專利名稱：微小隱孢子蟲Th多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微小隱孢子蟲Th多表位基因和融 合蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是一種世界性分布的人獸共患寄生蟲病，該病 在免疫功能正常的機體中，可引起自限性腹瀉；在免疫功能缺陷患者如艾滋病(AIDS)病人 中，可導致嚴重甚至威脅生命的疾病。該病已被列為世界最常見的6種腹瀉病之一，并被世 界衛(wèi)生組織和美國疾病控制與預(yù)防中心列入新發(fā)傳染病。目前對該病尚無特效藥物，絕大 多數(shù)抗生素、抗寄生蟲藥物均無效，因此隱孢子蟲病的免疫預(yù)防和治療就顯得愈發(fā)重要。在以往的隱孢子蟲疫苗研究中，人們通常在重組疫苗中編碼一個全長的隱孢子蟲 抗原蛋白。但是，此類單一的疫苗候選分子的免疫保護效果并不理想，其原因可能是隱孢子 蟲基因組巨大，生活史復(fù)雜，抗原種類繁多，單一的抗原無法徹底阻斷病原在宿主體內(nèi)的生 活周期，導致單一抗原、單一表位的免疫保護效果不夠理想?？紤]使用多抗原疫苗時，由于 載體容量有限，并且大分子蛋白可能會造成動物免疫病理反應(yīng)，所以在單一載體中加入多 個抗原存在很大的局限性。近年來，國際寄生蟲學界開始嘗試利用抗原表位預(yù)測工具進行 抗原表位預(yù)測，構(gòu)建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)，來預(yù)防和控制寄生蟲病，并取 得了階段性成果，尤其在抗瘧疾多表位疫苗研制領(lǐng)域，已設(shè)計合成了多個基因工程疫苗和 合成肽疫苗，取得了較好的免疫保護效果，其中不少已進入II期或III期臨床試驗。在隱孢子 蟲領(lǐng)域目前尚無這方面的報道。多數(shù)研究結(jié)果顯示，⑶4+輔助性T細胞(helper T cell，Th)在抗隱孢子 蟲感染中發(fā)揮著極其重要的作用。Agu i rr e觀察到主要組織相容性復(fù)合體II (ma j οr histocompatibility complex II，MHC II)類分子缺失導致缺乏CD4+ T細胞的小鼠很難控 制微小隱孢子蟲(化雙如· - poridium parra )感染；陳淑蘭等檢測隱孢子蟲病患者外周血 中⑶4+ T細胞及⑶4/⑶8細胞比值，發(fā)現(xiàn)⑶4+ T細胞極顯著低于正常對照組，而⑶8+ T細 胞反而升高，致使⑶4/⑶8比值顯著降低；Ungar曾報道選擇性地耗竭輔助性T細胞(⑶4+ T細胞)會延長小鼠隱孢子蟲感染，證明CD4+ T細胞對于機體清除隱孢子蟲感染至關(guān)重要。 在對人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)陽性病人的研究中也進一 步證實了抗隱孢子蟲感染中CD4+ T細胞的必要性。Flanigan認為艾滋病增加了患者對微 小隱孢子蟲的易感性，最嚴重的情況通常見于CD4+ T細胞數(shù)量最少的個體；Riggs也證實在 艾滋病患者或別的細胞免疫缺陷患者，控制微小隱孢子蟲感染的能力和CD4+ T細胞數(shù)量直 接相關(guān)；Schmidt等用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法治療伴有微小隱孢子蟲感染的HIV陽性病人 時，發(fā)現(xiàn)血循環(huán)和粘膜中CD4+ T細胞增加，粘膜中CD4+ T細胞增加的更多并達到更高水平。鑒于⑶4+ T細胞在隱孢子蟲感染中的重要作用，對隱孢子蟲Th表位進行研究具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決缺少隱孢子蟲多表位疫苗的技術(shù)問題，提供一種微小隱孢子蟲Th 多表位基因和融合蛋白，該Th多表位基因和融合蛋白可用于制備抗隱孢子蟲病的多表位 疫苗。此外，還需要提供一種微小隱孢子蟲Th多表位基因和融合蛋白在制備預(yù)防或治 療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白，其包含SEQ ID NO. 1 10所示Th表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述Th表位序列之間設(shè)有柔性氨基酸組成的接頭序列。在各個Th表位 序列之間加入柔性氨基酸組成的接頭序列，能使各個Th抗原表位在空間上互相獨立，防止 各表位多肽分子由于空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而阻礙其和MHC (主要組織相容性復(fù)合體，具有抗 原呈遞作用)分子的結(jié)合；同時在各個Th表位之間用接頭序列連接，可適當提高免疫肽分 子量，以增強多表位融合蛋白的免疫原性。