本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種病毒檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

手足口病(Hand,food and mouth disease,HFMD)是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見(jiàn)傳染病，易感人群多為學(xué)齡前兒童，以3歲以下年齡組發(fā)病率最高，是我國(guó)法定報(bào)告管理的丙類(lèi)傳染病。該病多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)熱，手、足、口、臀等多部位出現(xiàn)皰疹或皮疹為主要癥狀，少數(shù)病例可致無(wú)菌性腦膜炎、腦干、腦炎、腦脊髓炎、心肌炎、急性遲緩性麻痹、肺水腫和心臟衰竭等重癥表現(xiàn)，多由EV71感染引起，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡，致死原因主要為腦干、腦炎及神經(jīng)源性肺水腫。該病毒的變異性較強(qiáng)，大量研究和臨床實(shí)踐證明，早期有效地發(fā)現(xiàn)、診斷及治療是防治手足口傳染疾病與降低死亡率的關(guān)鍵?，F(xiàn)有EV71檢測(cè)方法難以滿(mǎn)足簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、特異性、結(jié)果顯而易見(jiàn)，且不需要復(fù)雜儀器的要求。

病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其原理是基于檢測(cè)病毒的核酸，該方法選擇性好、靈敏度高。但是PCR技術(shù)技巧性極強(qiáng)，需要專(zhuān)門(mén)人員操作和特定且昂貴的PCR儀器完成檢測(cè)，不具有簡(jiǎn)單、快速、易于便攜的特點(diǎn)，特別并不適合基層的病毒檢測(cè)，同時(shí)該方法目前主要局限于病毒核酸的檢測(cè)，對(duì)于病毒蛋白和完整的病毒粒子的檢測(cè)顯得無(wú)能為力。因此發(fā)展適用于現(xiàn)場(chǎng)的簡(jiǎn)單、快速、高靈敏、抗干擾能力強(qiáng)、無(wú)需任何儀器的病毒檢測(cè)方法是亟待解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于免疫磁分離技術(shù)的可視化的病毒檢測(cè)方法，旨在解決現(xiàn)有病毒檢測(cè)復(fù)雜、易受干擾、耗時(shí)費(fèi)用高、適用場(chǎng)合有限等問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種病毒檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟：

利用不同濃度的雙氧水還原同一濃度的氯金酸制備納米金，獲取納米金標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙珪r(shí)雙氧水的閾值濃度；

提供可與被檢測(cè)病毒結(jié)合的免疫磁球，將所述免疫磁球加入被檢測(cè)樣本溶液中進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含所述免疫磁球的第一復(fù)合物；

向所述第一復(fù)合物中加入所述被檢測(cè)病毒的多克隆抗體進(jìn)行孵育、磁分離后，再加入生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含所述免疫磁球的第二復(fù)合物；

向所述第二復(fù)合物中加入鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物，進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含所述免疫磁球的第三復(fù)合物；

向所述第三復(fù)合物中分別加入閾值濃度的雙氧水和氯金酸進(jìn)行反應(yīng)，生成納米金溶液，根據(jù)所述納米金溶液的顏色，確定所述被檢測(cè)樣本溶液中是否含有所述被檢測(cè)病毒：

當(dāng)所述納米金溶液呈紅色時(shí)，所述被檢測(cè)樣本不含所述被檢測(cè)病毒；

當(dāng)所述納米金溶液呈紫色或藍(lán)色時(shí)，所述被檢測(cè)樣本含所述被檢測(cè)病毒。

本發(fā)明提供的病毒檢測(cè)方法具有如下有益效果：

1、本發(fā)明將免疫磁分離技術(shù)以及納米金的表面等離子體共振效應(yīng)應(yīng)用于病毒的檢測(cè)中，有效地解決了免疫分析方法容易受到復(fù)雜樣品干擾的問(wèn)題，具有抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)。

