新孢子蟲屬的突變株及其用圖
【專利說明】新孢子蟲屬的突變株及其用途
[0001] 本發(fā)明涉及新孢子蟲屬物種（Neospora spp)突變株、其在藥物組合物中的用途和 其在疫苗組合物中的用途。
[0002] 犬新孢子蟲（Neospora caninum)是對(duì)新孢子蟲病負(fù)有責(zé)任的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。它 屬于頂復(fù)門（Apicomplexa)，該門集合了大量的主要為細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲。這些寄生蟲對(duì)諸如 新孢子蟲病、弓形體病、皰疾、球蟲病和隱孢子蟲病的疾病負(fù)有責(zé)任。它們共同具有以多個(gè) 步驟侵入宿主細(xì)胞的特殊過程，從而導(dǎo)致形成寄生泡，在所述寄生泡中寄生蟲進(jìn)行發(fā)育。
[0003] 犬新孢子蟲的生活史具有兩個(gè)不同的階段：在中間宿主例如小鼠、綿羊和牛中的 無性階段，其導(dǎo)致速殖子的產(chǎn)生和隨后包含慢殖子的包囊的產(chǎn)生；和在終宿主（主要是狗） 中的有性階段，其導(dǎo)致包含子孢子的卵囊的產(chǎn)生，所述卵囊被排到糞便中。
[0004] 動(dòng)物的新孢子蟲病在農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域中和尤其是在牛養(yǎng)殖中提出了重大的經(jīng)濟(jì)問 題，在牛養(yǎng)殖中該疾病造成小牛增重減少、生育力下降、產(chǎn)乳減少，但尤其被認(rèn)為是流產(chǎn)的 主要原因之一。因此，每年在世界上，在牛存欄數(shù)中3至4千萬例流產(chǎn)由犬新孢子蟲造成。與 鼠弓形體（Toxoplasma gondii)相反，該寄生蟲的母-胎傳播和胎兒的先天性感染不僅在 妊娠過程中在初次感染的情況下發(fā)生，而且還在在妊娠之前在被慢性感染的母牛中發(fā)生。
[0005] 牛的污染可以按照兩條完全不同的途徑來進(jìn)行：
[0006] ?通過水平污染，即通過攝入被由終宿主排出的卵囊所污染的食物。在妊娠的情 況下，流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)因此為80%。
[0007] ?通過垂直污染，即寄生蟲從母親至其小牛的母-胎傳播。在妊娠之前被感染的 母牛在隨后的妊娠過程中可以要么再次流產(chǎn)，要么生出健康的小牛，要么最經(jīng)常地將寄生 蟲傳播給其小牛。該小牛將會(huì)被犬新孢子蟲感染，并且如果它是雌性的，那么她從而將會(huì)具 有尚的將寄生蟲傳播給其后代的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)具有流廣的可能性。
[0008] 這些后果非常顯然地對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)具有重大的經(jīng)濟(jì)影響。因此，新孢子蟲病對(duì)關(guān) 于在加利福尼亞的120萬頭奶牛的35M €的損失（Dubey, J. Am. Vet. Med. Assoc.，1999年 4月15日，214 (8) :1160-3)、對(duì)關(guān)于在荷蘭的160萬頭母牛的19M€的損失（Bartels等 人，Vet. Parasitol.，2006年4月15日，137 (1-2) : 17-27)和對(duì)關(guān)于在瑞士的70萬頭母牛 的 IOM €( Hosier 等人，Prev. Vet. Med.，2006 年 12 月 18 日，77 (3-4) : 230-53)的損失 負(fù)有責(zé)任。
[0009] 疫苗的開發(fā)是用于對(duì)抗新孢子蟲病的主要目標(biāo)。數(shù)種用于制造針對(duì)新孢子蟲病的 疫苗的策略目前處于研宄之中：