更優(yōu)選的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種微小隱孢子蟲Th多表位基因，其包含編碼上述 融合蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述微小隱孢子蟲Th多表位基因具有編碼SEQ ID NO. 11所示氨基酸序 列的核苷酸序列。更優(yōu)選的，所述微小隱孢子蟲Th多表位基因具有SEQ ID NO. 12所示的 核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種包含上述微小隱孢子蟲Th多表位基因的重 組載體。所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達載體，重組表達載體包括重組原核表 達載體、重組真核表達載體。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種宿主細胞，該宿主細胞包含上述重組載體，或 已用上述微小隱孢子蟲Th多表位基因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白在制備預(yù) 防或治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將融合蛋白與弗氏不完全和完全佐劑、Montanide ISA 206等充分混 勻制備亞單位疫苗。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種微小隱孢子蟲Th多表位基因在制備預(yù)防或 治療隱孢子蟲病的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，將微小隱孢子蟲Th多表位基因克隆到真核表達載體如pVAXl、 pcDNA3. 1等，或共同插入細胞因子基因，構(gòu)建成核酸疫苗。本發(fā)明微小隱孢子蟲Th多表位基因，經(jīng)原核表達后所得的重組蛋白，通過 Western blot和免疫小鼠血清抗體ELISA檢測結(jié)果顯示，該重組蛋白具有較好的免疫原性 和反應(yīng)原性，同時動物保護性實驗顯示，該重組蛋白制成的亞單位疫苗對小鼠隱孢子蟲感染有較好的免疫保護效果。此外，本發(fā)明構(gòu)建的含微小隱孢子蟲Th多表位基因的重組真核 表達質(zhì)粒，作為核酸疫苗進行動物保護性實驗，結(jié)果表明該重組真核表達質(zhì)粒具有很好的 免疫保護效果。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例3重組原核表達質(zhì)粒pET_28a ( + )_CpThlO的雙酶切鑒定圖； 圖2是本發(fā)明實施例3重組蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖3是本發(fā)明實施例4重組表達產(chǎn)物的Western blot分析圖； 圖4是本發(fā)明實施例5重組真核表達質(zhì)粒pVAX-1-CpThlO的雙酶切鑒定圖； 圖5是本發(fā)明實施例6重組蛋白rCpThlO免疫后小鼠隱孢子蟲卵囊排出曲線圖； 圖6是本發(fā)明實施例6核酸疫苗免疫后小鼠隱孢子蟲卵囊排出曲線圖。
具體實施例方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實驗 指南》(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.第3版，北京科 學出版社，2002)中所述的方法進行。本發(fā)明利用生物信息學軟件和多個表位預(yù)測服務(wù)器，對微小隱孢子蟲 (.Cryptosporidium parvum,C.候選疫苗抗原與宿主 MHC II 類分子 H2_Ad 和 H2_Ed 結(jié)合的表位分別進行預(yù)測，篩選出10個得分較高的Th表位序列以任意順序進行相互串聯(lián)， 形成多表位基因，各表位之間用柔性氨基酸鏈接。將該多表位基因克隆到原核表達載體中 進行原核表達，并對表達的融合蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性進行驗證；將該多表位基因克 隆到真核表達載體中，構(gòu)建核酸疫苗；將原核重組表達蛋白和真核重組表達質(zhì)粒分別免疫 小鼠，觀察亞單位疫苗和核酸疫苗的免疫保護效果。結(jié)果顯示，重組表達蛋白制成的亞單位 疫苗，與PBS空白對照組和佐劑對照組相比，免疫組的排出卵囊數(shù)量減少，開始排出卵囊時 間明顯延后，卵囊排出持續(xù)時間明顯縮短，提示該重組亞單位疫苗對小鼠隱孢子蟲鼠基因 型感染有較好的免疫保護效果。由真核重組表達質(zhì)粒制成的核酸疫苗，免疫小鼠的攻擊感 染試驗結(jié)果表明，核酸疫苗免疫組始終未檢測到卵囊排出，而空載體對照組與生理鹽水空 白對照組均有較多的卵囊排出，提示該真核重組表達質(zhì)粒具有很好的免疫保護效果。實施例1 微小隱孢子蟲疫苗候選抗原Th表位預(yù)測
