本發(fā)明涉及一種豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)效力的抗體檢驗(yàn)方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬瘟(slassicalswinefever，CFS)以出血和發(fā)熱為主要特征，呈急性或慢性經(jīng)過，是一種對(duì)豬危害性極大的傳染病，被國際獸疫局列為A類動(dòng)物傳染病。在世界許多國家和地區(qū)，傳統(tǒng)疫苗接種是控制豬瘟的重要手段。目前使用的弱毒疫苗主要是中國豬瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法國的Thireval疫苗。20世紀(jì)70年代后期，豬瘟的流行形式發(fā)生了很大變化。地區(qū)散發(fā)性流行及非典型豬瘟癥狀的發(fā)生，特別是近年來國內(nèi)外應(yīng)用單克隆抗體對(duì)C-株檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)有不同的反應(yīng)模式，豬瘟免疫屢屢失敗等，表明豬瘟病毒的抗原性可能存在著變異，從而使有人對(duì)傳統(tǒng)弱毒疫苗提出了質(zhì)疑。隨著傳代次數(shù)的增加和對(duì)不同細(xì)胞的適應(yīng)性繁殖，疫苗毒株可能發(fā)生異質(zhì)性或抗原漂移加之?dāng)?shù)十年來CSFV在大規(guī)模免疫接種壓力下可能出現(xiàn)抗原變異。這些情況都表明，現(xiàn)有的傳統(tǒng)疫苗已不能適應(yīng)新形勢(shì)的需要，研究和開發(fā)新型豬瘟疫苗機(jī)是大勢(shì)所趨。分子生物學(xué)技術(shù)的興起和發(fā)展，為新型豬瘟疫苗的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)?；蛉笔醵疽呙纭唵挝灰呙绾突钶d體疫苗是目前研究的熱點(diǎn)。豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗屬于滅活疫苗，除采用靶動(dòng)物(豬)進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)方法外，目前還沒有可用的替代方法，由于采用靶動(dòng)物(豬)進(jìn)行免疫攻毒的方法檢測周期長(51日)，飼養(yǎng)和檢驗(yàn)成本高，檢驗(yàn)過程中涉及使用豬瘟強(qiáng)毒，為解決以上問題，急需建立可行的有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物效力檢驗(yàn)方法用于滅活疫苗的效力檢驗(yàn)，能夠縮短檢測周期，節(jié)約檢測成本，提高生物安全。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法，可替代常規(guī)的用豬進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有亞單位疫苗效力檢驗(yàn)的空白。本發(fā)明檢驗(yàn)方法，包括如下的步驟：1)取健康的易感家兔作為檢驗(yàn)對(duì)象，按照體重、性別隨機(jī)分為對(duì)照組和免疫組，免疫組至少設(shè)有2個(gè)平行組；所述的易感家兔，為豬瘟病毒ELISA抗體為陰性的家兔；2)對(duì)免疫組家兔注射待檢測的豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)，而對(duì)照組的家兔不注射；注射疫苗的家兔和對(duì)照組的家兔按照正常飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)；3)在步驟2)注射疫苗21日后，對(duì)免疫組和對(duì)照組的家兔均進(jìn)行心臟采血，血液經(jīng)過離心后取上清液，分別檢測豬瘟ELSIA抗體，抗體為陽性則證明豬瘟基因工程亞單位疫苗達(dá)到保護(hù)作用。優(yōu)選的，步驟1)中，所述的對(duì)照組不設(shè)平行組；所述的免疫組設(shè)有平行組，每個(gè)平行組設(shè)立的家兔只數(shù)與對(duì)照組相同。優(yōu)選的，步驟2)中，所述的豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗的注射方式為皮下靜脈注射，注射部位為家兔的頸部。優(yōu)選的，步驟2)中，所述的豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗的注射劑量為0.2ml/只。優(yōu)選的，步驟3)中，離心時(shí)的速度為7000r/min，離心時(shí)間為10分鐘。根據(jù)本發(fā)明方法判定，對(duì)照組家兔豬瘟ELSIA抗體均為陰性，而免疫組的家兔，豬瘟ELSIA抗體為陽性的比率至少為80％。本發(fā)明的豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗效力檢驗(yàn)方法，可替代用豬進(jìn)行免疫攻毒的效力檢驗(yàn)，由于檢驗(yàn)動(dòng)物家兔易獲得，節(jié)約檢驗(yàn)成本，檢驗(yàn)周期短，不涉及用豬瘟強(qiáng)毒攻擊，生物安全性高。具體實(shí)施方式本發(fā)明采用健康易感家兔免疫豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗(293T-E2)，免疫后采血檢測豬瘟病毒ELISA抗體，通過抗體陰陽性判定疫苗的免疫效果。