專利名稱：一種新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于貧血的免疫融合蛋白，特別是涉及一種新型高糖基化促紅細(xì) 胞生成素免疫融合蛋白，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
貧血是指單位容積循環(huán)血液內(nèi)的血紅蛋白量、紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積低于正常的 病理狀態(tài)。造成貧血的原因很多，臨床上發(fā)現(xiàn)心血管疾病、慢性腎功能疾病患者常常伴有貧 血。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)全球約有30億人患不同程度的貧血，每年因貧血引致各類(lèi) 疾病而死亡的人數(shù)達(dá)上千萬(wàn)。中國(guó)患貧血的人口概率高于西方國(guó)家，在患貧血的人群中，女 性明顯高于男性，老年人和兒童高于中青年。目前，促紅細(xì)胞生成素(EPO，Erythropoietin)已廣泛應(yīng)用于臨床上各種貧血的 治療，可用于由慢性腎衰、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合征和艾滋病引起的貧血，其中 最有效的是對(duì)腎衰、尿毒癥所伴隨貧血的治療。此外，EP0對(duì)腫瘤相關(guān)性貧血，早產(chǎn)兒和孕 產(chǎn)婦貧血，圍手術(shù)期減少異源性輸血等方面也有良好的療效。多年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)EP0除了 具備作為激素的基本功效外，它還有眾多的生理功能，例如促進(jìn)造血細(xì)胞前體增生分化， 代謝應(yīng)激時(shí)保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)腸黏膜發(fā)育等。隨著研究的不斷深入和臨床試驗(yàn)的開(kāi)展，EP0 必將在更多領(lǐng)域里發(fā)揮更大的作用。促紅細(xì)胞生成素(EPO，Erythropoietin)是由人體腎臟和肝臟分泌的一種糖蛋白 激素，90%由腎臟的間質(zhì)或近端小管的特殊細(xì)胞生成，10%在肝臟的Kuper氏細(xì)胞產(chǎn)生。前 體EP0由193個(gè)氨基酸組成，成熟EP0切除信號(hào)肽后含有166個(gè)氨基酸，分子量約34. 4kD，含 蛋白60 %，碳水化合物40 %。EP0的糖基化程度很高，并有2個(gè)二硫鍵連接(Maront AM. EPO Biochemicalcharacteristics, biological dffects, indications and results of use in hematology. Tumor i. 1997. Jul-Aug. 83 :3_15)。根據(jù)碳水化合物含量的不同可以把天然 存在的EP0分成兩種類(lèi)型a型(34%)和0型(26%)。兩種類(lèi)型EP0在生物學(xué)特性，抗 帛個(gè)生臨雙才目胃(YoshimursA. TheEPO-receptorand signal transduction. Oncologist. 1996. 1 =337-339)。這兩種類(lèi)型的EPO均能促進(jìn)骨髓中紅系造血祖細(xì)胞的增 殖，分化及血紅蛋白合成，從而達(dá)到增加人體血液中紅細(xì)胞的數(shù)量以及提高血液含氧量的 作用。胎兒時(shí)EP0主要由肝臟和腎臟合成，成人體內(nèi)則主要來(lái)自腎臟，極小部分來(lái)自肝臟 (KouryMJ, Bondurant MC. Control of red cell production the roles of programmed cell death(apoptosis)and erythropoietin. Transfusion. 1990 ；30 :673_674)。正常情況 下，人血清中EP0的平均濃度為14. 9mU/ml，在貧血和低氧狀態(tài)下，EP0的含量將增加，但腎 臟貧血時(shí)含量卻非常低。腎功能受到損害時(shí)(如慢性腎衰竭)，促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生受到 阻礙，可導(dǎo)致貧血的發(fā)生。1977年，人們首次成功地從再生障礙性貧血患者尿中純化出少量EP0，1983年， EP0基因克隆和表達(dá)獲得成功。近年來(lái)EP0的臨床應(yīng)用逐年增加，且增長(zhǎng)速度較快，僅次于
3抗血栓形成藥，已上升為世界頭號(hào)暢銷(xiāo)生物工程藥品。目前，商購(gòu)可獲得三種類(lèi)型的ΕΡ0，即rHuEPO-α、rHuEPO-β和 darbepoetin α (Weiss G, Goodnough LT. Anemia of chronic disease. N Engl J Med. 2005 Mar 10 ；352 (10) :1011_23)，均為 EPO 單體藥物。