從文獻中查找目前報道的潛在的微小隱孢子蟲疫苗候選抗原，記錄其GeneBank登 錄號，從NCBI中下載相關(guān)蛋白序列。運用表位預(yù)測服務(wù)器RANKPEP (http://bio.dfci. harvard. edu/RANKPEP/)、MHCPred (http//www. darrenflower, info/mhcpred/)、 MHC2Pred (http://www. imtech.res.in/ raghava/mhc2pred/) 禾口 MHC Binding Predictionhttp:// epitope.liai. org: 8080/tools/matrix/iedb_input Matrix Class =1，11)，分別預(yù)測同鼠源112-(1 (包括H2-Ad和H2_Ed)型MHC II類分子結(jié)合的9個氨基酸長 度的Th表位。考慮到Th細胞表位槽兩端呈開放狀態(tài)，進入槽內(nèi)的抗原肽長度變化較大，在 預(yù)測的9肽結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上做了一定的加長。具體過程為，首先將微小隱孢子蟲抗原的氨基酸 序列分別以FASTA格式輸入以上服務(wù)器，返回的表位數(shù)據(jù)存至word文檔。若氨基酸序列長度大于1000個氨基酸殘基時，保存得分高的前20個表位，否則取前15個表位。RANKPEP服 務(wù)器保存顯示為紅色的返回結(jié)果。找出前2個(預(yù)測H2-Ed)或4個(預(yù)測H2-Ad)服務(wù)器預(yù) 測結(jié)果重復(fù)率大于60%的片段(即有5個以上重復(fù)氨基酸殘基)取其并集，將序列向兩端各 延長1-6個序列作為鼠源H2-d型分子結(jié)合的候選表位。結(jié)果對文獻報道的31個隱孢子蟲疫苗候選抗原進行抗原表位預(yù)測，共獲得H2_d 型Th表位135個。
實施例2微小隱孢子蟲Th多表位基因的設(shè)計和合成
從5個研究較多的微小隱孢子蟲疫苗候選抗原P23、CP15、gpl5/45/60、GP900、CP15/60 中選取10段預(yù)測分值較高的Th表位(見下表1)以任意順序串聯(lián)在一起，表位之間用柔性氨 基酸GGGGS或GPGPG鏈接，使10個Th抗原表位在空間上互相獨立并各自發(fā)揮作用。以SEQ ID NO. 11為例，該設(shè)計合成的Th多表位氨基酸序列包含232個氨基酸(見SEQ ID NO. 11), 編碼該SEQ ID NO. 11氨基酸序列的基因序列為Th多表位基因。為便于重組載體的構(gòu)建， 在Th多表位基因5’端依次加上保護性堿基CCAAT、酶切位點及I、kozac序列、起始密 碼子(ATG)、防錯位保護堿基GCT ；3’端加上保護性堿基CCAAT，酶切位點歷id III、終止密碼 子TTA，全長727 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，將該基因命名為CpThlO。序列 由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成并連接到PMD-18T載體上，命名為pMD-CpThlO，該 pMD-CpThlO重組載體為克隆重組載體。表1用于多表位基因CpThlO合成的微小隱孢子蟲疫苗候選抗原Th表位預(yù)測結(jié) 果 具體序列如下 MAAPAEPAPQDKPADAPAAEAGGGGSLLTMKLDEVVELLPARKRRGPGPGGCLNRRTAAFIAKLRKSKGGGG
SPVRHGKPGVGSTSSSRFIPLKGPGPGSQPTTPAQSEGATTETIGGGGSLLKDAGSSAFGLRYIVPSVGPGPGPIPG SQAGQIADTSNLFPVQGGGGSDSSFAGAYKYAVSNGIKGPGPGGECEAKGATYVGVIGKDGGGGGSISLSGDGKCRN IALDEI (SEQ ID Ν0· 11)。該SEQ ID NO. 11氨基酸序列中，第一個氨基酸M是由起始密碼子編碼的氨基酸， 第二個氨基酸A是由保護堿基編碼的氨基酸。
全長727 bp的CpThlO的核苷酸序列為 CCAATGGATCCCCGACCATGGCTGCCCCTGCTGAACCTGCTCCACAGGATAAGCCAGCTGATGCCCCAGCTG
