本發(fā)明屬于微小隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微小隱孢子蟲(chóng)的夾心ELISA檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隱孢子蟲(chóng)（Cryptosporidium）是一種重要的人獸共患腸道原蟲(chóng)，其宿主范圍十分廣泛，可感染包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、爬行類、兩棲類和魚(yú)類等多種脊椎動(dòng)物，主要寄生于宿主胃腸道上皮細(xì)胞內(nèi)。隱孢子蟲(chóng)多通過(guò)受污染的水源和食物等途徑傳播，由其感染可導(dǎo)致以腹瀉為主要臨床癥狀的人獸共患寄生蟲(chóng)病。目前，31個(gè)物種被認(rèn)為是有效的，其中，微小隱孢子蟲(chóng)（C.parvum）是最常見(jiàn)的人獸共患蟲(chóng)種之一，主要引起未斷奶犢牛嚴(yán)重腹瀉甚至死亡，并可導(dǎo)致包括人在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物腹瀉。免疫功能健全的宿主感染隱孢子蟲(chóng)后一般表現(xiàn)為自限性的短期急性腹瀉；而免疫力低下、免疫功能缺陷或抑制者則通常表現(xiàn)為持久的水樣腹瀉，導(dǎo)致體液大量丟失而危及生命。在艾滋病病人和兒童中感染率分別高達(dá)48%和17.5%，是艾滋病病人的重要致死因素。該病已被確認(rèn)為引起人腹瀉的六大病因之一，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國(guó)疾病防控中心（CDC）列入新發(fā)傳染病。

隱孢子蟲(chóng)病作為一種重要的人獸共患性原蟲(chóng)病，很常見(jiàn)但很難治療，目前尚無(wú)有效的治療方法，并且其檢出率也比較低。關(guān)于免疫學(xué)檢測(cè)法主要有免疫熒光技術(shù)、酶免疫分析法、免疫印跡法、免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞儀技術(shù)和間接血凝試驗(yàn)等，因特異性高、敏感性強(qiáng)，便于批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于隱孢子蟲(chóng)病診斷中，但是這些方法對(duì)于隱孢子蟲(chóng)的檢出率比較低，因此建立簡(jiǎn)便、特異、敏感的免疫學(xué)診斷技術(shù)，對(duì)于人和動(dòng)物隱孢子蟲(chóng)病的防控具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)當(dāng)前糞便檢測(cè)隱孢子蟲(chóng)靈敏度低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種微小隱孢子蟲(chóng)的夾心ELISA檢測(cè)方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是以下述方式實(shí)現(xiàn)的：

一種微小隱孢子蟲(chóng)的夾心ELISA檢測(cè)方法，具體步驟如下：

（1）將微小隱孢子蟲(chóng)卵囊反復(fù)凍融和超聲波裂解后，離心，上清液作為檢測(cè)性抗原，沉淀作為免疫性抗原；

（2）用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制備兔抗微小隱孢子蟲(chóng)血清抗體IgG，并用鹽析法純化IgG；

（3）用免疫性抗原免疫健康產(chǎn)蛋雞，制備抗微小隱孢子蟲(chóng)卵黃抗體IgY，并用水稀釋硫酸銨鹽析法純化IgY；

（4）以IgG為捕獲抗體，IgY為檢測(cè)抗體的夾心ELISA檢測(cè)步驟：

a. IgG包被：用包被液將純化后的IgG稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃下包被1 h后，4℃下過(guò)夜，棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

b. 封閉：每孔加200μL封閉液，37℃下封閉1h后，棄去封閉液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

c. 加抗原：將步驟（1）制備的檢測(cè)性抗原用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下反應(yīng)lh后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

d. 加IgY：將IgY用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

e. 加酶標(biāo)抗體：加用0.01M PBS稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗雞的酶標(biāo)抗體，100 μL/孔，37℃下作用45min后，甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干；

f. 加底物顯色：加TMB顯色液，100μL/孔，室溫避光作用10 min；

g. 終止反應(yīng)：加入終止液，50μL/孔，用酶標(biāo)儀測(cè)OD₄₅₀值，計(jì)算出P/N值，P/N=（待檢樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值）/（陰性樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值），若P/N≥2.1，判為陽(yáng)性，若P/N< 2.1，判為陰性。