但由于EPO單體藥物藥效短，rhEPO在人體內(nèi)的半衰期僅為4 8小時(shí)，用藥頻繁， 給病人帶來(lái)不便和痛苦。因此，各種長(zhǎng)效的EPO藥物開(kāi)始出現(xiàn)，如聚乙二醇(PEG)修飾的 EPO0 PEG具有高度的親水性，在水溶液中有較大的水動(dòng)力學(xué)體積。當(dāng)PEG偶聯(lián)到蛋白分子 表面時(shí)，可在其修飾的蛋白質(zhì)周?chē)a(chǎn)生空間位阻，減少蛋白酶對(duì)其的水解作用，阻止蛋白分 子疏水區(qū)域相互作用，增加了 EPO的穩(wěn)定性、溶解性，從而降低了腎臟的清除作用，延長(zhǎng)了 EPO的半衰期。目前已上市的代表藥物有Roche開(kāi)發(fā)的PEG-EP0，即PEG化的重組促紅細(xì)胞 生成素，商品名為Anemia。另一方面，糖基對(duì)EPO的生物學(xué)活性、水溶性、熱穩(wěn)定性及生物合成均有較大的影 響。糖基化發(fā)生在特定的氨基殘基序列上，分為兩類(lèi)N-連接糖基化，寡糖通過(guò)與蛋白質(zhì)的 天冬氨酸的自由NH2基連接到特征序列Asn-X-Ser/Thr (X代表任何一種氨基酸)中的天冬 酰胺上；0-連接糖基化是將糖鏈轉(zhuǎn)移到多肽鏈的絲氨酸、蘇氨酸或羥賴氨酸的羥基的氧原 子上。去除N-連接糖基后的EPO基本喪失體內(nèi)生物學(xué)活性，而0-連接糖基對(duì) EPO 體內(nèi)生物學(xué)活性幾乎沒(méi)有影響(Wasley LC The importance of N-and0-linked oligosaccharides for the biosynthesis and in vitro andin vivo bioIogicactivities of erythropoietin. Blood 1991,77 (12) :2624_2632)。EPO分子有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中3個(gè)N端糖鏈(Asn24，38，83)和1個(gè)0端糖鏈 (Serl26)。126 位 0-糖鏈的主要組成為 N-NeuNAC α -2 — 3Gal β 1 — 3(NeuNACa-6)Gal NAcOH-Ser0各種N連接寡糖鏈結(jié)構(gòu)占總含糖量的百分率分別 為雙末梢糖鏈1.4%，三末梢糖鏈10%，帶有一個(gè)N-乙酰氨基半乳糖重復(fù)單位的三末梢糖 鏈3.5%，四末梢糖鏈31.8%，帶有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)N-乙酰氨基半乳糖重復(fù)單位四末梢糖 鏈分別為 32. 1%，16. 5%和 4.7%。所有這些寡糖鏈都被以α 2 — 3連接方式唾液酸化。其中四末梢糖鍵被2個(gè)或3 個(gè)唾液酸殘基唾液酸化。另外還發(fā)現(xiàn)天然和rhEPO僅在唾液酸含量上有微小差異，其它糖 鍵結(jié)構(gòu)并無(wú)不同。N糖基化不完全的rhEPO體外活性正常，而體內(nèi)活性則降低到體外活性的 1/500，其體內(nèi)被清除的速率也明顯加快。糖基化EPO對(duì)熱和pH變化穩(wěn)定，等電點(diǎn)為4. 2 4. 6。2001年，美國(guó)Amgen公司研制的長(zhǎng)效貧血治療藥新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP， New Erythropoietin Stimulating Protein),商品名為 Darbepoetin alfa (見(jiàn) PCT NO. US94/09257)，于2001年6月獲得歐洲藥物評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。NESP 是一種高糖基化 rhEPO 類(lèi)似物(Hyperglycosylated rhEPO analogues)，具 有與rhEPO相似的作用機(jī)制。NESP含5個(gè)N端糖鏈，比rhEPO高2倍的唾液酸殘基，從而達(dá) 到較大的代謝穩(wěn)定性和3倍于rhEPO (半衰期為4 8小時(shí))的半衰期，達(dá)36小時(shí)，因此可 減少給藥次數(shù)。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)的策略，即突變了天然 EPO 的 5 個(gè)氨基酸殘基，分別是Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88AsnPro90Thr。 與天然的EPO相比增加了 30和88位的N糖基化位點(diǎn)。另一方面，通過(guò)NESP和IgG2表達(dá) 基因的連接，使表達(dá)的蛋白形成同源二聚體，增加免疫融合蛋白的分子量，能夠顯著延長(zhǎng)生 物半衰期。IgG型免疫球蛋白是人血液中最豐富的蛋白，半衰期長(zhǎng)達(dá)21天，將人IgG的Fc段 與其他蛋白融合表達(dá)可使得融合蛋白表現(xiàn)出和人IgG相當(dāng)?shù)乃幬锎x動(dòng)力特征，從而延 長(zhǎng)了融合蛋白的半衰期。本發(fā)明在Haak FM等(參見(jiàn)Haak FM等，J Immunol, 1993,151 351)研究工作的基礎(chǔ)上，將NESP與IgG2的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3進(jìn)行融合表達(dá)。為進(jìn)一步 降低IgG2的CH2區(qū)可能具有的較弱的絲裂原活性，將IgG2中的Val234和Gly237突變?yōu)?Ala(氨基酸編號(hào)參照Kabat數(shù)據(jù)庫(kù))，以降低其與Fc γ RII的結(jié)合活性(參見(jiàn)Cole MS等， J Immunol. 1997，159(7) :3613_21)。新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)抗原性較弱，迄今為止 尚未檢測(cè)出NESP抗體，融合蛋白中IgG2氨基酸殘基序列與人體IgG2基本一致，這兩方面 保證了所產(chǎn)生的融合蛋白可能具有較低的免疫原性。