CTGAAGCTGGAGGCGGAGGCTCTCTCCTTACCATGAAATTGGATGAGGTTGTTGAGCTTTTACCAGCACGTAAAAGA CGTGGACCAGGGCCGGGAGGTTGTCTTAACAGAAGAACTGCAGCTTTTATCGCAAAGCTCCGCAAATCTAAGGGTGG TGGCGGTTCCCCAGTACGTCATGGTAAGCCAGGCGTTGGTTCAACCAGTTCTTCCAGATTCATTCCTCTAAAGGGAC CTGGTCCAGGCTCCCAACCCACTACTCCAGCTCAAAGTGAAGGCGCAACTACCGAAACCATAGGTGGAGGAGGGTCT CTTTTGAAGGATGCTGGTTCCTCTGCTTTTGGACTCAGATACATCGTTCCTTCCGTTGGACCCGGTCCCGGCCCAAT TCCAGGTTCTCAAGCAGGACAAATAGCTGATACAAGCAATTTATTCCCAGTTCAAGGCGGCGGGGGTTCAGATTCTT CATTTGCTGGTGCATACAAATATGCAGTTTCAAATGGTATTAAGGGCCCGGGTCCGGGCGGCGAATGTGAGGCAAAA GGAGCAACTTATGTTGGTGTTATCGGAAAAGATGGAGGTGGGGGGGGCTCTATTTCGCTTTCTGGAGATGGAAAATG CAGAAATATTGCTTTGGATGAAATCTAAAAGCTTATTGG (SEQ ID NO. 12)。實施例3 微小隱孢子蟲Th多表位基因的克隆、表達及純化 (1)微小隱孢子蟲多表位基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
取pET28a ( + )質(zhì)粒和pMD-CpThlO質(zhì)粒，分別用I和歷/ d III雙酶切，回收載體 和目的基因片段，用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽 性菌落。堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)I和歷^d III雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1所示，雙酶切鑒 定結(jié)果正確，表明pET28a ( + ) -CpThlO為Th多表位融合蛋白的重組表達載體。在圖1中， “1”代表重組表達質(zhì)粒pET28a ( + )-CpThlO的歷/ d III和I雙酶切產(chǎn)物，“Μ”指100 bp DNA 分子量標準(100 bp DNA ladder marker )0(2)重組質(zhì)粒的誘導表達
將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞。挑選陽性BL21 (DE3)轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)至D6tltlnm達0. 5左右時，以終濃度為1. 0 mmol/L的IPTG誘導8 h，期間每 隔1 h取樣，將表達產(chǎn)物進行15% SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達。結(jié)果經(jīng)IPTG誘導5 h后 表達量達到最高(見圖2)，SDS-PAGE分析表達蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)計的約30 ku相近。在 圖2中，1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌未誘導產(chǎn)物；2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌IPTG誘導5 h表達產(chǎn)物；3 純 化后的融合蛋白；M 蛋白質(zhì)標準分子量。取IPTG誘導5 h的表達菌，液氮凍融3次并進行超聲波裂解，收集上清液，沉淀加 8 mol/L尿素溶解，離心后分別收集尿素上清和沉淀，分析重組蛋白的存在形式。BandScan 軟件分析顯示，表達的重組蛋白占菌體蛋白總量的17. 6%，主要為可溶性表達。(3)重組蛋白的純化
誘導表達的菌體用 IX 結(jié)合緩沖液(0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris_HCl，5 mmol/L 咪唑，pH7. 9)充分懸浮，凍融超聲裂解后離心收集上清。經(jīng)Ni-NTA His Bind Resin層析 柱進行分步洗脫并收集含目的蛋白的洗脫液，對純化的蛋白進行SDS-PAGE鑒定(見圖2)， 結(jié)果表明，表達產(chǎn)物經(jīng)His親和層析樹脂純化，獲得了較純的目的蛋白，BandScan軟件分 析顯示，融合蛋白約占純化后總蛋白的90. 0%。實施例4 重組蛋白的免疫原性檢測 1.重組蛋白的Western blot分析
