本發(fā)明涉及一種單核細胞增多癥的快速診斷試劑盒，屬于醫(yī)療檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：單核細胞增多癥(Infectiousmononucleosis)是由EBV病毒(一種接觸傳染性病毒，Epstein-Barrvirus)所致的急性自限性傳染病。其臨床特征為發(fā)熱，咽喉炎，肝脾淋巴結(jié)腫大，外周血淋巴細胞顯著增多并出現(xiàn)異常淋巴細胞，嗜異性凝集試驗陽性，感染后體內(nèi)出現(xiàn)抗EBV抗體；青少年及年輕成年人較易發(fā)生(12到40歲)。單核細胞增多癥潛伏期在4-15天，成人可更長，起病急緩不一。約40％單核細胞增多癥患者有前驅(qū)癥狀，歷時4-5天，如全身不適、乏力、頭痛、惡心、稀便、畏寒等，癥狀較典型，如不及時治療還可能出現(xiàn)心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等并發(fā)癥，因此，對單核細胞增多癥的早期診斷有助于該病的治療，并減少并發(fā)癥帶來的身體傷害。EBV病毒在健康人體中也有存在，因此不適于作為單核細胞增多癥檢測的指標，而其抗體因出現(xiàn)時間早、消失快、靈敏度和特異性高，已被廣泛的應(yīng)用于單核細胞增多癥的早期診斷當中。目前，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測法檢測血清/血漿中的EB抗體最為常用，已有商品化的試劑盒，在敏感性相同(88.3％)的前提下，ELISA法特異性(98.3％)明顯優(yōu)于IEA法(53.2％)。但ELISA法操作復(fù)雜、檢測時間長，需要對待測樣品進行稀釋、溫育、分離、洗滌和顯色等操作，大概需要用兩個小時以上。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種單核細胞增多癥的快速診斷試劑盒，其為在PVC板上順次相互搭接經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記的重組EBV早期抗原的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成的試紙卡。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有銪元素；所述稀土熒光微球的直徑為50-100nm。在本發(fā)明另一個實施方案中，所述吸附熒光微球標記的重組EBV早期抗原的結(jié)合墊通過以下方法制備：1)稀土熒光微球的活化；2)稀土熒光微球標記的重組EBV早期抗原制備：將重組EBV早期抗原與上述活化的稀土熒光微球混合，反應(yīng)過夜；然后加入硼氫化鈉反應(yīng)；離心洗滌3遍，重懸于的pH7.6的100mMTris-HCl緩沖液中(含0.05％疊氮鈉、0.2％OVA(卵清白蛋白)和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?)將玻璃纖維膜浸泡于含0.05％疊氮鈉、1.5％木質(zhì)素磺酸鈉和0.5％OVA的100mMTris-HCl緩沖液中，pH7.6；浸泡，然后取出并烘箱烘干，將玻璃纖維膜置于噴臺上，用微定量噴頭將稀土熒光微球標記的重組EBV早期抗原溶液噴到玻璃纖維膜，即得。在本發(fā)明又一個實施方案中，所述包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備方法如下：用包被稀釋液將鼠抗人IgA單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，然后置于烘箱中烘干。在一個具體實施方案中，所述包被稀釋液為含0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.4。在本發(fā)明又一個實施方案中，所述樣品墊的制備方法如下：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。在本發(fā)明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。所述試劑盒，檢測方法為：1)將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取100μl血清樣本，樣本為全血時吸取150μl樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；3)設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉內(nèi)進行檢測，儀器將顯示出樣品濃度的定量測定結(jié)果。在單核細胞增多癥的快速診斷試劑盒的制備過程中，在噴涂液中添加了木脂素磺酸鈉，其作為表面活性劑時，不僅抗體穩(wěn)定性效果極佳，并且由于其配體作用導(dǎo)致對銪元素?zé)晒馕⑶虬l(fā)光強度隨著時間延長沒有出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。另外，針對重組EBV早期抗原的穩(wěn)定性，在結(jié)合墊制備過程中，添加了少量疊氮鈉及OVA以保證重組EBV早期抗原的穩(wěn)定。具體實施方式還可進一步通過實施例來理解本發(fā)明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認為落入本文中描述的和以下要求保護的本發(fā)明范圍之內(nèi)。實施例1單核細胞增多癥的快速診斷試劑盒的制備吸附熒光微球標記的抗原的結(jié)合墊制備：1)稀土熒光微球的醛基化：取30mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.0的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為10分鐘，最后重懸于200μl的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆谩?)稀土熒光微球標記的重組EBV早期抗原的制備：將5mg的重組EBV早期抗原(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)與上述醛基化的稀土熒光微球溶液混合，4℃反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度15mM，4℃反應(yīng)6小時；然后用50mMpH7.6的Tris-HCl緩沖液，采用離心法洗滌3遍，重懸于200μl的100mMpH7.6的Tris-HCl緩沖液中(含0.05％疊氮鈉、0.2％OVA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?)將玻璃纖維膜浸泡于100mMTris-HCl緩沖液中(含0.05％疊氮鈉、1.5％木質(zhì)素磺酸鈉和0.5％OVA，pH7.6)，4℃浸泡4小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用。將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-JetQuanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的重組EBV早期抗原溶液噴到玻璃纖維膜，37℃烘干4小時，備用。包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備：用包被稀釋液將鼠抗人IgA單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到5mg/ml，膜液量為2μl/cm，將鼠抗人IgM單克隆抗體溶液作為檢測線和將羊抗小鼠IgG抗體作為質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。所述包被稀釋液組成為含0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mMTris-HCl緩沖液，pH7.4。樣品墊的制備：將玻璃纖維膜浸泡于0.25MTris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時。試紙卡的組裝：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。實施例2試紙卡最低檢測限和精密度測試取含量為0.1、0.2、0.5、1和2ng/ml的EB病毒IgM抗體標準品溶液，用試紙卡進行測定。檢測方法：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實施例1制備)，平放；精確吸取100μl標準品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進行檢測。最低檢出限：采用PBS緩沖液作為空白對照，以空白對照2倍熒光強度作為最低檢測濃度，結(jié)果表明：0.1ng/ml標準品平行測定5次的平均熒光強度為12.9；而空白對照的平均熒光強度為3.3。說明試紙卡的靈敏度可達0.1ng/ml。精密度：取1ng/ml的EB病毒IgM抗體標準品；采用實施例1制備試紙卡重復(fù)測定10次，計算CV。結(jié)果表明標準品的CV為2.36％實施例3穩(wěn)定性測試將實施例1制備的試紙卡在37℃環(huán)境下放置3個月，然后按照實施例2的方法測定試劑盒的最低檢出限，并采用1ng/ml的EB病毒IgM抗體標準品對試劑盒進行精密度考察(平行測定10次，計算CV％)，具體結(jié)果如下：對比例1試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加木質(zhì)素磺酸鈉。對比例2試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加疊氮鈉。對比例3試紙卡制備同實施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將OVA替換為等量的BSA。實施例4臨床測試從醫(yī)院收集單核細胞增多癥患者及健康人的血液樣本，采用實施例1試紙卡對樣本進行測定，并且采用相同樣本通過ELISA方法進行測定，結(jié)果見下表：實施例1ELISA陽性59例59例陰性43例43例本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當前第1頁1 2 3