另外，IgG2的穩(wěn)定區(qū)CH2和CH3仍保 留與Protein A的結(jié)合特性，為將來(lái)產(chǎn)品的純化和檢測(cè)提供了便利。本發(fā)明表達(dá)的新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白具有與天然EPO同樣 的生物活性，由于蛋白分子量的增加，生物半衰期顯著延長(zhǎng)，用于EPO水平低下所致的貧血 癥，可減少患者注射次數(shù)，減輕患者痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，給臨床治療帶來(lái)了極大的便利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，編碼 該融合蛋白的多核苷酸，制備和純化該融合蛋白的方法及應(yīng)用。本發(fā)明的免疫融合蛋白是 由新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)與人IgG2-Fc融合而成的二聚體蛋白質(zhì)，見(jiàn)附圖1。用于 各種原因所致的貧血癥，包括慢性腎衰、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增殖綜合征和艾滋病引起 的貧血，腫瘤相關(guān)性貧血，早產(chǎn)兒和孕產(chǎn)婦貧血及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的貧血，尤其是對(duì)腎 衰、尿毒癥所伴隨貧血的治療最為有效。由于EPO單體藥效短，rhEPO在人體內(nèi)的半衰期僅 為4 8小時(shí)，用藥頻繁，給病人帶來(lái)不便和痛苦。之后開(kāi)發(fā)的高糖基化rhEPO類(lèi)似物NESP， 雖然含有5個(gè)N端糖鏈，比rhEPO高2倍的唾液酸殘基，從而具有較大的代謝穩(wěn)定性，但半 衰期也僅為36小時(shí)，仍需1-2天注射一次，因此目前的促紅細(xì)胞生成素類(lèi)藥物普遍存在半 衰期短的問(wèn)題，臨床應(yīng)用受到很大的限制。本申請(qǐng)人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一 步的研究，研制開(kāi)發(fā)了本發(fā)明的新型的高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，該免疫融 合蛋白可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化工藝簡(jiǎn)單，有利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備，具有 與天然EPO相似的生物學(xué)活性，能與靶細(xì)胞如骨髓細(xì)胞、脾細(xì)胞、胎兒肝細(xì)胞上的特定位點(diǎn) 結(jié)合，從而促進(jìn)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的增值、分化并成熟為紅細(xì)胞，增加骨髓向循環(huán)血中紅細(xì)胞 的釋放量，具有更長(zhǎng)的血清半衰期，達(dá)到有效治療貧血的療效。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明一方面提供了是由新紅細(xì)胞刺激蛋白NESP與免疫球蛋白IgG的Fc部分 融合而成的一種新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，命名為NESP-Fc免疫融合蛋 白。所述的NESP的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；
所述的IgG的Fc部分包含鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的人IgG分子的二聚化Fc部分，其中二聚化Fc部分中的每一條鏈通過(guò)其C末端直接與NESP分子的N末端相連。本發(fā)明的NESP-Fc免疫融合蛋白具有5個(gè)N端糖鏈和1個(gè)0端糖鏈，所述的N糖 基化位點(diǎn)包含Asn-X-Ser/Thr的氨基酸序列，5個(gè)N糖基化位點(diǎn)發(fā)生在24、30、38、83和88 位。本發(fā)明中所述的IgG是人源的；優(yōu)選為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4及其突變體中的任意一種；更優(yōu)選為人IgG2及其突變體的任意一種；人IgG2的突變體為IgG2序列中的Val234和Gly237突變?yōu)锳la，氨基酸序列見(jiàn)序 列表中SEQ ID NO 2所示；。本發(fā)明一方面提供了 一種NESP-Fc免疫融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO 3所