重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上進行免疫印跡檢測。將 NC膜浸在含50 g/L脫脂奶粉的磷酸緩沖液PBST中，室溫封閉2 h，用PBST洗滌后，將NC膜與1 200稀釋的鼠抗隱孢子蟲鼠基因型血清溫育1 h，洗滌后再用稀釋度為1 1000 的HRP標記的羊抗鼠IgG溫育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色。Western blot 分析結(jié)果顯示，重組 CpThlO (recombinant CpThlO，rCpThlO)蛋白 與鼠抗隱孢子蟲鼠基因型血清出現(xiàn)特異性反應(yīng)(見圖3)。在圖3中，1 重組質(zhì)粒表達菌全 菌誘導產(chǎn)物；2 純化后的融合蛋白；M 蛋白質(zhì)標準分子量。2.重組蛋白免疫血清的制備
以純化的重組蛋白rCpThlO為抗原免疫2只4周齡清潔級BALB/c小鼠，通過背部皮下 多點注射的方法免疫3次。每次免疫的間隔時間為2周，免疫劑量為0.08 mg/只。初次免 疫時加入等體積的弗氏完全佐劑進行充分乳化，第2次和第3次免疫時加入等體積的弗氏 不完全佐劑乳化。第3次免疫2周后眼眶采血，分離血清-70 °C保存。3.免疫血清效價的ELISA檢測
以8 μ g/mL重組蛋白4°C包被過夜，并用含5%脫脂奶粉的PBST 37°C封閉2 h，與不同 稀釋度的重組蛋白免疫小鼠陽性血清37°C溫育1 h，再與1 :1000稀釋的HRP標記的羊抗鼠 IgG于37 °C反應(yīng)1 h，加四甲基聯(lián)苯胺底物緩沖液(TMB-H2O2) 37°C反應(yīng)10 min，用2 mol/ L H2SO4終止反應(yīng)，測定吸光度(OD45tlnm),檢測重組蛋白免疫血清中特異抗體水平，評估免疫 血清的抗體效價。間接ELISA法測定重組蛋白rCpThlO免疫的BALB/c小鼠血清抗體效價，以免疫血 清的OD45tlnm彡陰性對照OD45tlnm值2. 1倍以上判定為陽性，結(jié)果顯示，經(jīng)3次免疫后，BALB/c 小鼠產(chǎn)生了較高的血清抗體效價，血清經(jīng)1 :1600稀釋后，抗體效價仍遠高于對照組(見表 2)。表2 rCpThlO免疫小鼠血清抗體效價ELISA檢測結(jié)果(OD45tlnm) 實施例5 微小隱孢子蟲Th多表位基因重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)重組真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
取pMD-CpThlO重組質(zhì)粒和pVAXl真核表達載體DNA，分別用限制性內(nèi)切酶I和 Xho I進行雙酶切，用膠回收試劑盒回收載體和目的基因片段，用T4 DNA連接酶連接。連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落。堿裂解法提取質(zhì)粒，進行酶切及測 序鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pVAXl-CpThlO。重組質(zhì)粒pVAX-1-CpThlO經(jīng)FcoR I和煬ο I酶切鑒定，得到了與預(yù)計大小相符的 片段(見圖4)。在圖4中，1 :pVAX-l-CpThl0的I和損ο I酶切鑒定；Ml :DNA分子量
8標準IV ；M2 100 bp DNA分子量標準。重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定未發(fā)生堿基突變，開放閱讀框編 碼順序正確。(2)重組質(zhì)粒的大量提取和純化
將鑒定正確的重組質(zhì)粒pVAXl-CpThlO轉(zhuǎn)化菌以0. 1%濃度重新接種500 mL培養(yǎng)基， 堿裂解法大量提取質(zhì)粒，用聚乙二醇(PEG8000)沉淀法純化質(zhì)粒DNA，用GE Healthcare NanoVue紫外可見光分光光度計測定質(zhì)粒pVAXl-CpThlO的濃度。實施例6 動物保護性實驗 (1)動物分組與免疫
