專利名稱：：Ljungan病毒的檢測方法Ljungan病毒的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種特異性檢測Ljungan病毒(Ljunganvirus,LV)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測LV的方法。本發(fā)明還提供了用于實(shí)行本發(fā)明方法的試劑盒。LV屬于小核糖核酸病毒(Picornavirus)科，因此是一種RNA病毒。LV最初發(fā)現(xiàn)于田鼠類(歐鼦("e^fr/o/7咖^g/areo/M))中，并且能在很多動物中引發(fā)疾病。在編號為W098/11133的國際專利申請中公開了三種分離出的該病毒(87-012，174F和145SL)的分離抹以及每種分離抹的部分序列。后來又發(fā)表了所述三種LV的全序列(JohanssonaA，J.Virol.，2^，8920-8930，2002)。對于LV原型林87-012以及另兩種血清相關(guān)LV分離抹174F和145SL進(jìn)行的比較性序列分析表明，這些新測定的瑞典LV林的基因組彼此緊密相關(guān)，并且具有如下的異常的小核糖核酸病毒樣結(jié)構(gòu)(Johanssone,a人，2002,同上)5，UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3，UTR。系統(tǒng)發(fā)生分析表明所述LV分離抹包含一個(gè)獨(dú)特的單源群，這和副腸孤病毒屬(戶"ec力oW/7^)其他種相同，而與小核糖核酸病毒科(戶/c蹈'r油e)的其他成員不同(Johansson"s/.，2002，同上；UndbergandJohansson,VirusRes"經(jīng)，61-70，2002)。再者，從捕于美國俄勒岡州的另一種田鼠(Wcrofzw體內(nèi)分離的另一病毒M1146的全基因組序列表明，這種病毒也是小核糖核酸病毒科的一個(gè)成員，它與在瑞典分離到的LV最相近，并且是獨(dú)特的LV族中的一個(gè)新的基因型(Johansson"a/.，J.Gen.Virol.，肘，837-844,2003)。發(fā)現(xiàn)LV也存在于人體中，并引起多種疾病。在瑞典和北美的田鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)LV表明LV存在于廣大地理范圍內(nèi)的許多田鼠群落中。目前，存在有七種已知的LV，分別為源于瑞典的87-012(NC003976;AF327920)、174F(AF327921)、145SL(AF327922)和342SL(B.Niklasson，未發(fā)表的數(shù)據(jù))，以及源于美國的M1146(AF538689)、NY64-7855(未發(fā)表的數(shù)據(jù))NY64-7947(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。括號中顯示的是其NCBI基因庫(NCBIGenBank)編號或其他來源。LV的基因組及其編碼的多聚蛋白在遺傳上表現(xiàn)出一些異常的特征，例如缺少預(yù)期的VPO的成熟切割，VPO中具有通常存在于其他小核糖核酸病毒VP1中的保守序列決定子，以及兩個(gè)無關(guān)的2A蛋白——2A1和2A2(Johanssona人，2002，同上)的聚蔟。所述2A1蛋白與心病毒(cardiovirus)，鼻病毒(erbovirus)，豬腸病毒(teschovirus)及口齊病毒(aphthoviruses)的2A蛋白相關(guān)，所述2A2蛋白與副腸孤病毒，峰病毒(kobuviruses)及禽腦脊髓炎病毒(avianencephalomyelitisvirus)的2A蛋白相關(guān)(Johanssone"/.，2002，同上；LindbergandJohansson:VirusRes.，85，61-70，2002)。LV的特征在于在其嚙齒動物宿主及儲存宿主中引起慢性或長期的感染。LV能感染不同種類的動物和人,且其感染可能成為長期或慢性的感染。LV在多種組織培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，產(chǎn)生具有分離的致細(xì)胞病變效果(CPE)的慢性感染以及低病毒產(chǎn)量(每毫升上清液中1000-100000病毒顆粒的量級)。實(shí)驗(yàn)室條件下的病毒培養(yǎng)獲得的數(shù)據(jù)表明LV可在源自不同組織和不同物種的多種細(xì)胞系中生長/復(fù)制，例如猴腎Vero細(xì)胞；猴腎VeroE6細(xì)胞；猴腎MA-104細(xì)胞；猴腎CV-1細(xì)胞；猴腎GMK細(xì)胞；人肺A-549細(xì)胞；人子宮頸組織Hela細(xì)胞；倉鼠腎BHK21細(xì)胞；人肌肉RD細(xì)胞；以及鼠皮膚L-細(xì)胞。在動物和人中，LV可在包括心臟組織的肌肉組織，包括大腦的神經(jīng)細(xì)胞，以及包括胰腺P細(xì)胞、曱狀腺和腎上腺的內(nèi)分泌腺中進(jìn)行復(fù)制。在人體、田鼠、旅鼠、實(shí)驗(yàn)室小鼠、兔、豚鼠、北極狐和駝鹿中用LV特異性免疫組織化學(xué)測試和薄切片電鏡檢測病毒，獲得的數(shù)據(jù)表明LV存在于內(nèi)分泌和外分泌胰腺組織，血管內(nèi)皮細(xì)胞，腦細(xì)胞(包括神經(jīng)組織)，肝細(xì)胞，胎盤和臍帶細(xì)胞，肌肉組織，心臟組織以及甲狀腺組織中(Niklassonetal.，AnnNYAcadSci，1005，170-175,2003;以及未發(fā)表的數(shù)據(jù))。因此可以推斷出LV可以在體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞類型中生長，因此能感染身體的全部器官。與LV最相近的動物病毒是心病毒屬中的病毒。浙諸心病毒屬于小核糖核酸病毒科。心病毒以嚙齒動物作為其天然儲存宿主。心病毒能在很多種動物中引發(fā)疾病。心病毒能在與LV所感染并引發(fā)疾病的器官的相同器官中感染并引發(fā)疾病。心病毒和LV在遺傳上不相近。LV的兩種2A不存在于心病毒中。心病毒在血清學(xué)上與LV不相關(guān)。心病毒在感染非嚙齒動物時(shí)引發(fā)急性病(而非長期或慢性疾病)。心病毒不經(jīng)適應(yīng)就能很容易地在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)，而LV如果不經(jīng)過在組織培養(yǎng)中盲傳或在乳小鼠中第一次傳代和在組織培養(yǎng)中經(jīng)乳小鼠中的多次傳代的適應(yīng)，就幾乎無法培養(yǎng)(見Johansson"a/.，BBRC，317，1023-1029,2004)。心病毒通常不感染人類(只在文獻(xiàn)中有極少的案例報(bào)道，例如，Zimmerman,Encephalomyocarditis，InHandbook:SeriesofZoonoses,G.B.Beran(Ed.)，CRCPressInc.,BocaRaton,Florida,USA,1994-'和Tesh，Am.J.Trop.Med.Hyg.，H，144-149,1978)。很可能在不同的大陸會發(fā)現(xiàn)新的LV變種。因?yàn)長V和多種疾病有關(guān)，因此人們希望有一種簡單有效的方法用以檢測LV。這種方法應(yīng)特異性地檢測出LV而非其他的小核糖核酸病毒。再者，人們希望這種方法能夠用于檢測所有的LV病毒林，并且是高特異性和高敏感性的。人們還希望該方法能夠定量測量LV從而確定其病毒載量。在編號為W02004/073710的國際專利申請中，公開了一種抗病毒劑用于治療LV感染引發(fā)的疾病的的用途。通過檢測LV的存在，尤其是定量的檢測，這種治療的效果能得到監(jiān)測。