專利名稱：：番茄黑環(huán)病毒的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種番茄黑環(huán)病毒(Tomatoblackring卿ovirus，TBRV)的檢測方法。
背景技術(shù)：
：番茄黑環(huán)病毒(Tomatoblackringn印ovirus，TBRV)，屬于豇豆病毒花葉科(Comoviridae)線蟲傳多面體病毒屬(7Ve/opa>"Sv>，包括很多的株系煙草黑環(huán)株系(Tobaccoblackringstrain);萵苣環(huán)斑株系(Lettuceringspotstrain)馬鈴薯花束株系(Potatobouquetstrain);馬鈴薯偽奧古巴株系(Potatopseudo-aucubastrain);甜菜環(huán)斑株系(Beetringspotstrain);齊菜黃脈株系(Celeryyellowveinstrain),這些株系不能通過寄主植物的癥狀來有效區(qū)分，但可以通過血清學(xué)和介體關(guān)系來區(qū)分。TBRV主要發(fā)生在歐洲，現(xiàn)分布在全球30多個國家和地區(qū)。據(jù)報道TBRV的寄主范圍很廣，能夠廣泛侵染單子葉和雙子葉草本和木本植物，包括許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，如葡萄和其他果樹、甜菜、馬鈴薯和蔬菜(蔥屬、甜菜屬、蕓薹屬、萵苣屬、番茄屬和菜豆屬的一些種)以及觀賞植物，還能侵染喬木和灌木以及一些雜草品種，可造成這些植物的嚴(yán)重危害。據(jù)了解，番茄黑環(huán)病毒在美國、土耳其、加拿大、英國、德國、意大利、法國、荷蘭等國雖有分布，但因該病毒的危害性較大，這些國家在各自的進(jìn)境檢疫法規(guī)中都明確規(guī)定為檢疫性有害生物。該病毒的傳播途徑很多，可以接觸傳毒、種子帶毒和線蟲傳毒。據(jù)文獻(xiàn)記載超過15個屬24種以上的植物可以TBRV種傳，許多植物的種傳率超過10。％，甚至達(dá)到100%。如研究發(fā)現(xiàn)甜菜、黃豆、萵苣和番茄的種傳效率分別是3-7，83，3和20%。由于病毒在線蟲介體中僅保持?jǐn)?shù)周，TBRV的種傳在病害流行病學(xué)中占有重要地位。可見線蟲介體只能短距離傳播，被害的植物種子和其它繁殖材料可以進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播。因此植物種子和種球苗木是TBRV在國際間進(jìn)行傳播和擴(kuò)散的重要根源。隨著我國加入WTO，國際貿(mào)易越來越頻繁，尤其是上海作為我國十分重要的口岸城市，每年進(jìn)口大量的花卉、林木和蔬菜的種子和苗木，且進(jìn)口的數(shù)量和品種有逐年增多的趨勢。TBRV為我國進(jìn)境檢疫法規(guī)中明確規(guī)定的危險性有害生物，寄主范圍廣、傳播途徑多、適生性強(qiáng)，進(jìn)口植物種子苗木攜帶該病毒的風(fēng)險性很大，伴隨著我國進(jìn)出境貿(mào)易的高速增長，傳入我國并危害流行的可能性極大。因而，必須對此病毒引起高度重視，研究準(zhǔn)確可靠快速的檢測方法，以防止TBRV隨種苗的國際貿(mào)易傳入我國，引起農(nóng)作物、花卉和蔬菜生產(chǎn)的巨大損失。目前，國內(nèi)針對TBRV的檢測方法研究較少，采用的檢測手段主要是血清學(xué)方法，因?yàn)門BRV具有多個血清型突變株和分離物，常規(guī)的血清學(xué)方法由于其靈敏度較低和特異性較差,僅靠此單一的方法大大限制了對該病毒的檢測，并可能出現(xiàn)漏檢的現(xiàn)象。國外學(xué)者采用免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄PCR的方法檢測到黃瓜上的TBRV，但尚未見到系統(tǒng)的分子生物學(xué)方法檢測TBRV的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，該方法可以特異性區(qū)分番茄黑環(huán)病毒，且具有檢測時間短，檢測的靈敏度高的特點(diǎn)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供一種番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，包括如下步驟(1)設(shè)計引物和/或探針；(2)番茄黑環(huán)病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成；(3)采用設(shè)計的引物和/或探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果。本發(fā)明可以采用RT-PCR檢測方法或?qū)崟r熒光PCR檢測方法對番茄黑環(huán)病毒進(jìn)行檢測。