將60只4周齡BALB/c小鼠分成6組，每組10只。rCpThlO亞單位疫苗組用純化的重組 表達蛋白rCpThlO經(jīng)PBS稀釋后與弗氏佐劑充分乳化進行免疫，抗原免疫劑量0. 05 mg/只 小鼠，免疫方式同實施例4的2(重組蛋白免疫血清的制備);核酸疫苗組將重組質(zhì)粒pVAXl-CpThlO用生理鹽水稀釋后以0.05 mg/只小鼠的劑量進行免疫。另設(shè)4個對照組分別為 PBS對照組、生理鹽水對照組、佐劑對照組和pVAX-Ι空質(zhì)粒對照組。每2周免疫1次，共免 疫3次。3免后1周從試驗組中任意選取2只小鼠眼眶采血測定血清效價。(2)保護性實驗
第3次免疫2周后各組小鼠每只經(jīng)口接種IXlO6個隱孢子蟲鼠基因型卵囊。從接種 后第1 d起每隔2 d采糞便10 g，蔗糖漂浮檢查隱孢子蟲卵囊排出情況。同時稱取每組小 鼠的排糞便重量，持續(xù)記錄1個月，根據(jù)結(jié)果綜合評價制備的多表位抗原對小鼠的免疫保 護效果。(3)重組蛋白rCpThlO的免疫保護效果
與PBS空白對照組和佐劑對照組相比，rCpThlO免疫組的排出卵囊數(shù)量減少。各組小 鼠糞便中隱孢子蟲卵囊排出情況如圖5所示，至感染后第27天，rCpThlO免疫組檢測到的 相對卵囊數(shù)為11個，PBS空白對照組為15個，佐劑對照組14個。與對照組相比，rCpThlO免疫組開始排出卵囊時間明顯延后。其中佐劑對照組于 感染后第4 d檢測到卵囊；PBS對照組于感染后第10 d檢測到卵囊；rCpThlO免疫組則于感 染后第16 d檢測到卵囊(見圖5)。與對照組相比，rCpThlO免疫組卵囊排出時間明顯縮短，為16 d，而PBS空白對照 組為19 d，佐劑對照組為25 d (見圖5)。圖5結(jié)果表明該重組亞單位疫苗對小鼠隱孢子蟲鼠基因型感染有較好的免疫保 護效果。(4)核酸疫苗的免疫保護效果
至感染后33天，核酸疫苗pVAX-CpThlO免疫組始終未檢測到卵囊排出；而生理鹽水對 照組于感染后第7 d開始檢測到卵囊，13-19 d達到高峰，至感染后第28 d排卵囊結(jié)束； pVAX-Ι空載體組于感染后第10 d檢測到卵囊，第16 d達到高峰，至試驗結(jié)束即接種后第 33 d，仍有卵囊排出(見圖6)。圖6結(jié)果表明該重組真核表達質(zhì)粒具有很好的免疫保護效果。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。
序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所
<120>微小隱孢子蟲Th多表位基因和融合蛋白及其應(yīng)用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (19) <223> Th 表位 <400> 1
Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Gln Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala 151015
Ala Glu Ala <210> 2 <211> 19 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (19) <223> Th 表位 <400> 2
Leu Leu Thr Met Lys Leu Asp Glu Val Val Glu Leu Leu Pro Ala Arg
151015
Lys Arg Arg
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (18) <223> Th 表位<400> 3
Gly Cys Leu Asn Arg Arg Thr Ala Ala Phe lie Ala Lys Leu Arg Lys
151015
Ser Lys
<210> 4
<211> 21
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<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (21) <223> Th 表位 <400> 4
Pro Val Arg His Gly Lys Pro Gly Val Gly Ser Thr Ser Ser Ser Arg 151015
Phe lie Pro Leu Lys 20
<210> 5 <211> 17 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (17) <223> Th 表位 <400> 5
Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln Ser Glu Gly Ala Thr Thr Glu Thr 151015