目前對于LV的檢測或者非常麻煩，例如，病毒培養(yǎng)/分離并檢測CPE，或者不夠敏感，例如，用免疫組織化學(xué)并不能檢測到所有的LV也不能有效地區(qū)分出LV和其他的小核糖核酸病毒。因此需要有一種筒單高效的方法用以特異性檢測LV。本發(fā)明提供了一種檢測LV的方法，所述方法包括檢測一段核酸序列，所述核酸序列包括以下序列中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸CTGCRYAGGTGGCTTTCACCTCTSGACAGYGC(SEQIDNO.1)。所述方法被設(shè)計(jì)用于特異性檢測所有LV。通過檢測SEQIDNO.1或其反向互補(bǔ)序列中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的存在，可以特異性地檢測到所有的LV。特別地，該方法不檢測出非Ljungan的小核糖核酸病毒。SEQIDNO.1存在于LV的5'UTR中，并在所有已知LV病^林中都;l:保守的。該序列與其它非Ljungan的小核糖核酸病毒中的相應(yīng)序列具有足夠的差異性，從而保證只檢測出LV。術(shù)語LV的定義如上所述，且優(yōu)選地表示一種在其基因組中編碼兩個(gè)不相關(guān)2A蛋白的小核糖核酸病毒。確定一種病毒是否編碼兩個(gè)不相關(guān)2A蛋白的方法在Lindbergetal.，VirusRes.，旦，61-70，2002中有記載。術(shù)語LV包含所有已知的LV以及將被識別出的LV。識別新的LV的方法記載在編號為W02004/073710的國際專利申請中。待檢測的核酸序列可以是一段DM或RM序列。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見的，如果檢測一段RM序列，則序列中的胸腺嘧咬脫氧核苷酸應(yīng)為尿嘧咬核苷酸。優(yōu)選地檢測cDM序列。如以下所述，LVRNA可用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)所檢測的是哪一種核酸，用本發(fā)明所述的方法也可以檢測SEQIDNO.1的反向互補(bǔ)序列。SEQIDNO.1的反向互補(bǔ)序列為GCRCTGTCSAGAGGTGAAAGCCACCTRYGCAG(SEQIDNO.2)。被檢測的核酸序列包括SEQIDNO.1或其反向互補(bǔ)序列中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地，祐:檢測的核酸序列包括至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選地，至少17個(gè)連續(xù)的核苷酸。特別優(yōu)選地，被檢測的核酸序列包含以下序列GCTTTCACCTCTSGACA(SEQIDNO.3)或其反向互補(bǔ)序列。SEQIDNO.3的反向互補(bǔ)序列為TGTCSAGAGGTGAAAGC(SEQIDNO.4)。本發(fā)明的核酸序列中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語，R為A或G，Y為C或T，S為G或C。用這些術(shù)語引入序列中的小變化是為了保證所有LV都可以用本發(fā)明的方法檢測到。可以用任何合適的技本險(xiǎn)測所述核酸序列。優(yōu)選地，可以用能特異結(jié)合所述核酸序列的一個(gè)或多個(gè)探針檢測所述核酸序列。尤其是當(dāng)所述被檢測的核酸序列在序列上可能存在變化時(shí)，可以4吏用不止一種探針。例如，當(dāng)所述被檢測的核酸序列包括SEQIDNO.3時(shí)，優(yōu)選地使用2種探針。第一種探針可特異地與GCTTTCACCTCTGGACA(SEQIDNO.5)退火，第二種探針可特異地與GCTTTCACCTCTCGACA(SEQIDNO.6)退火，從而4吏該序列的兩種版本都能>^檢測到。優(yōu)選地，第一種探針具有如下序列TGTCCAGAGGTGAAAGC(SEQIDNO.7)，第二種探針具有如下序列TGTCGAGAGGTGAAAGC(SEQIDNO.8)。或者，可以用一種能夠與SEQIDNO.5和6都發(fā)生退火的探針。已知SEQIDNO.1中存在可用來辨別LV分離林的多態(tài)性。例如，SEQIDN0.l中的第24號殘M瑞典的LV分離林中是G，而在美國的LV分離抹中是C。通過針對不同序列的差異標(biāo)記的^針，可以確定存在哪種類型的LV甚至確定分離林的不同類型間的比例。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)探針為具有被檢測序列的互補(bǔ)序列的核酸探針(寡探針)。術(shù)語"互補(bǔ)序列，，表示一段序列，其中基本上所有的(優(yōu)選所有的)核苷酸4^J^可以與被檢測的核酸序列中的核普酸威基配對。所述探針可用是任何合適的大小，但優(yōu)選地，其長度小于25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，其長度小于20個(gè)核苷酸，最優(yōu)選地，其長度為17個(gè)核苷酸或更小。特別優(yōu)選地，通過使用合適的多環(huán)反應(yīng)物，使所述探針結(jié)合到被檢測核酸的小溝。通過結(jié)合到小溝，提高了該探針的解鏈溫度，從而可能設(shè)計(jì)出相對較短的探針(長度小于25個(gè)核香酸)。由于LVs與其他小核糖核酸病^^序列上的相似性，需務(wù)使用相對較短的探針使得能夠檢測到LV獨(dú)有的序列。探針可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA包括正鏈(plus-sense)RNA探針，負(fù)鏈(minus-sense)RM探針和反義(antisense)RNA探針。合適的核酸標(biāo)記包括放射性的和非放射性的標(biāo)記，例如熒光，間接檢測系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光。核酸的標(biāo)記可使用諸如標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊上所述的技術(shù)(例如，Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarbor,1989或CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，F(xiàn).M.，regularlyupdated))或用眾多的商業(yè)試劑盒中的一種，諸如Promega(Southampton,Hampshire,UK),Roche(Lewes,EastSussex,UK),Ambion(Huntingdon,Cambridgeshire,UK)以及BDBiosciences/Clontech(SanJose，CA，USA)。放射性標(biāo)記包括32P，"P，35S，125I,3H,或任何其他i文射性同位素。核酸可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的一種進(jìn)行放射性標(biāo)記，包括5，端標(biāo)記，3，端標(biāo)記，缺口平移和使用例如隨機(jī)六聚體和隨機(jī)八聚體的隨機(jī)引物標(biāo)記。熒光標(biāo)記包括熒光素、Cy5、Cy5.5和FAM(6-羧基熒光素)，或任何其他焚光染料，如TET(四氯-6-氣基熒光素)、J0E(二曱氧基-4，5二氯-6-氛基熒光素)和HEX(六氯-6-氛基熒光素)。存在基于樹枝狀聚合物的標(biāo)記系統(tǒng)。這種標(biāo)記方法使用一種樹枝狀聚合物用于連接200個(gè)或更多的熒光標(biāo)記使得能夠檢測到很少量的目標(biāo)分子。