7J\ ο本發(fā)明一方面提供了編碼NESP-Fc免疫融合蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明一方面提供了包含編碼NESP-Fc免疫融合蛋白的多核苷酸序列的載體；所述的載體為真核表達(dá)載體；所述的載體是pBT-NESP-Fc。本發(fā)明一方面提供了一種轉(zhuǎn)染上述載體的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為CHO 細(xì)胞或NSO細(xì)胞。本發(fā)明一方面提供了 NESP-Fc融合蛋白的制備方法，包括以可檢測(cè)量表達(dá)免疫融 合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯所述的的多核苷酸，經(jīng)親和層析法純化的步驟。本發(fā)明一方面提供了一種藥物組合物，其含有所述的NESP-Fc免疫融合蛋白及藥 學(xué)上可接受的賦形劑。這些藥物組合物可用于刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生并預(yù)防和治療由于EPO水平 低下所致的貧血癥。所述的藥物組合物可以制成各種制劑，制劑包含NESP-Fc免疫融合蛋白、緩沖液 以及液體或固體形式的表面活性劑。固體制劑包括但不限于冷凍干燥、噴霧冷凍干燥或噴 霧干燥制劑。液體制劑優(yōu)選的基質(zhì)為水，但還可以包含其他成分，例如乙醇、丙醇、丙二醇或 甘油等。緩沖液成分包括能夠調(diào)節(jié)pH的任何生理可用物質(zhì)，例如檸檬酸鹽、醋酸鹽。組氨 酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽及其各自的酸或混合物。通常使用的緩沖液成分是檸檬酸鹽和/ 或其游離酸。表面活性劑是可以在藥物組合物中用作表面活性劑的任何賦形劑，如聚乙烯 山梨聚糖酯類(lèi)(Tweens)等。所述的藥物組合物通過(guò)局部給藥、氣霧劑、注射劑的方式施用；所述的注射劑通過(guò) 腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射和靜脈注射的方式施用。本發(fā)明一方面提供了一種新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白在制備治 療貧血癥的藥物中的應(yīng)用。


圖1為NESP-Fc免疫融合蛋白結(jié)構(gòu)示意2為NESP-Fc免疫融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
圖2A為PCR擴(kuò)增NESP-Fc基因，其中條帶1為NESP-Fc基因；條帶2為NESP-Fc 基因；條帶3為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000圖2B為Hindlll-EcoRI雙酶切鑒定。其中，條帶1為分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；條帶2 為切出預(yù)期大小的片段；條帶3為切出預(yù)期大小的片段；條帶4為切出預(yù)期大小的片段圖3為PBL表達(dá)載體示意4為人IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線圖5為NESP-Fc免疫融合蛋白純化產(chǎn)物電泳分析圖6為NESP-Fc免疫融合蛋白體外活性檢測(cè)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方案 通過(guò)下列實(shí)施例舉例說(shuō)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施方案 不限于這些實(shí)施例的特定細(xì)節(jié)，因?yàn)閷?duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其其他的變化是已 知的，或根據(jù)直接公開(kāi)的內(nèi)容和附屬的權(quán)利要求是顯而易見(jiàn)的。因此，凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本文引用的參考文獻(xiàn)以其全文通過(guò)引用并入本文。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1 :NESP-Fc免疫融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建1、NESP-Fc免疫融合蛋白表達(dá)基因的優(yōu)化影響細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)量的因素是多方面的，當(dāng)基因中含有大量的稀有密碼子時(shí)， 會(huì)降低蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。因?yàn)槿诤系鞍讓⒃诩?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)CHO表達(dá)的偏性密碼子 表(參見(jiàn) Holm L. Nucleic Acids Res. 1986Apr 11 ；14(7) :3075_87)對(duì)新紅細(xì)胞生成刺激 蛋白(NESP)和IgG2編碼的DNA序列進(jìn)行優(yōu)化，并保證所編碼的蛋白氨基酸殘基保持不變。 新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP)的蛋白氨基酸殘基序列參見(jiàn)專利US20030104996，IgG2蛋白 氨基酸殘基序列參見(jiàn)> gi| 243169 |gb IAAB21082. 1|。為了保證蛋白的高效表達(dá)，本發(fā)明中 融合蛋白信號(hào)肽序列為適于抗體類(lèi)蛋白表達(dá)的抗體輕鏈κ信號(hào)肽，該信號(hào)肽氨基酸殘基 序列為“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”，并在起始密碼子“ATG”前加入有利于蛋白表達(dá)的Kozak 序列“CGCCACC”。