lie <210> 6 <211> 19 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (19) <223> Th 表位 <400> 6
Leu Leu Lys Asp Ala Gly Ser Ser Ala Phe Gly Leu Arg Tyr lie Val151015
Pro Ser Val
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (20) <223> Th 表位 <400> 7
Pro lie Pro Gly Ser Gln Ala Gly Gln lie Ala Asp Thr Ser Asn Leu 151015
Phe Pro Val Gln 20
<210> 8 <211> 17 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (17) <223> Th 表位 <400> 8
Asp Ser Ser Phe Ala Gly Ala Tyr Lys Tyr Ala Val Ser Asn Gly lie 151015
Lys
<210> 9 <211> 18 <212> PRT
<213> Cryptosporidium parvum <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)·· (18) <223> Th 表位 <400> 9
Gly Glu Cys Glu Ala Lys Gly Ala Thr Tyr Val Gly Val lie Gly Lys 151015
Asp Gly<210>10<211>17<212>PRT<213>Cryptosporidium parvum<220><221>MISC_FEATURE<222>(1).. (17)<223>Th表位<400>10lie Ser Leu Ser Gly Asp Gly Lys15lie<210>11<211>232<212>PRT
<213>人工序列 <400> 11 Met Ala Ala
1
Pro
Asp
Pro
Arg
65
Gly
Gly
Thr
Ser
Gly 145 Leu
Ala
Glu
Gly
50
Lys
Val
Pro
Glu
Ala 130 Pro
Ala
Val
35
Gly
Ser
Gly
Gly
Thr 115 Phe
Pro
Glu 20
Val
Cys
Lys
Ser
Ser 100 lie
Ala 5
Ala
Glu
Gly Gly Glu Leu Leu Leu Asn
Gly
Thr
85
Gln
Gly Gly Leu
lie Pro Gly
Phe Pro Val
Gln 165
Gly 70
Ser
Pro
Gly
Arg
Ser 150 Gly
Arg
55
Gly
Cys
Pro
Ala Gly
Pro
40
Arg
Thr
Gly
Tyr 135 Gln
Gly
Thr
Gly 120 lie
Ala
Gly
Arg 10
Asn lie Ala Leu
Gly
25
Ala
Ser
Arg Thr Ala Gly Ser Pro Ser Ser Arg
Leu Leu Thr Lys Arg
Pro 105
Ser
Val Gly Gly
Phe
90
Ala
Ala
Val
75
lie
Phe 60 Arg
Arg
45
lie
His
Pro Leu
Gln Ser Glu
Leu Leu Lys
Pro Ser
Gln
Ser 170
lie 155 Asp
Val 140 Ala
Asp 125 Gly
Asp
Asp 15
Pro Gln Asp Lys Pro Ala 10
Ser Ser
Met
30
Gly
Ala
Gly
Lys
Gly 110 Ala
Pro
Thr
Phe
Glu
Asp
15
Lys
Ala
Leu
Pro Gly Lys
Lys
Gly
95
Ala
Gly
Gly
Ser
Ala 175
Leu
Pro 80 Pro
Thr
Ser
Pro
Asn 160 Gly
13Ala Tyr Lys
Tyr Ala Val Ser Asn 180
Glu Ala Lys Gly
Gly Glu Cys 195
Asp Gly Gly Gly Gly Gly 210
Arg Asn lie Ala Leu 225
Asp 230
Ser 215 Glu
Ala 200 Ile
Ile
Gly 185 Thr
lie Lys Gly Pro Tyr Val Gly
Ser Leu Ser
Gly 220
Val 205 Asp
Gly Pro Gly 190
lie Gly Lys Gly Lys Cys
<210>12
<211>727
<212>DNA <213>人工序列
<400>12