2、本發(fā)明進(jìn)一步構(gòu)建基于免疫磁球的層層信號(hào)放大策略，提高了免疫分析方法的靈敏度。

3、本發(fā)明利用免疫復(fù)合物中的酶催化作用影響納米金的合成及其等離子體共振效應(yīng)引起的裸眼可視化的顏色變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢測(cè)病毒的可視化檢測(cè)；檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需任何儀器，節(jié)省時(shí)間、降低成本，且能夠?qū)崿F(xiàn)臨床樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。這不僅為病毒的快速檢測(cè)提供了新方法，同時(shí)也為面向基層的快速可視化病毒檢測(cè)提供了新思路，有望為疾病的早期診斷提供新策略。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法原理示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中雙氧水的濃度與形成的納米金顏色的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中不同濃度過(guò)氧化氫酶與形成的納米金顏色的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法的特異性研究結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法定量檢測(cè)研究結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中臨床樣本的檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種病毒檢測(cè)方法。該方法包括如下步驟：

S01：利用不同濃度的雙氧水還原同一濃度的氯金酸制備納米金，獲取納米金標(biāo)準(zhǔn)溶液的顏色由紅色變?yōu)樽仙珪r(shí)雙氧水的閾值濃度；

S02：提供可與被檢測(cè)病毒結(jié)合的免疫磁球，將該免疫磁球加入被檢測(cè)樣本溶液中進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含該免疫磁球的第一復(fù)合物；

S03：向上述第一復(fù)合物中加入被檢測(cè)病毒的多克隆抗體進(jìn)行孵育、磁分離后，再加入生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含上述免疫磁球的第二復(fù)合物；

S04：向上述第二復(fù)合物中加入鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物，進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含上述免疫磁球的第三復(fù)合物；

S05：向上述第三復(fù)合物中分別加入閾值濃度的雙氧水和氯金酸進(jìn)行反應(yīng)，生成納米金溶液，根據(jù)該納米金溶液的顏色，確定被檢測(cè)樣本溶液中是否含有被檢測(cè)病毒：

當(dāng)納米金溶液呈紅色時(shí)，被檢測(cè)樣本不含被檢測(cè)病毒；

當(dāng)納米金溶液呈紫色或藍(lán)色時(shí)，被檢測(cè)樣本含被檢測(cè)病毒。

本發(fā)明實(shí)施例的病毒檢測(cè)方法基于免疫磁放大的構(gòu)建以及納米金表面等離子體共振效應(yīng)引起的裸眼可視化信號(hào)的產(chǎn)生。圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法原理示意圖，根據(jù)圖1所示，當(dāng)存在被檢測(cè)病毒(本實(shí)施例為EV71病毒)時(shí)，免疫反應(yīng)能有序進(jìn)行，過(guò)氧化氫酶能夠通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合在病毒表面，水解加入的雙氧水，從而影響雙氧水還原3價(jià)態(tài)的金離子，形成紫色到藍(lán)色的團(tuán)聚型的納米金溶液；當(dāng)不存在被檢測(cè)病毒(EV71病毒)時(shí)，病毒無(wú)法被修飾有被檢測(cè)病毒的多克隆抗體(本實(shí)施例為抗VP1單克隆抗體)的免疫磁球捕獲，后續(xù)的免疫反應(yīng)無(wú)法發(fā)生，過(guò)氧化氫酶也在加入后被洗脫，無(wú)法催化水解后續(xù)加入的雙氧水，從而不影響雙氧水還原納米金，所形成的納米金為分散的紅色溶液，最終實(shí)現(xiàn)裸眼可視化的被檢測(cè)病毒(EV71病毒)檢測(cè)。

本實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏且無(wú)需任何儀器的可視化病毒檢測(cè)的特點(diǎn)，并且能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。這不僅為病毒的快速檢測(cè)提供了新方法，同時(shí)也為面向基層的快速可視化病毒檢測(cè)提供了新思路，有望為疾病的早期診斷提供新策略。

優(yōu)選地，上述步驟S01中，在室溫條件下，根據(jù)不同濃度雙氧水還原一定濃度的氯金酸，考察其合成納米金顏色的變化，尋找顏色由分散的紅色納米金到紫色時(shí)雙氧水的濃度閾值，該濃度閾值作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雙氧水加入濃度以及氯金酸的加入濃度。同時(shí)還可以進(jìn)一步考察該濃度閾值條件下，雙氧水與不同濃度過(guò)氧化氫酶孵育，考察所形成的納米金顏色變化情況，說(shuō)明過(guò)氧化氫酶水解雙氧水，影響雙氧水還原氯金酸，進(jìn)而影響納米金的尺寸和形貌，引起基于納米金表面等離子體共振效應(yīng)的裸眼可視化顏色的變化