[0010] ?基于通過輻射、通過熱等進(jìn)行滅活的寄生蟲的疫苗：這些疫苗產(chǎn)生保護(hù)性免 疫應(yīng)答，但通常需要存在佐劑和還有多次追加疫苗接種。目前，唯一的針對(duì)牛的新孢子 蟲病的疫苗在某些地理區(qū)域中和尤其在美國(guó)銷售。它是由Intervet公司銷售的疫苗 NeoGuard?。該疫苗由犬新孢子蟲的經(jīng)滅活的速殖子和一種特殊的佐劑（Havlogene) 構(gòu)成。疫苗NeoGuard?的效力（大約50%)被認(rèn)為是部分的。此外，該疫苗的施用方式 需要在疫苗接種的頭一年期間以幾周的間隔注射兩次，然后在隨后的年份注射一至兩次。 toon] ?基于經(jīng)減毒的活寄生蟲的疫苗：這些株系通常要么在體外通過在誘變劑存 在或不存在下在宿主細(xì)胞中培養(yǎng)的寄生蟲的連續(xù)傳代來獲得，要么通過自然界中分離 出毒力較弱的株系來獲得，要么通過其他方法例如輻射來獲得。這些疫苗通常是非常 有效的但具有在分子方面未得到表征的主要缺點(diǎn)，并且總是讓人擔(dān)心回復(fù)至強(qiáng)毒形式。 已經(jīng)從以無癥狀方式被感染的小牛中分離出了數(shù)種分離物，例如Nc-Nowra(Miller等 人，Aust. Vet. J·，2002 年 10 月，80(10) :620-5)和 Nc-Spain-IH(Regidor-CerriIlo 等 人，Parasitology, 2008年12月，135 (14) : 1651-9)。這些減毒株的疫苗潛力正處在評(píng)價(jià)過 程中。
[0012] ?重組疫苗：已經(jīng)在小鼠中的疫苗接種實(shí)驗(yàn)之中評(píng)價(jià)了表達(dá)犬新孢子蟲的抗原 NcSRS2 的痘苗病毒（Nishikawa 等人，Parasitol. Res.，2000 年 11 月，86(11) :934-9 ; Nishikawa 等人，Vaccine, 2001 年 1 月 8 日，19(11-12) :1381-90)，并且已經(jīng)證明 了其在 小鼠中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。更近來，將流產(chǎn)布魯氏菌（Brucella abortus)的 菌株用于表達(dá)犬新孢子蟲的各種不同抗原（Ramamoorthy等人，Int. J. Parasitol.，2007 年 11 月，37(13):1531-8;和 Ramamoorthy 等人，Int J Parasitol. ,2007 年 11 月，37(13) : 1521-9)。表達(dá)蛋白NcMICl或蛋白NcGRA6的菌株有效地保護(hù)了小鼠免于犬新 孢子蟲感染，但提出了在牛中使用致病菌株的問題。
[0013] ?由能夠誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的源自寄生蟲的蛋白質(zhì)組成的亞單位疫苗。這些 疫苗通常不僅需要存在佐劑而且還需要存在多次追加疫苗接種，并且在經(jīng)疫苗接種的個(gè) 體中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面通常不太有效。已用各種不同的抗原性蛋白質(zhì)進(jìn)行了數(shù)個(gè)疫 苗接種試驗(yàn)。因此，給小鼠接種蛋白NcSRS2阻斷了母-胎傳播（Haldorson等人，Int. J. Parasitol. ,2005年11月，35(13): 1407-15)，并且與弗氏佐劑相聯(lián)合地誘導(dǎo)了近似 于由接種活的犬新孢子蟲速殖子所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答（Staska等人，Infect. Immun.，2005年3月，73(3) : 1321-9)。還在小鼠中用蛋白NcMICl或NcMIC3進(jìn)行了疫苗接 種試驗(yàn)，并且證明了在感染性攻擊后防止了腦感染（Cannas等人，J. Parasitol.，2003年2 月，89(1):44-50 411&6乜1^等人，了.？&四8行〇1.，2005 年6月，91 (3):657-65)。也證明 了，用蛋白Nc-AMAl進(jìn)行免疫接種的小鼠的抗體顯著地減少了犬新孢子蟲的細(xì)胞感染。
[0014] 盡管在牛飼養(yǎng)中的嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)后果，但目前還沒有任何有效、安全且使用簡(jiǎn)單的 疫苗銷售或處于開發(fā)階段。因此，對(duì)于提供同時(shí)是針對(duì)新孢子蟲病有效的、易于使用的和具 有優(yōu)異的無害性的疫苗存在著真正需要。