采用RT-PCR檢測方法的具體步驟如下(1)根據(jù)國際基因庫中已公布的TBRV的外殼蛋白基因(GenBank登錄號NC04440、X80831和X04062)的保守序列，設(shè)計一對特異性引物<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(2)番茄黑環(huán)病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成；(3)釆用設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min后進(jìn)行94。C變性45s、52。C復(fù)性45s、72℃延伸2min的35個循環(huán)的擴(kuò)增，72℃延伸10min后保存于4℃;擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。釆用實(shí)時熒光PCR檢測方法的具體步驟如下(1)根據(jù)國際基因庫中已公布的TBRV的外殼蛋白基因(GenBank登錄號NC04440、X80831和X04062)的保守序列，設(shè)計一對特異性引物和MGB探針。一對引物如下TBRV-CP133-F:5'-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3，；TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，；MGB探針如下TBRV-CP-MGB-FAM:5,(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3，(MGB)。(2)番茄黑環(huán)病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成；(3)采用設(shè)計的引物和/或探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測，實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件為預(yù)變性95°ClOmin后，進(jìn)行95°C15s，60°Clmin的40個循環(huán)。上述實(shí)時熒光PCR檢測方法采用MGB(全稱為MinorGrooveBinder)探針。MGB探針一是在探針的3'端標(biāo)記了自身不發(fā)光的淬滅熒光分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記；二是探針的3'端另結(jié)合了Minorgroovebinder結(jié)合物，使探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩(wěn)定性。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、更容易設(shè)計；2、探針更短3、提高配對與司E配對模板間的Tm值差異；4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精確、分辯率更高；5、雜交的穩(wěn)定性提高；6、低背景；7、重復(fù)性更強(qiáng)。該方法適合病原體的檢測、SNP和突變體檢測，既可以進(jìn)行基因定量分析，又可以進(jìn)行基因突變分析。.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次利用實(shí)時熒光PCR的方法檢測番茄黑環(huán)病毒。建立的RT-PCR和實(shí)時熒光PCR兩種分子檢測方法可以特異、靈敏、快速、準(zhǔn)確的鑒定番茄黑環(huán)病毒。具體有如下三方面有益效果1.檢測時間大大縮短，可以在7個小時內(nèi)完成檢測；2.檢測的靈敏度大大提高；3.利用引物和探針可以特異性區(qū)分番茄黑環(huán)病毒。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中TBRV的RT-PCR檢測結(jié)果示意圖，其中，M代表DL2000DNAmaker(DNA2000分子量標(biāo)準(zhǔn))；l代表TBRV-Pom;2代表TBRV-Bez;3代表TBRV-L10;4代表TBRV-MJ12;5代表TBRV-N1;6代表TBRV-Og;7代表陽性對照；8代表健康昆諾藜；9代表空白對照；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中TBRV的實(shí)時熒光RT-PCR檢測結(jié)果示意圖，其中，擴(kuò)增曲線從上而下依次為陽性對照，TBRV-Pom，TBRV-Bez，TBRV-LIO，TBRV-MJ12，TBRV-N1，TBRV-Og，TRSV，ToRSV，ArMV，健康昆諾藜和空白對照。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆s實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l采用RT-PCR檢測方法對番茄黑環(huán)病毒(TBRV)進(jìn)行檢測1、試驗(yàn)材料本次試驗(yàn)共收集到番茄黑環(huán)病毒6個分離物，TBRV的分離物由波蘭PospiesznyHenryk教授惠贈。