優(yōu)選地，上述步驟S02中，免疫磁球制備過(guò)程為：利用EDC/NHS活化法將被檢測(cè)病毒的單克隆抗體偶聯(lián)到磁性納米球表面，并用含有牛血清白蛋白和疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液保存該免疫磁球。且該磁性納米球表面表面帶羧基，該磁性納米球?yàn)槌槾徘?，直徑?00nm。

EDC/NHS活化法是常見(jiàn)的磁性納米球表面活化法。本實(shí)施中，將EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)分別溶解在MES緩沖液(0.1M MES，0.15M NaCl，pH＝6.5)中，再依次加入到超順磁球中活化表面的羧基。優(yōu)選地，將免疫磁球保存在含有1％牛血清白蛋白和0.05％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中，最終免疫磁球的在磷酸鹽緩沖溶液中濃度為1-2mg/mL，并于4℃保存?zhèn)溆?。上述?yōu)選的制備方法，使該免疫磁球具有更好的免疫吸附效果，既可以將被檢測(cè)病毒的單克隆抗體更好偶聯(lián)到磁性納米球表面，更能在后續(xù)階段更有效地免疫吸附被檢測(cè)病毒。

優(yōu)選地，上述步驟S02中，該免疫磁球加入被檢測(cè)樣本溶液中進(jìn)行孵育的條件為：37℃，150rpm搖床30min。上述步驟S03中，第一復(fù)合物中加入被檢測(cè)病毒的多克隆抗體進(jìn)行孵育的條件為：37℃，150rpm搖床30min，再加入生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育條件為：37℃，150rpm搖床1h。上述步驟S04中，第二復(fù)合物中加入鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物，進(jìn)行孵育條件為：37℃，150rpm搖床1h。該優(yōu)選的孵育條件選擇相結(jié)合的條件下，產(chǎn)生協(xié)同作用，能獲得特異性更強(qiáng)的包含上述免疫磁球的第三復(fù)合物，進(jìn)一步提高后續(xù)雙氧水和氯金酸進(jìn)行反應(yīng)生成納米金的顏色觀(guān)察準(zhǔn)確性，從而有效地提高該病毒檢測(cè)的抗干擾能力。本實(shí)施例中，第三復(fù)合物即為：免疫磁球-病毒-多抗-生物素二抗-鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶的免疫夾心復(fù)合物。

優(yōu)選地，上述步驟S03中，該被檢測(cè)病毒的多克隆抗體和生物素標(biāo)記的二抗質(zhì)量比為：1：2。本實(shí)施例中，優(yōu)選100μL 5μg/mL的多克隆抗體和100μL10μg/mL的生物素標(biāo)記的二抗。在該優(yōu)選的質(zhì)量比范圍內(nèi)，可提高包含上述免疫磁球的第三復(fù)合物的濃度控制，進(jìn)一步適應(yīng)后續(xù)納米金的顏色觀(guān)察。

優(yōu)選地，上述步驟S05中，向第三復(fù)合物中分別加入閾值濃度的雙氧水和氯金酸的體積相等，且氯金酸的濃度為0.40mM時(shí)，雙氧水的閾值濃度為0.36mM。該條件下，更能準(zhǔn)確地觀(guān)察后續(xù)納米金的顏色變化。

優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例提供的病毒檢測(cè)方法中，被檢測(cè)病毒為EV71病毒(Enteroviruse 71，即人腸道病毒71型)，且單克隆抗體為抗VP1(viral protein1，即病毒蛋白1型)單克隆抗體，而多克隆抗體為抗VP1多單克隆抗體。同時(shí)，定量檢測(cè)EV71病毒濃度的吸收波長(zhǎng)為540nm。EV71病毒的檢測(cè)方法不僅為該病毒的快速檢測(cè)提供了新方法，同時(shí)為疾病的早期診斷提供新策略。