這種樹枝狀聚合物技術(shù)是由例如Genisphere,Bala，Cynwyd，PA，USA研發(fā)的。另外，可以使用已知的顆粒標(biāo)記，例如商品名為"QuantumDots"或"LuminexBeads"的納米顆粒。QuantumDots可以從例如QuantumDotCorporation,Hayward，CA，USA獲取。W000/18965公開了用于檢測突變或多態(tài)現(xiàn)象的存在的方法。特別地，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光標(biāo)記的寡核苷酸雜交探針，基于雜交探針的解鏈曲線分析而識別突變和多態(tài)現(xiàn)象。所用的熒光基團(tuán)是本領(lǐng)域所知的眾多不同化合物中的一種，包括溴化乙錠、Y0-PR0-1和SYBRGreenI。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET腺賴于兩個(gè)鄰近的雜交探4f的退火(LayandWittwer，Clin.Chem.，43，2262-2267，1997)。第一個(gè)探針在其3，端包含一個(gè)供體染料，另一個(gè)在其5，端包含一個(gè)受體染料。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程中，當(dāng)通過外源提供光時(shí)，供體染料被活化并將能量轉(zhuǎn)移到該受體染料。只有當(dāng)兩個(gè)探針在很近的距離退火時(shí)，才可能發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。因此，這一技術(shù)使得能夠檢測互補(bǔ)探針與特異序列的結(jié)合。另一檢測系統(tǒng)包括利用外切核酸酶探針。這種探針包括一個(gè)凈艮告子和一種猝滅染料，其中該猝滅染料阻止來自報(bào)告子的任何信號。該探針在一些方法中使用，這些方法中含有目標(biāo)序列的區(qū)域用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。該探針結(jié)合到所需的目標(biāo)位點(diǎn)，并且當(dāng)聚合酶作用于該探針時(shí)，它將該探針作為障礙物并通過將其斷裂為碎片將其移除。這樣該猝滅劑與該報(bào)告子分離開，從而可檢測到該報(bào)告子。間接檢測系統(tǒng)包括通過通過內(nèi)部摻入，末端標(biāo)記，或者是化學(xué)^多飾，將半抗原修飾的核苷酸摻入進(jìn)一個(gè)探針分子中。半抗原的例子包括洋地黃毒苷、生物素、磺化威基和二硝基苯酚。在將半抗原摻入探針后，就可用一個(gè)與一種信號酶如堿性辦酸酶共價(jià)偶聯(lián)的親和配體檢測到半抗原。常用的配體包括鏈霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白(親和素)和抗體(單克隆和多克隆)。或者，可以使用一種與生物素共價(jià)結(jié)合的核酸嵌入部分，補(bǔ)骨脂素。該補(bǔ)骨脂素-生物素嵌入至核酸(單鏈或雙鏈)中，并隨后通過用長波紫外光的照射而共價(jià)結(jié)合。直接檢測方法利用了信號酶與核酸探針的直接共價(jià)連接，所述核酸探針通常為一段合成的寡核苷酸。這種直接連接不需要添加第二反應(yīng)物，從而降低檢測步驟數(shù)及信噪比的問題。所述信號酶，例如生物素，可以直接通過與生物素基化引物的酶聚合作用或者生物素基化核苷酸三磷酸存在下的聚合作用摻入至核酸探針中?？梢杂脦r藻糖標(biāo)記系統(tǒng)，通過連接一個(gè)普遍的可用光或熱激活的并且可與任何巰基反應(yīng)性化合物相連接的部分，從而將半抗原，熒光染料或親和配體偶聯(lián)到任何核酸中。巖藻糖標(biāo)記試劑盒，例如TheFastTagNucleicAcidLabellingSystem,可從VectorLaboratories,Inc.,Burlingame,CA,USA獲得。優(yōu)選地，所述探針是單鏈DM探針。由于LV是一種RNA病毒，所以優(yōu)選地在檢測核酸序列之前先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄是一項(xiàng)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一段DNA引物退火至所述RNA序列上，并通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用延伸該引物。所述引物的序列必須與所述RNA序列互補(bǔ)。該引物必須退火至RM序列的某個(gè)位置上以保證產(chǎn)生包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)核苷酸的cDNA序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地確定能用于產(chǎn)生這樣的DM序列的合適引物。優(yōu)選地，所述引物退火至LV的鄰近SEQIDNO.1的一段保守序列，例如，距SEQIDNO.1200個(gè)核普酸的距離以內(nèi)。通過退火至LV的一段保守序列，可以提高本方法的特異性。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用包含序列GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(SEQIDNO.9)的引物來反轉(zhuǎn)錄Ljungan病毒RNA。通過反轉(zhuǎn)錄Ljungan病毒RNA可以改進(jìn)該檢測方法，因?yàn)橐锿嘶鹬了霾《綬NA的特異性提高了該方法的特異性水平。不僅所述病毒RM必須具有與該引物互補(bǔ)的序列，而且反轉(zhuǎn)錄的DNA序列必須包括SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。特別優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括(a)反轉(zhuǎn)錄LVRNA，從而得到一段包括SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列；(b)擴(kuò)增所述DNA序列；并且(c)檢測所述擴(kuò)增出的DNA序列的存在。如上所述，所述擴(kuò)增出的DNA序列可以用任何已知的方法檢測到。優(yōu)選地，用探針檢測所述擴(kuò)增出的DM序列。所述LVRM可以是任何的RNA，只要其^H轉(zhuǎn)錄后能得到一段包括SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列。所述LVRNA可以按上述方法進(jìn)4于反轉(zhuǎn)錄。通過反轉(zhuǎn)錄得到的DNA序列可以用任何合適的方法擴(kuò)增。優(yōu)選地，用聚合8|#_反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增所述DNA序列。在所述PCR反應(yīng)中，可以用任何合適的引物擴(kuò)增包括SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列。為提高本方法的特異性，優(yōu)選地，選擇用于擴(kuò)增所述包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列的引物，從而保證只擴(kuò)增從LVRM反轉(zhuǎn)錄得到的DM而不擴(kuò)增來自其他病毒的RNA或DNA。引物間的距離根據(jù)用于擴(kuò)增所述DNA序列的Taq聚合酶的限度而定。