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1：一種豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)效力檢驗(yàn)方法包括以下步驟：(1)取20只健康的易感家兔(豬瘟病毒ELISA抗體為陰性的家兔)作為檢驗(yàn)對(duì)象，按照體重、性別隨機(jī)分為4組，每組5只；3組為免疫組，1組為對(duì)照組；(2)對(duì)免疫組家兔進(jìn)行注射，3組分別注射0.1ml、0.2ml、0.5ml的豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)，而對(duì)照組的家兔不注射任何物質(zhì)；注射疫苗的家兔和對(duì)照組的家兔按照正常飼養(yǎng)方式飼養(yǎng)；(3)步驟(2)注射疫苗21日后，對(duì)免疫組和對(duì)照組的家兔均進(jìn)行心臟采血，心臟血分別以7000r/min離心10min后取上清液，分別檢測豬瘟ELSIA抗體(按照IDEXX公司生產(chǎn)的豬瘟病毒抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測時(shí)間為4小時(shí))，抗體為陽性則證明豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表1所示：表1：抗體檢測注：阻斷率≥40％為陽性(+)；30％＜阻斷率＜40％為可疑(±)；阻斷率≤30％為陰性(-)。由表1可知，家兔注射豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)后，能夠產(chǎn)生特異性的抗體，以0.1ml/只劑量免疫，抗體阻斷率在10.3-71.0％之間，抗體陽性率為80％，以0.2ml/只、0.5ml/只劑量免疫，抗體阻斷率在64.9-81.8％之間，抗體陽性率均為100％，對(duì)照組抗體阻斷率在2.8-12.4％之間，抗體均為陰性，由此可見豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)對(duì)家兔的最小免疫劑量為0.1ml/只，在進(jìn)行疫苗的效力檢驗(yàn)時(shí)，使用劑量定為最小免疫劑量的2倍，即0.2ml/只。實(shí)施例2：抗體檢測與攻毒保護(hù)相關(guān)性檢測：實(shí)施例1中，免疫組和對(duì)照組的家兔進(jìn)行心臟采血后，每只家兔進(jìn)行耳部靜脈注射豬瘟活疫苗(脾淋源)，1.0ml/只；注射豬瘟活疫苗(脾淋源)的前兩日每日測量一次體溫，注射后每6小時(shí)測溫一次，共測72小時(shí)；注射前后家兔體溫變化不超過1℃時(shí)判定為達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表2所示：表2：攻毒保護(hù)分組動(dòng)物種類動(dòng)物數(shù)量保護(hù)率不保護(hù)率免疫組1(0.1ml/只)家兔5只80％20％免疫組2(0.5ml/只)家兔5只100％0％免疫組3(1.0ml/只)家兔5只100％0％對(duì)照組家兔5只0％100％由表2可知，家兔注射豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)后，再用豬瘟毒(豬瘟脾淋源活疫苗中的豬瘟兔化弱毒株)攻擊，可以達(dá)到保護(hù)作用，此外，抗體檢測與攻毒保護(hù)具有很好的相關(guān)性。實(shí)施例3：本發(fā)明檢驗(yàn)方法應(yīng)用及與靶動(dòng)物檢驗(yàn)對(duì)比取豬體重1.5～3.0kg健康易感(瘟病毒ELISA抗體均為陰性)家兔20只，隨機(jī)分成4組，每組5只，1-3組各頸部皮下注射201401、201402、201403批豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)，0.2ml/只，第4組為對(duì)照組。免后21日，所有家兔心臟采血，7000r/min離心10分鐘，吸取上清檢測豬瘟ELSIA抗體；抗體為陽性則證明豬瘟基因工程亞單位疫苗(293T-E2)達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表3所示：表3：抗體檢測注：阻斷率≥40％為陽性(+)；30％＜阻斷率＜40％為可疑(±)；阻斷率≤30％為陰性(-)。取豬健康易感(瘟病毒PCR檢測陰性，ELISA抗體為陰性)30-60日齡豬20頭，隨機(jī)分成4組，每組5頭，1-3組為免疫組、各頸部肌肉注射1.0ml豬瘟病毒基因工程亞單位疫苗，第4組為對(duì)照組。免后28日，所有豬注射豬瘟病毒石門系強(qiáng)毒1.0ml/頭。攻毒后日測溫兩次，共測16日，觀察攻毒豬的臨床表現(xiàn)(眼結(jié)膜炎、食欲廢絕、便秘和腹瀉交替出現(xiàn)、精神沉郁)。根據(jù)攻毒前2日及攻毒后測溫和臨床觀察綜合判定，體溫變化不超過1℃時(shí)且無臨床表現(xiàn)判定為達(dá)到保護(hù)作用。結(jié)果如表4所示：表4：攻毒豬體溫反應(yīng)、臨床觀察和剖檢統(tǒng)計(jì)表注：“√”表示出現(xiàn)此癥狀或有體溫反應(yīng)；“-”表示無此癥狀或無體溫反應(yīng)。表6：攻毒保護(hù)統(tǒng)計(jì)表分組動(dòng)物種類動(dòng)物數(shù)量保護(hù)率不保護(hù)率免疫組1(1.0ml/頭)30-60日齡豬5頭100％0％免疫組2(1.0ml/頭)30-60日齡豬5頭100％0％免疫組3(1.0ml/頭)30-60日齡豬5頭100％0％對(duì)照組30-60日齡豬5頭0％100％由表3、4、5、6可知，用家兔進(jìn)行抗體檢測，3批疫苗免疫家兔均達(dá)到5/5抗體陽性，而用豬進(jìn)行免疫攻毒結(jié)果表明，3批疫苗免疫豬均5/5保護(hù)，由此可見，兩種方法的檢驗(yàn)結(jié)果是一致的，可以用家兔進(jìn)行抗體檢測可以替代用豬進(jìn)行免疫攻毒。上述實(shí)例只是為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思以及技術(shù)特點(diǎn)，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)該涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3