由于涉及多個(gè)堿基的突變，不能采用逐一突變的方法，只能用人工合成全 序列，我們對(duì)表達(dá)的蛋白cDNA進(jìn)行全合成CGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGC CCCTCCTCGCCTGATCTGCGACTCCCGCGTGCTGGAGCGCTACCTGCTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAACATCACCA CCGGCTGCAACGAGACCTGCTCCCTGAACGAGAACATCACCGTGCCTGACACCAAGGTGAACTTCTACGCCTGGAAG CGCATGGAGGTGGGCCAGCAGGCCGTGGAGGTGTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCCGAGGCCGTGCTGCGCGGCCA GGCCCTGCTGGTGAACTCCTCCCAGGTGAACGAGACCCTGCAGCTGCACGTGGACAAGGCCGTGTCCGGCCTGCGCT CCCTGACCACCCTGCTGCGCGCCCTGGGCGCCCAGAAGGAGGCCATCTCCCCTCCTGACGCTGCCTCCGCTGCTCCC CTGCGCACCATCACCGCCGACACCTTCCGCAAGCTGTTCCGCGTGTACTCCAACTTCCTGCGCGGCAAGCTGAAGCT GTACACCGGCGAGGCCTGCCGCACCGGCGACCGCGACAAGACCGTGGAGCGCAAGTGCTGTGTGGAGTGCCCTCCCT GCCCTGCTCCTCCTGCTGCCGCTCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATC GAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCCCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACAGCAAG CTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCTGGAAAGTAA其中“CGCCACC”為Kozak序列，“ATG”和“TAA”分別為起始密碼子和終止密碼子。該系列所表達(dá)的免疫融合蛋白一級(jí)序列為METDTLLLWVLLLWVPGSTG APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCNETCSLNENI TVPDTKVNFYAffKRMEVGQQAVEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNS SQVNETLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQ KEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTCDRDKTVERKCCVECPPCPAPPAAAPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDffLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK斜體氨基酸序列為抗體輕鏈κ信號(hào)肽，下劃線氨基酸序列為IgG2的鉸鏈區(qū)、CH2 和CH3區(qū)，IgG2中的Val234和Gly237突變?yōu)锳la (236位氨基酸缺失)，新紅細(xì)胞生成刺 激蛋白(NESP)的蛋白氨基酸殘基序列中與天然EPO的序列相比較，對(duì)以下氨基酸進(jìn)行了突 變:Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr。通過(guò)http://www. expasy. ch/tools/提供的軟件對(duì)免疫融合蛋白N糖基化位點(diǎn)進(jìn) 行預(yù)測(cè)，NESP-IgG2免疫融合蛋白共有六個(gè)N糖基化位點(diǎn)，其中五個(gè)在NESP氨基酸殘基中， 一個(gè)在IgG2中，如表1所示。表1免疫融合蛋白N糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)METDTLLLWVLLLWVPGSTGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCNETCSLNENITVPDTKVNFY AffKRMEVGQQA 80VEVffQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQVHETLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAP LRTITADTERK 160LFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTCDRDKTVERKCCVECPPCPAPPAAAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHE 240DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK TKGQPREPQVY 320TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMH 400EALHNHYTQKSLSLSPGK...........................................N.....N.......N...........