本發(fā)明先后進(jìn)行過(guò)多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1雙氧水濃度與合成納米金顏色變化的相關(guān)性構(gòu)建

用1mM，pH＝6.5的2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液配制不同濃度的雙氧水，同時(shí)用該緩沖液配制0.40mM的氯金酸溶液。分別取100μL新配制的不同濃度的雙氧水加入到96孔板中，每個(gè)孔中再加入100μL新配制的氯金酸溶液，混合均勻，室溫下孵育30min，觀(guān)察溶液的顏色，并用酶標(biāo)儀記錄其紫外可見(jiàn)吸收光譜以及540nm處的吸光度變化情況。

其結(jié)果如圖2所示，不同濃度的雙氧水與0.4mM氯金酸共孵育，觀(guān)察最后雙氧水還原氯金酸后的溶液顏色。圖2(a)為孵育30min后，已合成的納米金溶液顯示不同的顏色。并且從紅色到紫色再到藍(lán)色產(chǎn)生了一個(gè)顯著的顏色變化：當(dāng)雙氧水濃度為0.36mM時(shí)，則合成的納米金為紅色溶液，當(dāng)雙氧水濃度低于0.36mM時(shí)，溶液呈現(xiàn)出從紅色到藍(lán)色最后到藍(lán)色的顯著性變化，并且隨著雙氧水濃度越低，溶液顏色越往藍(lán)色波段移動(dòng)。圖2(b)為不同納米金溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜，當(dāng)雙氧水濃度高于0.36mM時(shí)，最大吸收為540nm，且峰形較尖，當(dāng)雙氧水濃度低于0.36mM時(shí)，最大吸收發(fā)生紅移且峰形變寬，吸收光譜的結(jié)果與生成納米金溶液顏色的變化一一對(duì)應(yīng)當(dāng)雙氧水濃度低于0.36mM時(shí)，納米金的表面等離子體共振吸收峰會(huì)發(fā)生顯著地紅移。圖2(c)為紫外可見(jiàn)吸收光譜中吸收波長(zhǎng)為540nm處的吸光度值，當(dāng)雙氧水濃度低于0.36mM時(shí)，540nm處的吸光度會(huì)逐漸降低。圖2(d)和圖2(e)是雙氧水濃度分別為0.36mM和0.32mM時(shí)，形成的納米金電鏡結(jié)果，電鏡結(jié)果表明，雙氧水濃度低于0.36mM時(shí)，形成的納米金為團(tuán)聚型納米金，當(dāng)雙氧水濃度為0.36mM時(shí)，所形成的納米金為分散型納米金。

同時(shí)進(jìn)一步探討了過(guò)氧化氫酶水解雙氧水，影響納米金的形成，將一定濃度的雙氧水與不同濃度過(guò)氧化氫酶孵育，其它實(shí)驗(yàn)過(guò)程與上述保持一致。

其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：圖3(a)為不同濃度的過(guò)氧化氫酶與相同濃度的雙氧水孵育后，再與0.4mM氯金酸反應(yīng)所形成的納米金。基于過(guò)氧化氫酶可以催化水解雙氧水，降低了雙氧水的濃度，從而產(chǎn)生了肉眼可見(jiàn)的納米金顏色的從紅色到紫色再到藍(lán)色的顯著變化。圖3(b)為上述不同納米金溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜。隨著過(guò)氧化氫酶的增加，納米金的表面等離子體共振吸收峰逐漸發(fā)生紅移。圖3(c)為吸收波長(zhǎng)在540nm處的吸光度，與圖3(b)和圖3(a)吻合。

實(shí)施例2EV71病毒的檢測(cè)方法

一種EV71病毒的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

S11：利用實(shí)施例1提供的方法，當(dāng)雙氧水和氯金酸的等體積反應(yīng)，氯金酸的濃度為0.40mM時(shí)，雙氧水的閾值濃度為0.36mM。

S12：制備可與被檢測(cè)EV71病毒結(jié)合的免疫磁球，將該免疫磁球加入被檢測(cè)樣本溶液中進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含該免疫磁球的第一復(fù)合物即免疫磁球-病毒復(fù)合物。具體過(guò)程如下：