收集到的病毒毒株首先進(jìn)行接種試驗(yàn)，接種鑒別寄主昆諾藜(Chenopodiumquinoa)、珊西煙(Nicotianetabacumvar.Xanthi-NC)、白肋煙(Nicotianatabacumcv.WhiteBurley)等，顯癥以后取帶毒葉片作為試驗(yàn)材料，以未接種的植株作為陰性對照。試驗(yàn)所用的毒株材料見表l。表1實(shí)施例1所使用的TBRV分離物<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、引物設(shè)計根據(jù)國際基因庫中已公布的TBRV的外殼蛋白(GenBank登錄號:NC04440、X80831和X04062)的保守序列，設(shè)計一對特異性引物:TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3'TBRV-CP1218-R:5，-TCCACCAAAATGTTCGGCAACAG-3'片段長度1218bp上述引物由上海invitrogen公司合成。3、RNA提取取0.lgTBRV接種的帶毒葉片置于液氮中研磨成粉末，加入1000mlTRLzol，迅速轉(zhuǎn)至1.5ml的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的離心管中，加200U氯仿，振蕩2min,4°C11000r/min離心10min。取上清液加入500ml異丙醇，—20。C沉淀10min，4°C12000r/min離心15min，沉淀用75%的乙醇洗一次，4°C7500r/min離心5min，沉淀溶于30，1ddH20(去離子水)中，即為提取的RNA，-7(TC保存?zhèn)溆谩?、cDNA第一鏈合成在2個DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的PCR管中分別加入:2uL模板RNA、2iiLAMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/yL，TaKaRa)、1uLRNase抑制劑(40U/uL，TaKaRa)、luL下游引物(20umol/L)(該下游引物是設(shè)計的TBRV-CP1218-R引物5，-TCCACCAAAATGTTCGGCMCAG-3，)和5uL5XAMV緩沖液，加ddH20至總體積20uL。室溫放置10min，42。C水浴60min，-2(TC保存?zhèn)溆谩?、RT-PCR取3uL合成好的cDNA(下游引物為TBRV-CP1218—R:5，-TCCACCAAAATGTTCGGCAACAG-3，)，于25nL體系中采用設(shè)計的引物TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3'和TBRV-CP1218-R:5，-TCCACCAMATGTTCGGCAACAG-3，，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性3min后進(jìn)行94"C變性45s、52。C復(fù)性45s、72"C延伸2min的35個循環(huán)的擴(kuò)增，72。C延伸10min后保存于4°C。擴(kuò)增結(jié)束后，取10ixLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。6、試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)已報道的TBRV外殼蛋白基因的保守序列設(shè)計了1對特異性引物TBRV-CP1218F/TBRV-CP1218-R，預(yù)期擴(kuò)增大小1218bp。用設(shè)計的引物對帶毒昆諾藜和健康昆諾藜的葉片進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)設(shè)計的引物能從ELISA檢測為陽性的葉片中擴(kuò)增到預(yù)期大小為1218bp的DNA條帶，所擴(kuò)增到的DNA條帶亮度高且特異性好，而從健康葉片8和空白對照9中未能擴(kuò)增到任何特異條帶(見圖l)。結(jié)合測序結(jié)果，可以準(zhǔn)確檢疫和鑒定番茄黑環(huán)病毒。7、RT-PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)以TBRV接種的白肋煙、昆諾藜、珊西煙和本氏煙，TRSV(煙草環(huán)斑病毒)接種的白肋煙，ToRSV(番茄環(huán)斑病毒)接種的番杏、ArMV(南芥菜花葉病毒)接種的白肋煙等發(fā)病的葉片為材料分別提取RNA，以TBRV-CP1218-R作為下游引物合成的cDNA，以合成的cDNA分別作為擴(kuò)增模板，用引物對TBRV-CP1218F/TBRV-CP1218-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示除TBRV能擴(kuò)增預(yù)計的DNA片斷外，其余病毒如ToRSV、TRSV、ArMV和健康植物、空白對照均無擴(kuò)增，可見該對引物的特異性強(qiáng)，表明所設(shè)計的針對TBRV的引物具有很好的特異性，植物組織對擴(kuò)增也沒有影響。