步驟（1）中所述微小隱孢子蟲(chóng)卵囊為用微小隱孢子蟲(chóng)感染犢牛進(jìn)行傳代，大量收集糞便并純化后獲得的卵囊。

所述步驟（4）中的c步驟中，檢測(cè)性抗原稀釋后的濃度為2.5μg/mL。

所述步驟（4）中的a步驟中，用包被液將純化后的IgG稀釋800倍。

所述步驟（4）中的d步驟中，將IgY稀釋100倍。

所述步驟（4）中的e步驟中，HRP標(biāo)記的羊抗雞的酶標(biāo)抗體稀釋5000倍。

所述步驟（4）中，包被液由無(wú)水碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，加蒸餾水定容至1000mL而得；

洗滌液由氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，吐溫-20 0.5mL，加蒸餾水1000mL而得；

封閉液由牛血清蛋白1g，加包被液100mL而得；

終止液由濃硫酸11.1mL，加蒸餾水88.9mL而得；

PBS由NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄·12H₂O 2.9g，加蒸餾水定容至1000mL而得。

如上述的微小隱孢子蟲(chóng)的夾心ELISA檢測(cè)方法在檢測(cè)待檢測(cè)糞便中微小隱孢子蟲(chóng)中的應(yīng)用，所述待檢測(cè)糞便先用飽和蔗糖溶液漂浮法進(jìn)行處理，再反復(fù)凍融和超聲波裂解后，離心，得到的上清液作為檢測(cè)性抗原使用，再用所述步驟（4）中的夾心ELISA方法對(duì)檢測(cè)性抗原進(jìn)行檢測(cè)，以確定待檢測(cè)糞便中是否已感染微小隱孢子蟲(chóng)。

本發(fā)明相對(duì)于巢式PCR方法，有著耗材少，成本低，操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)時(shí)間短，更適用于大量臨床樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明只需要封閉液、底物溶液、PBS溶液等，這些試劑價(jià)格較低，試驗(yàn)時(shí)只需用到酶標(biāo)儀；而常規(guī)的PCR所需試劑如表8，價(jià)格較貴，花費(fèi)高，試驗(yàn)時(shí)要用到振蕩器，瞬時(shí)離心機(jī)，PCR儀器等，耗材多；檢測(cè)樣品時(shí)，本發(fā)明可以用八道手動(dòng)移液器，一次性加8個(gè)樣品，而且檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)間大約為3個(gè)半小時(shí)；而常規(guī)的PCR只能用微量移液器，一次性加1個(gè)樣品，且試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6個(gè)小時(shí)左右；如果一個(gè)地方發(fā)生了微小隱孢子蟲(chóng)病情，用本發(fā)明提供的檢測(cè)方法檢測(cè)的話只需帶上ELISA用試劑和酶標(biāo)儀即可，但是用常規(guī)的PCR的話除了要帶去要用的各種試劑，還要帶振蕩器、瞬時(shí)離心機(jī)、PCR儀等儀器，所以本發(fā)明更適用于大量樣品的臨床檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1是敏感性試驗(yàn)結(jié)果。

圖2是批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。

圖3是批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果。

圖4是巢式PCR方法的檢測(cè)結(jié)果，M：DL2000；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：空白對(duì)照。83：83號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；84：84號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；85：85號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；86：86號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；101：101號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；102：102號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物；103：103號(hào)樣品DNA PCR產(chǎn)物。

圖5是第一組樣品的夾心ELISA的檢測(cè)結(jié)果。

圖6是第二組樣品的夾心ELISA的檢測(cè)結(jié)果。

圖7是第三組樣品的夾心ELISA的檢測(cè)結(jié)果。

圖8是巢式PCR方法的反應(yīng)程序。

圖9是抗原最佳稀釋度的確定。

圖10是IgY最佳反應(yīng)時(shí)間的確定。

圖11是最佳酶標(biāo)抗體工作濃度的選擇。

圖12是酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間的確定。

圖13是最佳顯色時(shí)間的確定。

具體實(shí)施方式

包被液由無(wú)水碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，加蒸餾水定容至1000mL而得；

洗滌液，即PBST，由氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，吐溫-20 0.5mL，加蒸餾水1000mL而得；

封閉液由牛血清蛋白1g，加包被液100mL而得；

終止液由濃硫酸11.1mL，加蒸餾水88.9mL而得；

PBS由NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄·12H₂O 2.9g，加蒸餾水定容至1000mL而得；