取10μL 50mg/mL表面帶羧基的超順磁球(500nm)用pH為7.2，0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌三次，將50mM EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和50mM NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)分別溶解在MES緩沖液(0.1M MES，0.15M NaCl，pH＝6.5)中，再依次加入到超順磁球中(終體積為400μL)于37℃反應(yīng)30min活化表面的羧基。活化的磁球用pH為7.2，0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌三次。接下來(lái)將20μL(0.50mg/mL)單克隆抗VP1抗體加入到活化的磁球中(終體積400μL)于37℃，150rpm搖床上反應(yīng)4h，用pH為7.2，0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌三次出去多余的抗體，將免疫磁球保存在含有1％牛血清白蛋白和0.05％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液中(終體積500μL)，則免疫磁球的濃度為1mg/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取50μL 1mg/mL的上述免疫磁球用PBST(1×PBS緩沖液中包含0.1％的吐溫20，pH為7.4)洗滌三次；將不同濃度的EV71病毒樣品加入到免疫磁球中(終體積100μL)，于37℃，150rpm搖床上反應(yīng)30min，磁分選，再用PBST洗滌三次，得到免疫磁球-病毒復(fù)合物(第一復(fù)合物)。

S13：向上述第一復(fù)合物中加入被檢測(cè)病毒的多克隆抗體進(jìn)行孵育、磁分離后，再加入生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含上述免疫磁球的第二復(fù)合物即免疫夾心復(fù)合物。具體過(guò)程如下：

向第一復(fù)合物中加入100μL 5μg/mL的抗VP1的兔多克隆抗體，于37℃，150rpm搖床上反應(yīng)30min，磁分選，再用PBST洗滌三次，再向其加入100μL10μg/mL的生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，于37℃，150rpm搖床上反應(yīng)1h，所得到的免疫夾心復(fù)合物磁分選后，再用PBST洗滌3次。

S14：向上述第二復(fù)合物中加入鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物，進(jìn)行孵育、磁分離，得到包含上述免疫磁球的第三復(fù)合物即免疫磁球-病毒-多抗-生物素二抗-鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶免疫夾心復(fù)合物。具體過(guò)程如下：

向第二復(fù)合物(免疫夾心復(fù)合物)中加入用2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋的鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物，于37℃，150rpm搖床上反應(yīng)1h，磁分選后，用PBST洗滌三次，再用磷酸鹽緩沖洗滌二次，最后用超純水洗滌一次，得到免疫磁球-病毒-多抗-生物素二抗-鏈霉親和素-過(guò)氧化氫酶免疫夾心復(fù)合物(即第三復(fù)合物)。

S15：向上述第三復(fù)合物中分別加入閾值濃度的雙氧水和氯金酸進(jìn)行反應(yīng)，生成納米金溶液，根據(jù)該納米金溶液的顏色，確定被檢測(cè)樣本溶液中是否含有被檢測(cè)病毒。具體過(guò)程如下：

1mM，pH＝6.5的2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液新鮮配制0.36mM的雙氧水，取100μL 0.36mM的雙氧水加入到上述連接有過(guò)氧化氫酶的第三復(fù)合物中，室溫下孵育30min，磁分選后，吸取清液加入到96孔板中，再向該液體中加入新鮮配制的100μL 0.40mM氯金酸溶液，孵育30min后，裸眼觀(guān)察檢測(cè)液的顏色以及用酶標(biāo)儀測(cè)量其紫外可見(jiàn)吸收光譜以及540nm處的吸光度。

同時(shí)，本實(shí)施例還采用了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。對(duì)于對(duì)照實(shí)驗(yàn)，使用其它常見(jiàn)的腸道病毒，如柯薩奇A2、柯薩奇A6、柯薩奇A16以及?？刹《?8作為陰性對(duì)照樣品，2％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液作為試劑空白，其它操作步驟與上述一致。