8、RT-PCR檢測方法的靈敏度試驗(yàn)為了研究RT-PCR檢測TBRV的靈敏性，將TBRV-Pom、TBRV-0g和TBRV-Bez等3個株系的PCR產(chǎn)物和T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，然后克隆，篩選，用裂解堿法抽提質(zhì)粒。經(jīng)測定，3個分離物的抽提質(zhì)粒濃度TBRV-Pom為149ug/ml，TBRV-Bez為293ug/ml，TBRV—0g為63.5ug/ml，將質(zhì)粒按照10—1，10—2……10—9稀釋，用上述幾個濃度的質(zhì)粒作為模板分別進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果顯示當(dāng)TBRV-Pom和TBRV-Bez的抽提質(zhì)粒稀釋10—8時，RT-PCR方法還能擴(kuò)增到TBRV，但繼續(xù)稀釋到l(T時則沒有擴(kuò)增。當(dāng)TBRV-0g稀釋到10—7時，RT-PCR方法還能擴(kuò)增到TBRV，但繼續(xù)稀釋到10—8時則沒有擴(kuò)增。結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的克隆檢測靈敏度的方法，檢測三個分離物的最低病毒量依次為1.49X10—6ug/ml，2.93X10—6ug/ml，6.35X10—6ug/ml。經(jīng)過計算，檢測TBRV-Pom最低拷貝數(shù)為1862，檢測TBRV-Bez最低拷貝數(shù)為3661，檢測TBRV-Og最低拷貝數(shù)為7935。實(shí)施例2采用實(shí)時熒光PCR檢測方法對番茄黑環(huán)病毒進(jìn)行檢測1、試驗(yàn)材料(同實(shí)施例1)2、設(shè)計引物和探針根據(jù)國際基因庫中已公布的TBRV的外殼蛋白基因(GenBank登錄號:NC04440、X80831和X04062)的保守序列，分別設(shè)計特異性引物和MGB探針，引物為TBRV-CP133-F:5'-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3'TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，MGB探針為TBRV-CP-MGB-FAM:5，(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3'(MGB)上述引物和探針由上海基康公司合成。3、RNA提取(同實(shí)施例1)4、cDNA第一鏈合成下游引物為TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGMGGGAGACTGTATT-3，，其它同實(shí)施例1。5、實(shí)時熒光PCR實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系25uL，其中3uLcDNA(下游引物為TBRV-CP133—R)，2X反應(yīng)緩沖液12.5uL，上游引物(TBRV-CP133-F)0.25uL(20umol/L)，下游引物(TBRV—CP133-R)0.25uL(20umol/L)，探針(TBRV-CP-MGB-FAM)1.2uL(20uM)，加水至25uL。實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件預(yù)變性95°C10min后，進(jìn)行95°C15s，60°Clmin的40個循環(huán)。6、試驗(yàn)結(jié)果利用設(shè)計的引物和MGB探針可以特異性的擴(kuò)增TBRV的6個分離物，如圖2所示，擴(kuò)增曲線從上而下依次為陽性對照，TBRV-Pom，TBRV-Bez，TBRV-L10，TBRV-MJ12，TBRV-N1，TBRV-0g，TRSV,ToRSV，ArMV，健康昆諾藜和空白對照，除番茄黑環(huán)病毒(TBRV)出現(xiàn)擴(kuò)增外，煙草環(huán)斑病毒(TRSV)、南芥菜花葉病毒(ArMV)、番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)、健康昆諾藜和空白對照都沒有擴(kuò)增，說明設(shè)計的引物和探針對TBRV特異性強(qiáng)。7、實(shí)時熒光PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)以TBRV接種的白肋煙、昆諾藜、珊西煙和本氏煙，TRSV接種的白肋煙，ToRSV接種的番杏、ArMV接種的白肋煙等發(fā)病的葉片為材料分別提取RNA，以TBRV-CP133-R作為下游引物合成的cDNA，以合成的cDNA分別作為擴(kuò)增模板，用引物對TBRV-CP133-F/TBRV-CP133-R和加入探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示(圖2)除TBRV能擴(kuò)增預(yù)計的DNA片斷外，其余病毒如ToRSV、TRSV、ArMV和健康昆諾藜、空白對照均無擴(kuò)增，可見該對引物的特異性強(qiáng)，表明所設(shè)計的針對TBRV的引物和探針具有很好的特異性，植物組織對擴(kuò)增也沒有影響。