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增所述DM序列的引物距離小于200個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增所述包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸DNA序列的引物包括一肚向引物，具有序列TAGGGGCTGTACCCGGGCGGTCCCACTCTTCACAG(SEQIDNO.IO)或其中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸；以及一段反向引物，具有序列GACATGCCTTTTGGGCCCAGAGGCTAGTGTTACCACTAGGGG(SEQIDNO.ll)或其中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地，所述正向引物包括SEQIDNO.10中至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地，所述反向引物包括SEQIDNO.11中至少15個(gè)連續(xù)的核苷酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述正向引物具有如下序列GCGGTCCCACTCTTCACAG(SEQIDNO.12)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所迷反向引物具有如下序列GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA((SEQIDNO.9)。優(yōu)選地，所述用于PCR中的反向引物與所述用于反轉(zhuǎn)錄該LVRM的引物相同，從而使得對LVRNA的RT-PCR只用到2種引物，優(yōu)選地為上述的正向和反向引物。特別優(yōu)選的是進(jìn)行定量PCR，從而能夠確定一個(gè)樣品中LV的量。再者，通過能夠確定樣品中LV的量，從而能夠確定LV病毒感染的itJL和消退。這使得研究人員能夠監(jiān)測治療的效果。定量PCR的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。尤其是實(shí)時(shí)PCR方法和動態(tài)PCR方法。特別優(yōu)選的是所進(jìn)行的PCR方法為一種使用外切核酸酶探針(也叫作TaqMan探針)的實(shí)時(shí)PCR方法。外切核酸酶的j吏用如前所述。本發(fā)明的方法可以對任何被懷疑感染有LV的樣品進(jìn)4亍。合適的樣品包括組織樣品和體液樣品。特別優(yōu)選的樣品包括肌肉組織樣品尤其是心肌組織，神經(jīng)細(xì)胞樣品尤其是腦細(xì)胞，內(nèi)分泌腺樣品如月兔腺P細(xì)胞、甲狀腺或腎上腺樣品以及白細(xì)胞(例如，血沉棕黃層)。白細(xì)胞是最優(yōu)選的樣品?？梢杂萌魏螛?biāo)準(zhǔn)的方法從這些樣品中提取出RM，例如使用QIAamp病毒RNA試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種檢測樣品中LV的方法，包括(a)>^樣品中分離RNA;(b)反轉(zhuǎn)錄所述RNA得到一段包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列；并且(c)用外切核酸酶探針進(jìn)行定量PCR。本發(fā)明還提供了一個(gè)用于實(shí)行本發(fā)明所述方法的試劑盒，其中所述試劑盒包括至少一個(gè)標(biāo)記探針，該探針能特異性結(jié)合SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地，所ii^發(fā)明的試劑盒還包括引物，該引物用于擴(kuò)增包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的核酸序列，以及用于擴(kuò)增該核酸序列所必需的試劑。合適的試劑已為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，這些試劑包括緩沖液，Taq聚合酶和脫氧核普酸。所述試劑盒也可包括引物，該引物用于反轉(zhuǎn)錄LVRM從而得到一段包含SEQIDNO.1中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DM序列，以及用于反轉(zhuǎn)錄所述RNA所必需的試劑。合適的試劑已為;^U頁域的才支術(shù)人員所熟知，這些試劑包括纟爰沖液，反轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核苷酸。參考以下實(shí)施例，并參考以下附圖對本發(fā)明進(jìn)行說明。圖1顯示的是一條LV實(shí)時(shí)PCR分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對1到106拷貝(cps)的LV插入對照質(zhì)粒J^f亍PCR反應(yīng)，#^一稀釋濃度的6次重復(fù)的每一次的循環(huán)閾值(Ct)對logl。(相應(yīng)的起始模板濃度)作圖。圖2顯示不同小鼠器官(腦，心臟，肝n=6;胰，肺n=5;腎n=4)中的Ljungan病毒(LV)RNA，這些器官來自LV感染6天后的小鼠；將病毒載量標(biāo)準(zhǔn)化為每1ng提取的總RNA中的含量(平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。如本文所述用RT-TaqManPCR測定病毒的正鏈RNA。圖3表示不同器官中的Ljungan病毒(LV)RNA(感染后13天:^后腦，心臟，肺，肝n=4;胰，腎，脾，糞便n=3;其他時(shí)間點(diǎn)的所有器官n=2)，這些器官來自LV感染的暴露于應(yīng)激中的雄性實(shí)驗(yàn)室小鼠；將病毒載量標(biāo)準(zhǔn)化為每1ng提取的總RM中的含量(平均值，為使圖片清晰未顯示標(biāo)準(zhǔn)誤差)。如本文所述用RT-TaqManPCR測定病毒的正鏈RM。實(shí)施例實(shí)施例1實(shí)^i殳計(jì)及樣本如先前所述(Niklasson"a/.，Virology,255,86-93,1999)，從來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的田鼠(bankvole)的BHK-21細(xì)胞中分離LV。將該細(xì)胞培養(yǎng)上清:^綠猴腎細(xì)胞(ATCC)中傳代或者腦內(nèi)注射到1天大的乳小鼠中，以便進(jìn)^f"殖。從乳小鼠腦(SMB)制備的來自LV原型抹87-012的RNA被作為外標(biāo)PCR對照(TCID50:6.2x103)用于測試所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析。用自制的LV插入重組質(zhì)粒的10倍連續(xù)稀釋產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用下述材料進(jìn)行特異性測試用分離自六種不同LV病毒抹原液的病毒RNA作為陽性對照，用來自19種感染不同病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的核酸、兩個(gè)臨床樣本和其他病毒(包括最相近的1型人副腸孤病毒(HumanParechovirustype1)、腦心肌炎病毒-EMCV和小鼠腦脊髓炎病毒(Theiler，sMurineEncephalomyelitisvirus)-TMEV)的羅標(biāo)準(zhǔn)品作為陰性對照(見表2)。