[0015] 令人驚奇地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在犬新孢子蟲的株系中，單獨(dú)的蛋白NcMIC3的功能的 消除或者NcMIC3和NcMICl這兩種蛋白質(zhì)的功能的消除導(dǎo)致這樣的突變株，其具有感染和 免疫原特性，從而賦予哺乳動(dòng)物以針對(duì)新孢子蟲病的有害效應(yīng)的疫苗保護(hù)。
[0016] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NcMIC3的功能和/或 蛋白NcMICl的功能被消除。
[0017] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)還在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NcMIC3的功能被消 除，尤其是通過基因 ncmic3表達(dá)的抑制，和/或蛋白NcMICl的功能被消除，尤其是通過基 因 ncmicl表達(dá)的抑制。
[0018] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NCMIC3的功能被消 除。
[0019] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NcMICl的功能被消 除。
[0020] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NcMIC3的功能和任選 地蛋白NcMICl的功能被消除。
[0021] 因此，本發(fā)明的目標(biāo)在于新孢子蟲屬物種突變株，其中蛋白NCMIC3的功能被消 除，尤其是通過基因 ncmic3表達(dá)的抑制，和任選地，蛋白NcMICl的功能被消除，尤其是通過 基因 ncmicl表達(dá)的抑制。
[0022] 蛋白質(zhì)是細(xì)胞活性的效應(yīng)子。蛋白質(zhì)功能的消除可以產(chǎn)生自其生物合成的缺乏或 其非功能性。該功能障礙的起源可能與在編碼該蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄期間、在其翻譯期間 或甚至在該蛋白質(zhì)的成熟過程期間（翻譯后修飾）突然發(fā)生的擾亂有關(guān)?；虻娜笔н€說 明了沒有蛋白質(zhì)可以被合成。
[0023] 蛋白NcMICl和NcMIC3是微線體（頂復(fù)門動(dòng)物的分泌細(xì)胞器）的蛋白質(zhì)，所述微 線體在對(duì)宿主細(xì)胞的識(shí)別和粘附中發(fā)揮中心作用。在犬新孢子蟲中，蛋白NcMICl是由包 含4個(gè)外顯子的基因 ncmicl所編碼的具有460個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。NcMICl的多肽序列包 含具有20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，隨后為串聯(lián)的兩個(gè)重復(fù)區(qū)域（48個(gè)氨基酸和44個(gè)氨基酸） (Keller 等人，Infect Immun. 2002 年 6 月，70 (6) : 3187-98) 〇
[0024] 犬新孢子蟲的蛋白NcMIC3由包含單個(gè)外顯子的基因 ncmic3所編碼。該蛋白質(zhì)具 有362個(gè)氨基酸。
[0025] 發(fā)明人已構(gòu)建出了稱為Neo ncmicl-3K0的犬新孢子蟲突變株，其中蛋白NcMICl 的功能和蛋白NcMIC3的功能被消除；突變株Neo ncmic3K0,其中僅蛋白NcMIC3的功能被 消除；和突變株Neo ncmiclKO，其中僅蛋白NcMICl的功能被消除。這三種犬新孢子蟲突變 株是通過毒力基因的靶向和受控的缺失或者通過毒力蛋白的功能的靶向和受控的消除而 獲得的犬新孢子蟲的減毒活株系的首個(gè)實(shí)例。
[0026] 在本發(fā)明中，"蛋白NcMICl的功能被消除"是指要么蛋