8、實(shí)時熒光PCR檢測的靈敏度為了研究實(shí)時熒光RT-PCR檢測TBRV的靈敏性，將TBRV-0g和TBRV-Pom2個株系的PCR產(chǎn)物和T載體連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，然后克隆，篩選，用裂解堿法抽提質(zhì)粒。經(jīng)測定，2個分離物的抽提質(zhì)粒濃度TBRV-Pom為111.8ug/ml，TBRV-0g為78.5ug/ml，將質(zhì)粒按照10—、10—2……10—11稀釋，用上述幾個濃度的質(zhì)粒作為模板分別進(jìn)行實(shí)時熒光PCR。結(jié)果顯示當(dāng)TBRV-Pom的抽提質(zhì)粒稀釋10—"時，實(shí)時熒光PCR方法還能擴(kuò)增到TBRV，但繼續(xù)稀釋到KT"時則沒有擴(kuò)增。但當(dāng)TBRV-0g稀釋到10—9時，實(shí)時熒光PCR方法還能擴(kuò)增到TBRV，但繼續(xù)稀釋到10—1()時則沒有擴(kuò)增。結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的克隆檢測靈敏度的方法，檢測2個分離物的最低病毒量依次為:1.118X10—8ug/ml，7.85X10—8ug/ml。經(jīng)過計算，檢測TBRV-Pom最低拷貝數(shù)為77，檢測TBRV-0g最低拷貝數(shù)為538。權(quán)利要求1、一種番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)設(shè)計引物和/或探針；(2)番茄黑環(huán)病毒RNA提取和cDNA第一鏈合成；(3)采用設(shè)計的引物和/或探針進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測結(jié)果。2、如權(quán)利要求1所述的番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，其特征在于，采用RT-PCR檢測方法，步驟(1)中所述設(shè)計的引物為TBRV-CP1218-F:5，-GATCAAGAATACGAACACACG-3';TBRV-CP1218-R:5'-TCCACCAMATGTTCGGCAACAG-3'。3、如權(quán)利要求1所述的番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，其特征在于，采用RT-PCR檢測方法，步驟(3)中PCR的反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性3min后進(jìn)行94'C變性45s、52'C復(fù)性45s、72'C延伸2min的35個循環(huán)的擴(kuò)增，72'C延伸10min后保存于4"C;擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。4、如權(quán)利要求1所述的番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，其特征在于，采用實(shí)時熒光PCR檢測方法，步驟(1)中所述設(shè)計的引物為TBRV-CP133-F:5，-TCGTTTCTTGCAGTTTGCGTAT-3';TBRV-CP133-R:5，-GTGGCAAAGAAGGGAGACTGTATT-3，；步驟(1)中所述設(shè)計的探針為TBRV-CP-艦B-FAM:5，(FAM)-CACAGATACCACATGTGGA-3，(MGB)。5、如權(quán)利要求1所述的番茄黑環(huán)病毒的檢測方法，其特征在于，采用實(shí)時熒光PCR檢測方法，步驟(3)中實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件為預(yù)變性95。C10min后，進(jìn)行95°C15s，60°Clmin的40個循環(huán)。全文摘要本發(fā)明公開了一種番茄黑環(huán)病毒(TBRV)的檢測方法，本發(fā)明針對TBRV不同分離物外殼蛋白基因的保守序列設(shè)計特異性引物和MGB探針，利用TBRV的不同分離物，建立了TBRV的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和實(shí)時熒光PCR的檢測方法。本發(fā)明利用引物和探針可以特異性區(qū)分番茄黑環(huán)病毒，且大大縮短了檢測時間，檢測的靈敏度也大大提高。文檔編號C12Q1/70GK101200770SQ20061011955公開日2008年6月18日申請日期2006年12月13日優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日發(fā)明者翠于,楊翠云申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局