用所述新的PCR分析來確定60種不同組織樣品中(采集自腦，肝，肺，腎，胰和心臟)是否存在LV感染，所述組織樣品來自六只JtM內(nèi)感染LV病毒林145SL—周后處死的小鼠和四只處死的未感染的小鼠；五只實(shí)驗(yàn)室小鼠的胎盤樣品，該小鼠在懷孕期間感染LV并出現(xiàn)胚胎死亡(IUD)癥狀；四個(gè)瑞典患者的六種不同樣品(胎盤/臍帶)，這些患者患有先前通過IHC發(fā)現(xiàn)為LV陽性的先兆子癇(pre-eclampsia);以及一個(gè)來自豬的SMB分離林(SMB941)，先前通過半巢式RT-PCR發(fā)現(xiàn)所述豬為LV陽性(所有的樣品均由ApodemusAB，Stockholm,Sweden友情提供)。寡核苷酸i史計(jì)和合成細(xì)致地設(shè)計(jì)引物和小溝結(jié)合子(MGB)探針。所選的引物系列用于擴(kuò)增所述LV基因組5，未翻譯區(qū)(5，-UTR)的一段187-bp的片段。在引物和探針的比對研究(alignmentstudy)中包括了以下的LV核苷酸序列(附有相應(yīng)的NCBIGeneBank編號或者其他來源)LV87-012(編號NC003976;AF327920),174F(編號:AF327921)，145SL(編號:AF327922),M1146(編號AF538689)，及NY64-7855(^Ml表的數(shù)據(jù))。所使用的探針為5，-GCGGTCCCACTCTTCACAG-3，(SEQIDNO.12)(正向，nt255-274)以及5，-GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA-3，(SEQIDNO.9)(反向，nt442-424)。擴(kuò)增子特異性MGB探針為5，-TGTCCAGAGGTGAAAGC-3，(SEQIDNO-7)(MGBc，nt306-290)以及5，-TGTCGAGAGGTGAAAGC-3，(SEQIDNO.8)(MGBg，nt306-290),這兩個(gè)MGB探針的5'端標(biāo)記有焚光報(bào)告染料FAM(6-羧基熒光素)，3'端標(biāo)記有黑色猝滅劑(darkquencher)MGB(小溝結(jié)合子)。核苷酸位置參照NCBI序列GeneBank編號NC003976的位置。引物從TIBM0LBI0L,Berlin,Germany獲取,探針從AppliedBiosystems，Warrington-Cheshire，UK獲取。RM提取和cDNA合成樣品中的RNA可以用不同的市售試劑盒(如Qiagen)分離，或者特別針對成纖維(fibrogen)組織樣品，用通過CsCl緩沖液超速離心硫氰^溶胞產(chǎn)物的Chirgwin的方法(Chirgwinefa/.，Biochemistry,18，5294-5299,1979)。在樣品勻漿過程中用Schowengerdt"a人，J.HeartLungTransplant.,15，111-123,1996中所述的方法控制污染。用5ju1的樣品RNA在一個(gè)最g積為10|i1的反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDM，所述反應(yīng)體系含有50mMTris-HCl(pH8.3)，75mMKCl，3.OmMMgCl2，0.125mM的每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP,10mM二硫蘇糖醇，10U的RNasin(Promega,Mannheim,Germany),50U的鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)以及0.125pM反向引物。在BiometraTRIO的溫控循環(huán)儀(thermoblockcycler)(Biometra，G6ttingen，Germany)上進(jìn)4亍^^應(yīng)，循環(huán)^lt為60。C5min，37t!20min及95。C5min。實(shí)時(shí)PCR在96孔微量滴定板(ABgene，Epsom-Surrey，UK)中進(jìn)行TaqMan-PCR。用于PCR的混合物糾積為25|ul，包括2.5jilcDNA才莫板，50mMTris-HCl(pH9)，50mMKC1,4mMMgCl2，0.2mM的每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP，0.5U的尿嘧咬-N-糖基化酶(艦)(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)，1.25U的Taq■聚合酶(Invitrogen，Karlsruhe,Germany),0.1jjM的每種正向和反向引物，0.1jaM的每種所述焚光標(biāo)記的MGB探針，以及1.0jiM的ROX作為參比熒光(passivereference)。在用UNG處理后，為避免擴(kuò)增子交叉污染，所述DNA在5(TC處理2min，4L后在95。C處理lOmin進(jìn)4亍初始變性，然后在ABIPrism7700SequenceDetector(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,Ca.，USA)上通過35個(gè)兩步循環(huán)(95。C，15秒；60。C，30秒)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)Radonic，Biochem.Biophys.Res.Commun.，313，856—862，2004中所述方法，通過兩個(gè)參比基因定量實(shí)時(shí)RT-PCR測定，檢測從臨床樣品中制備的RNA的質(zhì)量，所述兩個(gè)測定特異性針對人甘油醛-3-磷自氫酶(GAPDH)以及RNA聚合酶n(RPII)。自制的LV插入對照質(zhì)粒的生成用瓊脂糖皿電泳檢查來自LV87-012的外標(biāo)PCR對照的Taq聚l合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。從瓊脂糖皿上切下單條不連續(xù)的187-bp帶，然后根據(jù)廠商說明，用QIAquick^MilL取試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)^:取該帶中的PCR產(chǎn)物。將提取出的PCR產(chǎn)物克隆到載體質(zhì)粒上，并才艮據(jù)廠商i兌明(Invitrogen，Karlsruhe,Germany)用pcDM3.1/V5-His-T0P0TA表達(dá)試劑盒將其轉(zhuǎn)化進(jìn);桿菌(五co/y)細(xì)胞中進(jìn)行增殖。使用T7和BGH測序引物實(shí)現(xiàn)187-bp片段的插入對照。根據(jù)廠商的說明，使用QIAGENPlasmidMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從;^M桿菌陽性菌落中分離帶有LV插入物的質(zhì)粒。序列分析用QIAquick凝M^^取試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)純化擴(kuò)增子，并在377DM自動測序4義(AppliedBiosystems,FosterCity,UK)上用BigDye終止子循環(huán)領(lǐng)'J序試劑盒(AppliedBiosystems，Warrington-Cheshire,UK)直接測序，并用NCBIBLAST軟件(www,ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將我們自制的LV插入質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋，每個(gè)稀釋濃度重復(fù)6次，從而繪制一條對于不同稀釋濃度的循環(huán)閾值(Ct)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。