
對(duì)比例與實(shí)施例的結(jié)果說(shuō)明，合成肽疫苗使用傳統(tǒng)的正丁醇破乳方法并不能使得抗原分布于水相中，水相中能檢測(cè)到的抗原量極低，并不能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，而加入競(jìng)爭(zhēng)劑后破乳后水相中抗原量達(dá)到85％以上，足夠滿(mǎn)足后續(xù)純化檢測(cè)要求。
本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。