........... 80......................N____N.........................................
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........... 320 .....................................................................
........... 400
480(Threshold = 0. 5)---------------------------------------------------------------------SeqName Position Potential JuryN-Glycagreement result---------------------------------------------------------------------123456 44 NITT 0.6764(9/9)++123456 50 NETC 0.5551(6/9)+123456 58 NITV 0. 7980(9/9)+++123456 103 NSSQ 0.7374(9/9)++123456 108 NETL 0.6410(9/9)++123456 268 NSTF 0.5453(5/9)+---------------------------------------------------------------------2、NESP-Fc免疫融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)上游引物5，-CCCAAGCTTCCGCCACCATGGAGAC-3，，下游引物5-CCGGAATTCTTA CTTTCCAGGAGACAGGGACAGG-3，其中下劃線部分分別為HindIII和EcoRI的酶切位點(diǎn)。采用 PCR的方法對(duì)NESP-Fc的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘，以94°C變 性45s，56 °C退火45s，72 °C延伸2min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，再以72°C延伸10分鐘，PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)附圖2A。將目的條帶切下，用DNA試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物。NESP-Fc基因PCR產(chǎn)物大小約為1250bp，該產(chǎn)物和表達(dá)載體PBL分別用HindIII 和EcoRI雙酶切后，分別用DNA試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下16°C連接 過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細(xì)菌中，在LB (氨芐酶素抗性)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)，挑 取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，采用HindIII和EcoRI雙酶切鑒定，結(jié)果如附圖2Β所示。本發(fā)明采用的是谷氨酰胺(GS)篩選表達(dá)體系，如附圖3所示。目前，抗體和融合 蛋白表達(dá)系統(tǒng)方面國(guó)內(nèi)研究和使用較多的是二氫葉酸還原酶(DHFR)系統(tǒng)。GS系統(tǒng)是近年 來(lái)發(fā)展的一種基因擴(kuò)增篩選系統(tǒng)，GS系統(tǒng)較DHFR系統(tǒng)有明顯的優(yōu)越性進(jìn)入大規(guī)模細(xì)胞培 養(yǎng)生產(chǎn)后，培養(yǎng)基中無(wú)需加入谷氨酰胺，降低因谷氨酰胺分解產(chǎn)生的氨對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性， 可有效提高細(xì)胞發(fā)酵密度和延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間；所需細(xì)胞為DHFR缺陷型細(xì)胞，該類(lèi)細(xì)胞生 長(zhǎng)往往較慢，GS表達(dá)系統(tǒng)可用正常的細(xì)胞進(jìn)行篩選；DHFR系統(tǒng)的缺陷表現(xiàn)為篩選高表達(dá)株 所需時(shí)間長(zhǎng)，GS表達(dá)系統(tǒng)篩選高表達(dá)株所需時(shí)間短，且容易篩選到高表達(dá)細(xì)胞株。實(shí)施例2 =NESP-Fc免疫融合蛋白的表達(dá)及純化
1、NESP-Fc免疫融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞293F(購(gòu)自 Invitrogen 公司，Cat No. 11625-019)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于無(wú)血清 CD293 培養(yǎng)液(購(gòu)自Invitrogen公司，Cat No. 11913-019)中，轉(zhuǎn)染前離心更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞 濃度調(diào)整為1 X IO6細(xì)胞/ml。以IOOml細(xì)胞為例，分別將DNA(250ug)和PEI (500ug, Sigma, Cat. No =408727)加入Iml 293培養(yǎng)液中混勻，靜置5min。室溫放置8min。將PEI/DNA混懸 液逐滴加入搖瓶中，輕輕混勻，置于5% C02、37°C搖床培養(yǎng)(115rpm)5天后收集培養(yǎng)上清。