代束性的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，在六個(gè)數(shù)量級范圍內(nèi)即1到106拷貝/檢測的范圍內(nèi)，實(shí)時(shí)PCR測試間存在高度的線性相關(guān)，檢出P艮度為10個(gè)拷貝(R2=0.9956)。由一個(gè)^作者在一個(gè)實(shí)驗(yàn)(三個(gè)系列)中處理所述自制LV插入質(zhì)粒(IO1、102和103拷貝/檢測)的病毒陽性對照六次，從而評估試驗(yàn)內(nèi)精密度，而試驗(yàn)間精密度的評估則是由三個(gè)不同操作者(每人一個(gè)系列)在三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中處理相同的對照六次。在表l中對比了每次測試的平均CT值和標(biāo)準(zhǔn)差，并表明這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的可重復(fù)性。使用從六個(gè)不同的LV病毒林中純化的RNA作為陽性對照，再用來自22種不同病毒樣品的核酸作為陰性對照，從而評價(jià)本方法的特異性。在PCR中所有LVcDM樣品均為陽性，且擴(kuò)增子可以被分離用于序列分析，而在實(shí)時(shí)PCR分析中沒有任何一個(gè)陰性對照表現(xiàn)出假陽性信號(表2)。所述陽性PCR結(jié)果可由PCR產(chǎn)物的序列分析進(jìn)一步確證，并可被區(qū)分為"瑞典LV病毒抹"和"非瑞典LV病毒林"(數(shù)據(jù)未示出)。這種新的定量實(shí)時(shí)RT-PCR分沖/H皮用于發(fā)逸來自嚙齒動物和人的不同樣品類型中是否存在LV感染。將六只實(shí)驗(yàn)室小鼠內(nèi)感染LV病毒林145SL并于一周后處死，在采集自所述實(shí)驗(yàn)室小鼠的不同器官的36個(gè)組織樣品中有33個(gè)(92%)在PCR篩選中表現(xiàn)為LV陽性?？稍谀X組織樣品中發(fā)現(xiàn)高病毒載量，就初始樣品重量而言，每mg組織有高達(dá)10'份病毒拷貝，而四只未感染的實(shí)驗(yàn)室小鼠的任何被測器官都無陽性結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。此外，在五只孕期感染LV并表現(xiàn)出IUD癥狀的實(shí)驗(yàn)室小鼠的所有胎盤樣品中，都可用所述新方法檢測出LV基因組序列，其病毒載量在每mg組織2.4x103到5.(^106個(gè)病##貝之間，平均1.8乂106個(gè)病4#貝(數(shù)據(jù)未示出)。此外，可以用所述實(shí)時(shí)RT-PCR方法證實(shí)以下這些樣品中存在LV基因組序列(表3):包括四個(gè)瑞典患者的六個(gè)胎盤/臍帶樣品中的兩個(gè)，這些患者患有先前通過IHC發(fā)現(xiàn)為LV陽性的先兆子癇，以及一個(gè)分離自豬(SMB941)的SMB,先前通過半巢式RT-PCR發(fā)現(xiàn)所述豬為LV陽性。作為對比，在所有測試中使用的LV87-012的LV外標(biāo)PCR對照中的病毒載量(見表2)比在那些弱陽'性樣品中的量高70倍。而所述陽性PCR結(jié)果可以由PCR產(chǎn)物的序列分析具有與LV原型病毒株87-012高于98%的同源性得到證實(shí)(數(shù)據(jù)未示出)。討論由于LV是由嚙齒動物攜帶的人類疾病的病原體，因此需要一種可靠且靈敏的測定方法，用于檢測動物和人的不同組織或體液中的病毒。以下是設(shè)計(jì)所述5，-UTR-PCR測定法最重要的三個(gè)任務(wù)1.尋找5，-UTR中合適的/保守的目標(biāo)序列，該序列對所有LV病毒林具有特異性，還能排除對其他可能的小核糖核酸病毒類型的檢出；2.在一個(gè)測試中，同時(shí)檢測所有已知的LV的瑞典和美國的病毒林以及相異的病毒抹(divergentstrain);并且3.在來自動物和人類患者的不同類型樣品中，對即^f吏是病毒載量4艮低的LV基因組進(jìn)行定量?；谄邆€(gè)已知的LV病毒林中的五個(gè)的序列數(shù)據(jù)，發(fā)明人開發(fā)出一種新的定量實(shí)時(shí)RT-PCR測定法，其中包括兩個(gè)特異性針對所述保守的5，-UTR的MGB探針，該探針能夠?qū)Ｒ坏貦z測出所有已知的LV病>^抹，并考慮到302位核苷酸的多態(tài)現(xiàn)象，即該位置核苷酸在瑞典的LV病毒抹中為烏噤呤而在美國的LV病^^林中^^嘧咬(參見NCBI序列GeneBank編號NC003976)。由于在所述目標(biāo)序列中的保守DNA只是較短的一段，發(fā)明人決定使用MGB-探針(17mers)而非常規(guī)的TaqMan-探針(大約20-30mers)以檢測LV特異性核酸。因?yàn)樗玫奶结樤谄?，-端有一非熒光的猝滅劑，所以MGB技術(shù)有利于對熒光報(bào)告染料的準(zhǔn)確檢測。此外，小溝結(jié)合子提高了探針的解鏈溫度，使得能夠設(shè)計(jì)更短的探針，從而避免探針與其目標(biāo)序列錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)(Kutyavin""，NucleicAcidsRes.,^，655-661，2000)?？紤]到LV基因組序列中SEQIDNO.1核苦酸位置24可為鳥噤呤或胞嘧咬的多態(tài)現(xiàn)象，為了能在一次測驗(yàn)中檢測出所有已知及其他相異的LV病毒林，發(fā)明人應(yīng)用了兩種不同的MGB綴合的熒光DNA探針。同時(shí)使用兩種不同的MGB探針特異性針對一個(gè)M多態(tài)，且兩種探針與相同的熒光報(bào)告染料相綴合，這是一種新的方法?；趯σ锖吞结樤O(shè)計(jì)的計(jì)算，所選目標(biāo)序列及所建立的測定法代表了按照上述需求用于篩選LV的5MJTR-特異序列的最佳方案。其他的利用5，-UTR內(nèi)的其他區(qū)域的方案將造成一些困難，尤其是探針的定位。所述新的測定法具有高靈敏性，其檢出限為10個(gè)病^#貝/檢測并且能夠?qū)α鶄€(gè)數(shù)量級的直接分離自樣品材料的LVRNA進(jìn)行可靠的定量。在特異性檢測中，沒有一個(gè)LV陰性對照(包括最相近的1型人副腸孤病毒、EMCV和TMEV)被檢測為陽性。實(shí)時(shí)PCR所選用的特異性引物和探針，以A^始cDNA合成所用的特異性引物，共同保證了械測法的高特異性。另外，試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間精密度的結(jié)果表明該測定法具有高度可重復(fù)性。用來自嚙齒動物和人的不同的實(shí)驗(yàn)及臨床樣品檢驗(yàn)所述測定法，獲得高效的LV基因組序列檢測結(jié)果。先前用IHC發(fā)現(xiàn)其為LV陽性的六個(gè)人胎盤/臍帶探針中的兩個(gè)，以及一個(gè)先前通過半巢式RT-PCR發(fā)現(xiàn)為LV陽性的分離自豬的SMB分離林，也通過所述新的測定法檢測為弱陽性，并可通過序列分析證實(shí)與LV相關(guān)。只有33%的免疫組織化學(xué)預(yù)檢測的胎盤/臍帶樣品可以用這種靈敏的病毒核酸檢測技術(shù)得以證實(shí)，這表明常規(guī)的檢測方法如IHC的病毒抗原檢測可能由于和其他小核糖核酸病毒交叉反應(yīng)產(chǎn)生一些假陽性結(jié)果，這是這類常規(guī)方法的常見問題。其他現(xiàn)有的檢測，例如病毒分離并檢測CPE,非常費(fèi)力且不能有效^j^"測出(Johanssonetal.，Biochem.Biophys.Res.Common-,317，1023-1029，2004)。