TMB顯色液：

Buffer A：稱取66.5063g檸檬酸鉀，用800mL四蒸水溶解并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0， 加入314μL H₂O₂，用水定容至1L，4℃保存；

Buffer B：稱取0.2956g四甲基聯(lián)苯胺（TMB），0.0633g四丁基硼氫化銨（TBABH） 溶于30mL二甲基乙酰胺（DMA），4℃避光保存；

使用時(shí)，將Buffer A和Buffer B以體積比39：1的比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

一、 卵囊的傳代和收集

試驗(yàn)犢牛飼養(yǎng)于經(jīng)甲醛-高錳酸鉀熏蒸消毒后，又用汽油火焰噴燈消毒的不銹鋼籠中。每天飼喂鮮牛奶3次，每次2000 mL。飼喂到第3d時(shí)用飽和蔗糖漂浮法處理糞便，顯微鏡檢查犢牛糞便，隱孢子蟲(chóng)卵囊均為陰性。于3日齡感染純化的微小隱孢子蟲(chóng)卵囊，本試驗(yàn)將感染劑量調(diào)整為1.0×10⁷個(gè)。接種卵囊后，每天采集糞便，鏡檢犢牛糞便是否呈陽(yáng)性。待檢出犢牛糞便呈C. parvum陽(yáng)性糞便，收集排卵高峰期糞便，7天左右，大量純化卵囊備用。

二、 檢測(cè)性抗原和免疫性抗原的制備

將提純后的卵囊置液氮-196℃和水浴鍋37℃反復(fù)凍融5次，超聲波細(xì)胞粉碎儀100HZ 2min×5次破碎后，10000r/min離心15min，其中，上清作為檢測(cè)性抗原，沉淀作為免疫性抗原。紫外分光光度計(jì)測(cè)檢測(cè)性抗原的蛋白含量為1.734mg/mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、家兔的免疫過(guò)程和血清的采集和分離

免疫過(guò)程：選擇4只隱孢子蟲(chóng)檢測(cè)為陰性的健康成年兔作為試驗(yàn)兔，其中2只不免疫作為對(duì)照組。制定免疫程序和劑量，采取長(zhǎng)期多次免疫法，制備兔抗C.parvum高免血清。

（1）首免，抗原含量3×10⁷個(gè)/只，抗原與等體積油佐劑充分乳化后，背部、頸部皮下多點(diǎn)注射；

（2）二免，14d后將抗原與等體積油佐劑乳化后二免，2×10⁷個(gè)/只；背部、頸部皮下多點(diǎn)注射；

（3）三免，14d后按照二免的方法進(jìn)行三免，2×10⁷個(gè)/只；背部、頸部皮下多點(diǎn)注射；

（4）四免，7天后用抗原液腹腔注射加強(qiáng)免疫，1.2×10⁷個(gè)/只。

血清的采集：（1）第三次加強(qiáng)免疫注射后7天，從兔子的耳緣靜脈處進(jìn)行采血。讓家兔充分運(yùn)動(dòng)，這樣會(huì)使血流加速，血管充盈，方便采血，將耳緣靜脈附近的毛剪去用無(wú)菌棉球?qū)⑵つw擦干凈，用1mL注射器抽取血液，分離血清以備檢測(cè)。

（2）第四次加強(qiáng)免疫后7天、14天，先進(jìn)行耳緣靜脈采血，間接ELISA法測(cè)血清效價(jià)，抗體水平達(dá)到最大值不再變化，此時(shí)一次性心臟采血，2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30mL。動(dòng)物于仰臥位固定，用食指探明心臟博動(dòng)量高部位，在胸骨左側(cè)，由下向上數(shù)第3與第4助骨之間，剪去少許毛，用2.5%碘酒和75%酒精消毒后，在預(yù)定位置與胸部呈45度角刺入心臟，微微上下移動(dòng)針頭，待見(jiàn)血液進(jìn)入針筒后，即將注射器位置固定取血。

血清的分離：將采集好的新鮮兔血呈45-60度角在室溫下37℃恒溫箱靜置1h, 將血液移到合適的離心管中，用低速離心機(jī)5000r/min離心3-5min，用無(wú)菌玻璃吸管吸取上層淡黃色液體即為血清。