2、免疫融合蛋白濃度的檢測(cè)采用夾心ELISA法檢測(cè)收集培養(yǎng)上清中免疫融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。96孔板包被3 μ g/ml 抗人 IgG(Sigma, Cat. No 13382)，50 μ 1/ 孔，4°C過(guò)夜；0. 25% BSA 的 PBST (0. 05% Tween-20)洗滌 96 孔板 4 次；1 % BSA-PBS 封閉(50 μ 1/ 孔)，37 °C，封閉 1 小時(shí)；PBST 洗滌4次后，加入0. 25 % BSA的PBST稀釋轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，50μ 1/孔， 37°C孵育Ih ；洗板4次后，加入1 2000稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG(Sigma, Cat. No Α3188)，50μ 1/孔；洗板4次后，加lmg/ml用二乙醇胺新鮮配制底物對(duì)硝基苯磷酸酯 (p-nitrophenylphosphate, p-NPP) 50 μ 1/ 孔，避光反應(yīng) 30min 加終止液 3M NaOH(50 μ 1/ 孔)，405nm和490nm雙波長(zhǎng)讀數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行x(濃度)，y (吸光度)的直線擬合；求出細(xì) 胞上清液中免疫融合蛋白的濃度，如附圖4所示。培養(yǎng)上清液中NESP-IgG2免疫融合蛋白 的瞬時(shí)表達(dá)量約為1. 03 μ g/ml。3、親和層析法純化NESP-Fc免疫融合蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞5天后，收集上清做純化。用pH 7. 4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelectSuRe Iml 柱(GE Healthcare Life Sciences產(chǎn)品，Cat. No :11-0034_93) 10個(gè)床 體積，流速為0. 5ml/min ；將經(jīng)轉(zhuǎn)染得到的60ml上清液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾上樣。流速為 0. 5ml/min ；用pH 7. 4的PBS溶液再洗5-10個(gè)床體積，流速為0. 5ml/min ；用IOOmM檸檬酸 緩沖液(PH 4. 0)洗脫，流速為0. 5ml/min，收集洗脫峰。透析置換純化樣品中的洗脫液。把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度(10-20cm)的小段；在大 體積的2%碳酸氫鈉和lmmol/L EDTA(pH 8. 0)中將透析袋煮沸10分鐘；用蒸餾水徹底清 洗透析袋；放在lmmol/L EDTA (pH 8.0)中將之煮沸10分鐘；冷卻后，存放于4°C，必須確保 透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)；用去離子水清洗透析袋，將純化樣品裝入透析袋中，兩端用透析 夾夾好；放入裝有緩沖液的燒杯中攪拌透析；透析3個(gè)小時(shí)，中間需要更換緩沖液一次，透 析實(shí)驗(yàn)緩沖液為PH為7的磷酸緩沖液。實(shí)施例3 =NESP-Fc免疫融合蛋白的結(jié)構(gòu)確證取純化后的融合蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，分析純化產(chǎn)物。透析前后對(duì)蛋白分子量沒(méi)有變化，還原和非還原條件下融合蛋白的分子量分別為 72kDa， 200kDa。見(jiàn)附圖 5。實(shí)施例4 =NESP-Fc融合蛋白生物學(xué)活性檢測(cè)1、EPO依賴生長(zhǎng)細(xì)胞株UT-7細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī) 學(xué)細(xì)胞中心，編號(hào)3111C0001CCC000120)懸浮培養(yǎng)于含10%胎牛血清PRMI 1640培養(yǎng)基中， 并含10u/ml已 0(購(gòu)自沈陽(yáng)三生)，371，5% CO2培養(yǎng)。2、試驗(yàn)前用胎盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，活細(xì)胞比率數(shù)大于95%時(shí)進(jìn)行下面的試驗(yàn)。計(jì)數(shù)細(xì)胞，96孔培養(yǎng)板中加入U(xiǎn)T-7細(xì)胞1 X IO4/孔。3、用不含EPO的10 % FBS的1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染上清，使其終濃度為 0. 198ng/mL、0. 395ng/mL、0. 791ng/mL、l. 582ng/mL、3. 164ng/mL、4. 745ng/mL、9. 491ng/mL、 28. 472ng/mL、113. 889ng/mL。每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組培養(yǎng)基為不含EPO的10% FBS 的1640。37°C，5% CO2孵箱中培養(yǎng)。