然而，^研究的結(jié)a明這種定量實(shí)時(shí)RT-PCR方法對不同類型的樣品中即使是只有很低的LVRNA載量也是有效的?？傊?，結(jié)果表明所述方法可以實(shí)現(xiàn)人類疾病中LV的識別。如在一些動物傳染的疾病中所見，人類通常是最終宿主，并且從儲存宿主或載體中分離病原體比從患者中分離更容易些。此外，由于初次感染與疾病發(fā)作有時(shí)間間隔，感染原可能只有極少量存在或者不存在。然而，如本發(fā)明所述，本發(fā)明的方法可以用于檢測不同組織或體液中即使是少量的病毒核酸；除血清學(xué)分析和IHC外，所述方法還有助于闡明LV作為一種人類病原體在多種疾病中的作用。在大量來自不同嚙齒類種群的環(huán)境樣品以及臨床樣品中識別LV，可以提供LV在多個(gè)地理區(qū)域內(nèi)的更準(zhǔn)確的分布圖，并且有助于計(jì)算出人類患病的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例2OutbredCD1小鼠(CD-l(ICR)BrCharlesRiver實(shí)驗(yàn)室，德國)在出生一天后以約1000ID5。值在皿內(nèi)感染LV病毒抹145SL(GenBank編號為AF327922X這些動物祠養(yǎng)于瑞典斯德哥爾摩的瑞典感染病控制研究所AstridFagraeus實(shí)驗(yàn)室，并在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)處死。取出器官并分別冷凍(第一部分)或者立即置于RMlate,緩沖液(Ambion，USA)中(第二部分)。所述組織被送到德國柏林的RobertKoch研究所進(jìn)行PCR^^析。如前所述4^取RM。如前所述將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄并測定病毒載量。為檢驗(yàn)所述提取過程，用反轉(zhuǎn)錄和TaqMan⑧PCR(TibMolBiol，Berlin,Germany)檢測所有器官的看家基因次黃噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的mRNA。所有器官檢測為HPRTmRNA陽性。在;Mf究的第一部分中六只未知性別的感染的小鼠在感染后六天(dpi)被處死，這些小鼠4^都表現(xiàn)有腦炎的臨床癥狀。用組織學(xué)和PCR分析其腦，心臟，胰，肺，腎和肝。組織學(xué)觀察表明腦內(nèi)有組織損傷。最高的病毒載量發(fā)現(xiàn)于腦中(1()7拷貝/iUg總RNA)，次之是在心臟和胰中(接近104-105拷貝/yg總RNA)。在肺和肝中檢測到接近l(^病^"貝/jug總RNA。最低的病毒載量發(fā)現(xiàn)于腎中(103拷貝)(圖2)來自四只未感染的對照小鼠的所有器官呈LV陰性。在本研究中，我們從實(shí)驗(yàn)室觀察中發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明，性別和應(yīng)激在實(shí)驗(yàn)室小鼠以及田鼠感染LV的后果中起重要作用。在本研究第一部分中，性別和應(yīng)激并不作為重要因素，與此不同的是，第二部分只研究處于應(yīng)激下的雄性小鼠。因此，從第25天開始，3到4只動物就3ici文到一起。2到4只小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)被處死，并且如前所述對腦，心臟，胰，肺，腎，肝、脾和糞便進(jìn)行病毒RM分析(13dpi:n=4;17，27，56，98，130和174dpi:n=4)。盡可能地收胱和胸腺樣品。在感染的急性期，這些動物再次表現(xiàn)出組織學(xué)狀況與之前相同的腦炎臨床癥狀。未因?yàn)槟X炎死亡的動物(致死率約為30%)t艮為糖尿病。所有的被研究器官均被檢測為LV陽性，并與第一次研究中的感染急性期的病毒載量相近。最高的病毒拷貝lt^現(xiàn)于腦中(1()6拷貝/pg總RNA，13dpi)，次線是心臟(1()4拷貝/jug總RNA，13dpi)。最低的病絲貝數(shù)發(fā)現(xiàn)于肝和腎中(約5xl()2拷貝/jug總RNA，13dpi)。隨著時(shí)間的推移，在所有器官中的病毒載量下降并保持在一個(gè)較低水平(10-103拷貝/jLig總RNA)(圖3)。與其他器官相比，胸腺中的病毒載量較低(分別為200拷貝/jag總RNA，13dpi及3拷貝/iag總RNA,56dpi)。膀胱可從^較老的動物中摘除(分別為98和130dpi)。在這些膀胱中檢測到的病毒載量分別為300拷貝/iag總RNA(98dpi)和90拷貝/jig總RNA(130dpi)。本研究表明可以用PCR檢測實(shí)驗(yàn)室小鼠中的LV感染。實(shí)施例3本發(fā)明人已用上述PCR方法檢測來自兒童的白細(xì)胞樣品中的LV(8個(gè)全部檢測為陽性)，這些兒童近期有1型糖尿病發(fā)病。在12個(gè)患有多發(fā)性硬化癥的病人身上也4^P檢測到LV。在對照患者中，30個(gè)患者中有1個(gè)-皮發(fā)現(xiàn)有LV。所有樣本均為白細(xì)胞樣本。這些LV陽性的PCR結(jié)果已通過PCR產(chǎn)物的序列分析得到證實(shí)。以上所引用的文獻(xiàn)均通過引用方式納入本說明書。表l.LV實(shí)時(shí)PCR的試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間精密度Logio病毒對照<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*由一個(gè)操作者對LV插入克隆的每個(gè)稀釋濃度在三個(gè)系列中分別測6次(n-18)。t由三個(gè)操作者對LV插入克隆的每個(gè)稀釋濃度在一個(gè)系列中分別測6次(n=18)。CT:循環(huán)閾值。表2.LV實(shí)時(shí)PCR特異性檢測中所得結(jié)果的概況'<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*每個(gè)樣品測2次(n-2)。"+"-陽性結(jié)果；"-"=未發(fā)現(xiàn)；"nd，，=未進(jìn)行。CT:循環(huán)閾值；cps:拷貝數(shù)；EMCV:腦心肌炎病毒；TMEV:小鼠腦脊髓炎病毒；ADV:人類腺病毒。培養(yǎng)細(xì)胞t:GMK猴腎細(xì)胞(ATCC);J:10%SMB培養(yǎng)物；§:RD人類肌細(xì)胞(ATCC);1f:VeroE6猴腎細(xì)胞UTCC);#:B服-21倉鼠腎細(xì)胞(ATCC);$:Hep-2人類肝細(xì)胞(ATCC);①Graham人類腎細(xì)胞(ATCC);￡:Fi301人類肺成纖維細(xì)胞(InstituteofVirology,Charite，Berlin,Germany)。6分離自咽拭標(biāo)本。表3.預(yù)檢測臨床樣品和病^^離所得結(jié)果概況<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>每個(gè)樣品檢測2次(n-2)。"+"-陽性結(jié)果。CT:循環(huán)閾值；cps:拷貝數(shù)。權(quán)利要求1.一種檢測LV的方法，包括檢測一段核酸序列，所述核酸序列包括序列CTGCRYAGGTGGCTTTCACCTCTSGACAGYGC(SEQIDNO.1)或其反向互補(bǔ)序列中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。2.