四、產(chǎn)蛋雞的免疫過(guò)程和雞蛋的收集

免疫過(guò)程：從鄭州市某養(yǎng)雞場(chǎng)選擇并購(gòu)買(mǎi)8只120日齡開(kāi)產(chǎn)健康海蘭蛋雞，將這些蛋雞單獨(dú)隔離喂養(yǎng)，給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料和日常管理，隨機(jī)分組，4只用于實(shí)驗(yàn)組，4只用于對(duì)照組。

（1）首免，免疫抗原加等體積油佐劑，抗原含量為1×10⁷個(gè)卵囊/只，翅根部皮下及胸部肌肉多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫；

（2）二免，14d后二免，抗原含量為2×10⁷個(gè)卵囊/只，免疫部位同（1）；

（3）三免，14d后三免，抗原含量為2.5×10⁷個(gè)卵囊/只，免疫部位同（1）。

雞蛋的收集：收集免疫前雞蛋，作為陰性對(duì)照；三免后收集雞蛋，提取并純化卵黃抗體，測(cè)其效價(jià)。

五、兔抗微小隱孢子蟲(chóng)血清抗體IgG的純化

用鹽析法純化IgG，步驟如下：

（1）取20ml的血清，加入同等體積的生理鹽水，緩慢滴加飽和硫酸銨溶液10ml至終濃度為20%，邊加邊攪拌，充分混勻后靜止30min；

（2）4℃ 3000r/min 離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白；

（3）在上清里加入飽和硫酸銨溶液30ml至終濃度為50%，邊加邊攪拌，充分混勻后靜止30min；

（4）4℃ 3000r/min 離心20min，棄去上清；

（5）于沉淀中加入20ml生理鹽水，使之溶解，再緩慢滴加飽和硫酸銨溶液10ml至終濃度為33%，充分混勻后，靜止30min；

（6）4℃ 3000r/min 離心20min，棄去上清，以除去白蛋白，重復(fù)步驟5, 2-3次；

（7）用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋；透析除鹽，在三蒸水中透析過(guò)夜，再在0.1M，PH=7.4的生理鹽水中透析24h，中間換液數(shù)次；

（8）離心去沉淀，上清即為提取的IgG。

六、抗微小隱孢子蟲(chóng)卵黃抗體IgY的純化

采用水稀釋硫酸銨鹽析法提取，將蛋殼用碘酊擦拭消毒，75%酒精脫碘。蛋黃分離器分離蛋黃，將蛋黃在滅菌濾紙上輕輕滾動(dòng)，盡量除去卵黃膜。

（1）測(cè)量蛋黃體積，加入9倍體積4℃滅菌蒸餾水稀釋，攪拌均勻，調(diào)節(jié)PH值至5.0-5.5間，4℃靜置過(guò)夜，4℃，l0000 r·min^-1，離心30 min，收集上清液得到粗提物即WSF(水溶性片段water-soluble fraction)；

（2）過(guò)濾去除沉淀及漂浮物，滴加等體積飽和硫酸銨溶液使其飽和度達(dá)50%，4℃靜置4 h，4℃，l0000 r·min^-1，離心30 min棄上清；

（3）用0.9%生理鹽水溶解后滴加飽和硫酸銨溶液使其飽和度達(dá)33%，4℃靜置4 h后，4℃，10000 r·min^-1，離心30 min棄上清；

（4）用原1/2體積0.01 mol/L無(wú)菌PBS溶解沉淀，0.9%生理鹽水溶液透析去鹽，期間換透析液3次，過(guò)濾除菌，即為提取的卵黃抗體，如果長(zhǎng)期保存，置-20℃凍存。

七、純化后的IgG和IgY的效價(jià)的測(cè)定方法

（1）包被抗原（放于濕盒內(nèi)，4℃包被過(guò)夜）：選取96孔可拆卸的U型板，用包被液稀釋步驟二中純化好的檢測(cè)性抗原，每孔加100μL；

（2）洗滌：用PBST洗滌3次，300μL每孔，每次靜止3min，棄去清洗液；

（3）加封閉液，200μL每孔37℃孵育1h后；洗滌：用PBST洗滌3次，300μL每孔，每次靜止3min，棄去清洗液。

（4）加一抗：將一抗按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、等依次倍比稀釋；將陰性樣品也按此倍數(shù)稀釋后，每孔100μL，放于濕盒內(nèi)，37℃孵育1.5h（設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔）；