ccaatggatccccgaccatggctgcccctgctgaacctgctccacaggataagccagctg60atgccccagctgctgaagctggaggcggaggctctctccttaccatgaaattggatgagg120ttgttgagcttttaccagcacgtaaaagacgtggaccagggccgggaggttgtcttaaca180gaagaactgcagcttttatcgcaaagctccgcaaatctaagggtggtggcggttccccag240tacgtcatggtaagccaggcgttggttcaaccagttcttccagattcattcctctaaagg300gacctggtccaggctcccaacccactactccagctcaaagtgaaggcgcaactaccgaaa360ccataggtggaggagggtctcttttgaaggatgctggttcctctgcttttggactcagat420acatcgttccttccgttggaCCCggtCCCggcccaattccaggttctcaagcaggacaaa480tagctgatacaagcaatttattcccagttcaaggcggcgggggttcagattcttcatttg540ctggtgcatacaaatatgcagtttcaaatggtattaagggCCCgggtCCgggcggcgaat600gtgaggcaaaaggagcaacttatgttggtgttatcggaaaagatggaggtggggggggct660ctatttcgctttctggagatggaaaatgcagaaatattgctttggatgaaatctaaaagc720ttattgg72權(quán)利要求
一種微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白，其特征在于，包含SEQ ID NO.1～10所示Th表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白，其特征在于，所述Th表位 序列之間設(shè)有柔性氨基酸組成的接頭序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白，其特征在于，所述融 合蛋白具有SEQ ID NO. 11所示的氨基酸序列。
4.一種微小隱孢子蟲Th多表位基因，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白 的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲Th多表位基因，其特征在于，所述Th多表位基 因具有編碼SEQ ID NO. 11所示氨基酸序列的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微小隱孢子蟲Th多表位基因，其特征在于，所述Th多表位基 因具有SEQ ID NO. 12所示的核苷酸序列。
7.一種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲Th多表位基因。
8.權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病 的疫苗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求4所述的微小隱孢子蟲Th多表位基因在制備預(yù)防或治療隱孢子蟲病的疫 苗中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗為包含真核表達載體和權(quán)利要 求4所述微小隱孢子蟲Th多表位基因序列的核酸疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微小隱孢子蟲Th多表位融合蛋白，其包含SEQIDNO.1～10所示Th表位序列以任意順序相互串聯(lián)形成的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了微小隱孢子蟲Th多表位基因，其包含編碼上述融合蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明微小隱孢子蟲Th多表位基因和融合蛋白，能制成核酸疫苗和亞單位疫苗，對小鼠隱孢子蟲感染具有很好的免疫保護效果，適于作為抗隱孢子蟲病的多表位疫苗。
文檔編號C12N1/15GK101880328SQ20101019020
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者周鵬, 李艷, 米榮升, 陳兆國, 黃燕 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所