舉據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述待檢測的核酸序列是一段RNA序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述待檢測的核^列是一段DNA序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，包括將LVRM反轉(zhuǎn)錄成cDNA的起始步驟。5.根據(jù)前it^利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述被檢測的核酸序列包括SEQIDNO.1或其反向互補(bǔ)序列中的至少15個(gè)連續(xù)的核普酸。6.根據(jù)前it^利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述被檢測的核酸序列包括SEQIDNO.1或其反向互補(bǔ)序列中的至少17個(gè)連續(xù)的核苦酸。7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述被檢測的核酸序列包括以下序列GCTTTCACCTCTSGACA(SEQIDNO.3)或其反向互補(bǔ)序列。8.根據(jù)前#利要求任一項(xiàng)的方法，其中使用至少一個(gè)帶標(biāo)記的探針檢測所述核酸序列，所述的標(biāo)記探針能與SEQIDNO.1或其反向互補(bǔ)序列的至少13個(gè)連續(xù)的核苦酸特異性地雜交。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述帶標(biāo)記的探針的長度小于25個(gè)核苷酸r10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述帶標(biāo)記的探針的長度為17個(gè)核苷酸或更小。11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述帶標(biāo)記的探針結(jié)合到所述被檢測核酸的小溝。12.根據(jù)權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述探針為單鏈DNA探針。13.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述探針為外切核酸酶探針。14.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中一段DNA引物退火至所述RNA序列的某個(gè)位置，使得能夠產(chǎn)生一段包括SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DM序列，并且所述引物通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用進(jìn)行延伸。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述引物具有如下序列GCCCAGAGGCTAGTGTTACCA(SEQIDNO.9)。16.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，包括(a)反轉(zhuǎn)錄LVRNA，從而得到一段包括SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列；(b)擴(kuò)增所述DNA序列；并且(c)檢測所述擴(kuò)增出的DNA序列的存在。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中用探針檢測所述擴(kuò)增出的DNA序列。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法，其中用聚合SIM反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增所述DNA序列。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述用于PCR反應(yīng)的引物能擴(kuò)增出一段包括SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述引物包括一段正向引物，包括序列TAGGGGCTGTACCCGGGCGGTCCCACTCTTCACAG(SEQIDNO.7)或其中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸；并且一段反向引物，包括序列CCCCTAGTGGTAACACTAGCCTCTGGGCCCAAAAGGCATGTC(SEQIDNO.8)或其中至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述正向引物具有如下序列GCGGTCCCACTCTTCACAG(SEQIDNO.12)。22，根據(jù)權(quán)利要求20或21的方法，其中所述反向引物具有如下序列TGGTAACACTAGCCTCTGGGC(SEQIDNO.9)。23.根據(jù)權(quán)利要求18至22中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行定量PCR。24.根據(jù)權(quán)利要求18至23中任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行的所述PCR方法是一個(gè)實(shí)時(shí)PCR方法，并且使用外切核酸酶^4十檢測所述擴(kuò)增出的DNA序列。25.根據(jù)前i^K利要求任一項(xiàng)的方法，其中在組織樣品或體液樣品中檢測所述LV。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述樣品為肌肉組織樣品、神經(jīng)細(xì)胞樣品、內(nèi)分泌腺樣品或白血細(xì)胞樣品。27.—種用于檢測樣品中LV的方法，包括(a)從樣品中分離出RM;(b)反轉(zhuǎn)錄所述RM,得到一段包含SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的DNA序列；并且(c)用外切核酸酶探針進(jìn)行定量PCR。28.—種用于實(shí)行根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一種帶標(biāo)記的探針，所述探針可與SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸特異性結(jié)合。29.根據(jù)權(quán)利要求28的試劑盒，還包括用于擴(kuò)增包括SEQIDNO.1中的至少13個(gè)連續(xù)的核苷酸的核酸序列的引物，以及用于擴(kuò)增所述核酸序列所必需的試劑。30.根據(jù)權(quán)利要求28和29的試劑盒，還包括一段用于反轉(zhuǎn)錄LVRNA的引物，從而得到一段包括SEQIDNO.l中的至少13個(gè)連續(xù)的核普酸的DNA序列，以及用于反轉(zhuǎn)錄所述RM所必需的試劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種特異性檢測Ljungan病毒(Ljunganvirus，LV)的方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR檢測LV的方法。本發(fā)明還提供了用于實(shí)行本發(fā)明方法的試劑盒。文檔編號C12Q1/70GK101194026SQ200680008229公開日2008年6月4日申請日期2006年3月15日優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日發(fā)明者A·尼奇,B·尼克拉森,M·尼德里格,O·多諾索-曼特克申請人:阿波德漠斯有限公司;羅伯特-科赫研究所