（5）洗滌：用PBST洗滌3次，300μL每孔，每次靜止3min，棄去清洗液；

（6）加酶標(biāo)二抗，37℃ 1h；

（7）洗滌：用PBST洗滌3次，300μL每孔，每次靜止3min，棄去清洗液；

（8）加入底物液，每孔100μL，顯色10-15min，避光；底物A與底物B等體積混合；

（9）終止顯色：加入2moL/L H₂SO₄終止反應(yīng)，每孔50μL；

（10）讀數(shù)：立即用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD₄₅₀值，讀數(shù)。計(jì)算出P/N值，P/N=(待檢樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)／(陰性樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)。若P/N≥2.1，判為陽(yáng)性；若P/N< 2.1，判為陰性。

八、微小隱孢子蟲(chóng)夾心ELISA檢測(cè)方法的建立

以純化過(guò)的IgG為捕獲抗體，以純化過(guò)的IgY為檢測(cè)抗體，按照夾心ELISA的操作流程進(jìn)行各個(gè)最優(yōu)條件的選擇，如表2-4和圖9-13所示，由方陣滴定結(jié)果可知，捕獲抗體IgG包被濃度為1:800，檢測(cè)抗體IgY稀釋度為1:100時(shí)，OD_450nm接近于1.0，且此時(shí)P/N最大，故在ELISA檢測(cè)方法中IgG包被濃度為1:800，被檢樣品的稀釋倍數(shù)為1:200；試驗(yàn)確定抗原最佳稀釋濃度為2.5μg/mL；最佳包被條件為37℃作用1 h后4℃過(guò)夜；最佳封閉條件為1%明膠作為封閉劑37℃封閉1h；IgY最佳作用時(shí)間為37℃孵育30min；酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間為37℃孵育45min，最佳稀釋濃度為1:5000；最佳顯色時(shí)間室溫顯色10min；最佳終止條件為2 mol/L H₂SO₄，每孔50μL。

微小隱孢子蟲(chóng)夾心ELISA檢測(cè)步驟如下：

a. IgG包被：用包被液將純化后的IgG稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃下包被1 h后，4℃下過(guò)夜，棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

b. 封閉：每孔加200μL封閉液，37℃下封閉1h后，棄去封閉液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

c. 加抗原：將步驟（1）制備的檢測(cè)性抗原用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下反應(yīng)lh后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

d. 加IgY：將IgY用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

e. 加酶標(biāo)抗體：加用0.01M PBS稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗雞的酶標(biāo)抗體，100 μL/孔，37℃下作用45min后，甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干；

f. 加底物顯色：加TMB顯色液，100μL/孔，室溫避光作用10 min；

g. 終止反應(yīng)：加入終止液，50μL/孔，用酶標(biāo)儀測(cè)OD₄₅₀值，計(jì)算出P/N值，P/N=（待檢樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值）/（陰性樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值），若P/N≥2.1，判為陽(yáng)性，若P/N< 2.1，判為陰性。

九、檢測(cè)性試驗(yàn)

1、敏感性試驗(yàn)

將微小隱孢子蟲(chóng)抗原從5×10⁵個(gè)/mL開(kāi)始做2倍連續(xù)稀釋至7.5×10³個(gè)/mL，共做7個(gè)稀釋度，其他條件不變，按照已建立的夾心ELISA操作方法測(cè)定OD_450nm值，檢測(cè)其靈敏度。以出現(xiàn)陽(yáng)性的最高稀釋倍數(shù)推算出其最小檢出量，結(jié)果如圖1和表5所示。

將微小隱孢子蟲(chóng)抗原做7個(gè)2倍連續(xù)稀釋，按照已建立的夾心ELISA操作方法測(cè)定OD_450nm值，結(jié)果顯示當(dāng)抗原含量為1.5×10⁴個(gè)/mL時(shí)P/N為3.22，依舊為陽(yáng)性，當(dāng)抗原為7.5×10³個(gè)/mL時(shí)，P/N值為1.04，為陰性。故本方法的最低檢出量為1.5×10⁴個(gè)/mL。

2、特異性試驗(yàn)