4、直至對(duì)照組(不含ΕΡ0)細(xì)胞全部死亡(凋亡)結(jié)束培養(yǎng)。每孔再加入10 μ L CCK-8試劑(購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)，37°C培養(yǎng)2. 5h后測(cè)450nm處吸光度，參 比波長(zhǎng)630nm，將濃度對(duì)數(shù)與吸光度(OD)作圖，見(jiàn)附圖6。結(jié)果，UT-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，NESP-Fc融合蛋白分別在0. 198ng/mL 113. 889ng/mL范圍內(nèi)，體外活性隨濃度的升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，如下表2所 示。NESP-Fc 的 ED5tl 為 0. 00735ng/mL。表2NESP-FC融合蛋白的濃度與活性的量效關(guān)系
權(quán)利要求
一種新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，是由新紅細(xì)胞刺激蛋白NESP與免疫球蛋白IgG的Fc部分融合而成；所述的NESP的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；所述IgG的Fc部分是包含鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的IgG分子的二聚化Fc部分，其中二聚化Fc部分中的每一條鏈通過(guò)其C末端直接與NESP分子的N末端相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，其特征在于， 所述的N糖基化位點(diǎn)包含Asn-X-Ser/Thr的氨基酸序列，所述的N糖基化位點(diǎn)有5個(gè)，發(fā)生 在NESP氨基酸序列的第30，32，87，88，90位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的IgG是人源的；優(yōu)選為人 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4及其突變體中的任意一種；更優(yōu)選為人IgG2及其突變體的任意一 種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的IgG2突變體為IgG2序列中的 Val234和Gly237突變?yōu)锳la，所述的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫融合蛋白的氨基酸序列為 SEQ ID NO 3 所示。
6.多核苷酸序列，其編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。
7.一種載體，其包含如權(quán)利要求6所述的多核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，所述的載體為真核表達(dá)載體；所述的載體 是 pBT-NESP-Fc。
9.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞經(jīng)如權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)染。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞或NSO 細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免疫融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以可檢測(cè) 量表達(dá)融合蛋白的條件下轉(zhuǎn)錄和翻譯權(quán)利要求7的多核苷酸，培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主 細(xì)胞，經(jīng)Protein A方法純化的步驟。
12.—種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述 的免疫融合蛋白及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物通過(guò)局部給 藥、氣霧劑、注射劑的方式施用；所述的注射劑通過(guò)腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射和靜脈 注射的方式施用。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-5、12中任一項(xiàng)所述的一種新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融 合蛋白在制備治療貧血癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用基因工程方法研制的新型高糖基化促紅細(xì)胞生成素免疫融合蛋白，是由新紅細(xì)胞生成刺激蛋白(NESP，New ErythropoietinStimulating Protein)與人IgG2-Fc融合而成的二聚體蛋白質(zhì)NESP-Fc，編碼該免疫融合蛋白的多核苷酸以及制備和純化該免疫融合蛋白的方法。該免疫融合蛋白可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)，且純化工藝簡(jiǎn)單，有利于進(jìn)一步的大規(guī)模制備。本發(fā)明的NESP-Fc免疫融合蛋白具有與天然EPO相似的生物學(xué)活性，但具有更長(zhǎng)的血清半衰期，可用于治療EPO水平低下引起的貧血癥。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101870735SQ20101018981
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者何麗華, 劉芳杰, 喻志愛(ài), 扈艷紅, 李先鐘, 李桂珠, 楊思儀, 林峰, 白先宏, 程虹, 胡品良, 馬金偉 申請(qǐng)人:北京精益泰翔技術(shù)發(fā)展有限公司;百泰生物藥業(yè)有限公司