本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，圖4(a)為陰性對(duì)照以及陽(yáng)性組實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，很明顯可以看出，只有被檢測(cè)病毒為為EV71病毒時(shí)，所形成的納米金顏色為藍(lán)紫色，其它病毒及試劑空白組為紅色。圖4(b)為其對(duì)應(yīng)的形成納米金的電鏡結(jié)果，標(biāo)尺為200nm。當(dāng)為其它病毒及試劑空白時(shí)，所形成的納米金為分散的納米金顆粒，而當(dāng)被檢測(cè)病毒為EV71時(shí)，則為團(tuán)聚型的較大納米金，該電鏡結(jié)果與納米金的顏色是完全一致的。圖4(c)為所形成的納米金的紫外可見(jiàn)吸收光譜，當(dāng)被檢測(cè)病毒為其它病毒以及試劑空白時(shí)，其最大吸收峰為540nm，吸收峰較窄，而當(dāng)被檢測(cè)病毒為EV71病毒時(shí)，最大發(fā)射峰發(fā)生明顯紅移，且峰形變寬。統(tǒng)計(jì)了吸收波長(zhǎng)在540nm處的降低值，可以發(fā)現(xiàn)，只有被檢測(cè)病毒為EV71時(shí)，其在540nm處吸收波長(zhǎng)的變化值最大，說(shuō)明了方法的特異性好。

圖5為本實(shí)施例提供發(fā)病毒檢測(cè)方法的定量檢測(cè)研究結(jié)果圖。其實(shí)現(xiàn)不同濃度EV71病毒的檢測(cè)，用以考察該方法的檢出限。如圖5所示，隨著EV71病毒濃度的降低，所形成的納米金顏色從紅色到藍(lán)色，最后到紫色圖5(a)，并且能夠與紫外可見(jiàn)吸收光譜的結(jié)果一一對(duì)應(yīng)；吸收光譜結(jié)果圖5(b)顯示，當(dāng)病毒濃度升高時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，峰形變寬，這個(gè)結(jié)果是因?yàn)殡S著病毒濃度升高，偶聯(lián)在免疫復(fù)合物上的過(guò)氧化氫酶會(huì)增加，則能夠水解更多的雙氧水，導(dǎo)致雙氧水濃度降低，影響了后續(xù)氯金酸的還原，導(dǎo)致形成了團(tuán)聚型的納米金，顏色的改變是由于吸收光譜的變化。為了定量檢測(cè)EV71病毒的濃度，將吸收波長(zhǎng)在540nm處的吸光度降低值作為記錄的標(biāo)準(zhǔn)，其540nm處的吸光度的降低值圖5(c)隨著病毒濃度的增加逐漸升高，其線(xiàn)性范圍為0.8-10ng/mL，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.997，其檢出限為0.65ng/mL。

實(shí)施例3臨床樣品的檢測(cè)驗(yàn)證

采集30個(gè)手足口病患兒的咽拭子和肛拭子，包括10例EV71病毒感染的樣本和20例其它病毒感染的樣本，用Hank’s平衡鹽溶液處理后，按照實(shí)施例1和實(shí)施例2中已構(gòu)建的檢測(cè)體系實(shí)現(xiàn)對(duì)EV71病毒的檢測(cè)，并與臨床檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR方法進(jìn)行對(duì)比，說(shuō)明本實(shí)施例提供的方法的可靠性和準(zhǔn)確性。

該檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，其中圖6左邊為檢測(cè)液產(chǎn)生的顏色，可以看出有20個(gè)樣品檢測(cè)液為紅色，有10個(gè)樣品檢測(cè)液為紫色或者藍(lán)紫色。圖6右邊的表格與左圖的a,b,c是統(tǒng)一的，熒光定量PCR的結(jié)果與本發(fā)明實(shí)施例提供的方法的檢測(cè)結(jié)果是完全一致的，并且與吸收波長(zhǎng)在540nm處吸光度的降低值是一致的，說(shuō)明了該發(fā)明能夠有效避免復(fù)雜體系的干擾，具有較強(qiáng)的抗干擾能力且具有高的精準(zhǔn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)臨床樣品的檢測(cè)。

通過(guò)上述實(shí)施例可知，本發(fā)明提供的病毒檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)高靈敏的被檢測(cè)病毒可視化檢測(cè)，其操作簡(jiǎn)單快速，具有抗干擾性強(qiáng)、靈敏度高特點(diǎn)，且無(wú)需任何儀器，為面向基層的病毒檢測(cè)提供了新思路，有望為疾病的早期診斷提供新策略。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。