對(duì)已知的圓線蟲(chóng)蟲(chóng)卵，球蟲(chóng)卵囊，蛔蟲(chóng)蟲(chóng)卵作為抗原作1:100稀釋，同時(shí)設(shè)微小隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，每份樣品重復(fù)4孔，然后應(yīng)用本試驗(yàn)建立的夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。除陽(yáng)性對(duì)照外，結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該夾心ELISA方法具有良好的特異性，結(jié)果如表6所示。

3、重復(fù)性試驗(yàn)

以批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)夾心ELISA方法的重復(fù)性，隨機(jī)選取3份樣本在不同時(shí)間、相同條件下重復(fù)做夾心ELISA測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次，按照已建立的夾心ELISA操作程序測(cè)定，計(jì)算同一份樣本OD_450nm值的變異系數(shù)，比較試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果如圖2, 3和表7所示，隨機(jī)選取3份樣本批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)在3.88%和8.12%之間，均小于10%，說(shuō)明此檢測(cè)方法重復(fù)性好。

十、已經(jīng)建立的夾心ELISA法檢測(cè)微小隱孢子蟲(chóng)的應(yīng)用

1. 樣品的采集和處理

從長(zhǎng)春某養(yǎng)殖場(chǎng)采集豬的糞便樣品，共108份。取每份糞樣5-10g, 加適量自來(lái)水, 攪勻, 銅篩過(guò)濾，濾液置離心管中以 3000r/min離心10min，棄去上清。

將上述處理好的糞便樣品分四組，分別為一、二、三、四組，每組27份，每份樣品均進(jìn)行人工植入卵囊。第一組用飽和食鹽水漂浮法處理，第二組用飽和蔗糖溶液漂浮法，第三組用洗滌劑PBST洗滌處理，第四組不再進(jìn)行處理直接提取DNA，基于18S擴(kuò)PCR，電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

第一組對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，分別標(biāo)記為1，2，3....27號(hào)，1到19植入濃度從10萬(wàn)個(gè)卵囊/mL開(kāi)始倍比稀釋感染15個(gè)梯度，即10萬(wàn)，5萬(wàn)，2.5萬(wàn)…到0個(gè)卵囊/mL；21到27植入濃度依次為10⁵，10⁴，10³，10² ，10 ¹，10 ⁰ ,10 ^-1個(gè)卵囊/mL。

第二組對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，分別標(biāo)記為28，29，30....54號(hào)，植入卵囊量同第一組，28到46號(hào)同第一組1到19號(hào)的卵囊植入量；47到54號(hào)同第一組21到27號(hào)的卵囊植入量；

第三組對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，分別標(biāo)記為55，56，57....81號(hào)，植入卵囊量同第一組，55到73號(hào)同第一組1到19號(hào)的卵囊植入量；74到81號(hào)同第一組21到27號(hào)的卵囊植入量；

第四組對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，分別標(biāo)記為82，83，48....108號(hào)，植入卵囊量同第一組，82到100號(hào)同第一組1到19號(hào)的卵囊植入量；101到108號(hào)同第一組21到27號(hào)的卵囊植入量。

第一組至第三組處理方法如下：

第一組的處理方法：飽和食鹽水漂浮法，步驟如下：

（1）每份樣品取5mL-6mL處理過(guò)的糞便，加水稀釋，離心10min，棄上清；

（2）加飽和食鹽水至25mL, 攪拌均勻；

（3）離心10min，用吊環(huán)蘸取10-15下；

（4）重復(fù)步驟（3）；

（5）吊取的液體于10倍的水中稀釋，離心濃縮。

第二組的處理方法：飽和蔗糖溶液漂浮法：步驟如下：

（1）每份樣品取5mL-6mL處理過(guò)的糞便，加水稀釋，離心10min，棄上清；

（2）加飽和蔗糖溶液至35mL, 攪拌均勻

（3）離心10min，用吊環(huán)蘸取10-15下；

（4）重復(fù)步驟（3）；

（5）吊取的液體于10倍的水中稀釋，離心濃縮。

第三組的處理方法：PBST洗滌：步驟如下：

（1）每份樣品取5mL-6mL處理過(guò)的糞便，加水稀釋，離心10min，棄上清；

（2）加PBST至35mL，攪拌均勻；

（3）3000r/min離心10min，棄去上清，沉淀用PBS5倍稀釋。

上述三組共81份處理過(guò)的樣品分別置液氮和水浴鍋37℃反復(fù)凍融5次，超聲波細(xì)胞粉碎儀（100HZ）2min×5次破碎后，10000r/min離心15min，取上清作為檢測(cè)性抗原。

第四組樣品提取DNA，步驟如下：

（1）取50-100 mg處理過(guò)的糞便樣品于2mL離心管中，加入200mg玻璃珠，將離心管置于冰上孵育2 min。

（2）添加300μL SP1 Buffer，然后再加入Proteinase K溶液10μL，震蕩10 min。

（3）將離心管置于70℃恒溫水浴鍋中孵育15 min，期間震蕩3次，每次30s~1min，以充分混勻樣品。

（4）冰上孵育2min。

（5）添加100μL Buffer SP2，震蕩30s，充分混勻樣品。

（6）冰上孵育5min。

（7）15000r·min^-1離心5min。

（8）小心吸取上清液至1.5mL離心管中，不要觸碰沉淀和雜質(zhì)。

（9）添加200μL HTR Reagent，震蕩10s，混勻樣品，HTR Reagent用之前必須充分震蕩混勻。

（10）室溫孵育2min。

（11）15000r·min^-1離心2min。

（12）吸取250μL上清液至新的2.0mL離心管中。

（13）添加250μL BL Buffer，然后再加入250μL無(wú)水乙醇，震蕩10s。

（14）將第13步的樣品全部移入到一個(gè)HiBind DNA柱中，直接倒入，將HiBind DNA柱安裝在一個(gè)2mL的集合管中，15000r·min^-1離心1min，棄掉集合管及廢液。

（15）將HiBind DNA柱置于新的集合管中，使用500μL HB Buffer清洗HiBind DNA柱子，15000r·min^-1離心1min，棄掉集合管及廢液。

（16）再將HiBind DNA柱子置于新的集合管中，添加750μL DNA Wash Buffer，15000r·min^-1離心1min，棄掉集合管及廢液。

（17）將HiBind DNA柱安裝到新的集合管中，15000r·min^-1離心2min，以干燥柱子。

（18）將HiBind DNA柱子置于新的1.5mL離心管中，在70℃條件下預(yù)熱Elution Buffer，添加200μL Elution Buffer以洗脫DNA，室溫下浸泡2min，15000r·min^-1離心1min，收集DNA。

2. 處理后的樣品中微小隱孢子蟲(chóng)的檢測(cè)

用步驟八中建立的夾心ELISA法檢測(cè)已經(jīng)處理好的第一、二、三組的81份樣品，第一組樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，共檢測(cè)出6份陽(yáng)性樣品；第二組樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，共檢測(cè)出7份樣品；第三組樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，共檢測(cè)出4份陽(yáng)性樣品。

第4組提取好的DNA樣品基于18SrRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增18SrRNA序列的引物：

18S1：TTCTAGAGCTAATACATGCG

18S2：CCCATTTCCTTCGAAACAGGA

18S3：GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG

18S4：CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA

PCR反應(yīng)程序，如圖8所示：

第一次反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；然后35個(gè)循環(huán)，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；最后72℃延伸10min；最后溫度降到10℃。

第二次反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；然后35個(gè)循環(huán)，94℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；最后72℃延伸10min；最后溫度降到10℃。

進(jìn)行PCR反應(yīng)前，將反應(yīng)液混合，短暫離心后，置2720Thermal Cycler PCR儀，按程序作熱循環(huán)反應(yīng)，結(jié)束后樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

PCR反應(yīng)體系如表8所示。

基于18s rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，用巢式PCR方法共檢測(cè)出8份陽(yáng)性樣品。

上述三種處理方法的檢測(cè)結(jié)果與巢式PCR結(jié)果比較如表9所示，用巢式ＰＣＲ共檢測(cè)出８份陽(yáng)性樣品，三種對(duì)糞便樣品的不同處理方法（飽和蔗糖溶液漂浮法、飽和食鹽水溶液漂浮法和PBST洗滌液處理）用建立的夾心ELISA方法分別檢測(cè)出7份，6份和4份樣品，與巢式PCR擴(kuò)增方法的總符合率分別為95.83%、91.67%和83.33%。由此可知，飽和蔗糖溶液漂浮法處理糞便樣品的方法效果更佳，進(jìn)而用建立好的夾心ELISA檢測(cè)樣品。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。