專利名稱：甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法。
背景技術(shù)：
甘蔗斐濟(jì)病是一種病毒引起的甘蔗病害，該病害在澳大利亞、斐濟(jì)、印尼、 馬來群島、泰國等國家和地區(qū)發(fā)生，造成甘蔗生產(chǎn)較大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來， 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所與澳大利亞、法國、菲律賓等多個(gè)國家開展國際 合作項(xiàng)目，并從國外引進(jìn)優(yōu)良的甘蔗品種、材料。目前甘蔗斐濟(jì)病在我國還未 見發(fā)生的報(bào)道，但是為了防止該病害隨從國外引進(jìn)的甘蔗品種、材料傳入我國， 對(duì)我國的甘蔗生產(chǎn)造成威脅，有必要開展甘蔗斐濟(jì)病毒的檢測方法研究。目前，國外對(duì)甘蔗斐濟(jì)病毒的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附測定、生理生 化測定等，但是，這些方法在檢測時(shí)間、靈敏度、穩(wěn)定性等方面存在一些不足, 檢測特異性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法，該方法能有效提高甘蔗 斐濟(jì)病毒的快速檢測，使檢測更準(zhǔn)確、靈敏，檢測特異性更強(qiáng)。 本發(fā)明包括以下步驟1、 采用Qiagen RNeasy試劑盒提取甘蔗斐濟(jì)病毒檢測樣本中的模板RNA;2、 利用甘蔗斐濟(jì)病毒的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR);3、 用瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增檢測反應(yīng)產(chǎn)物，出現(xiàn)目標(biāo)電泳條帶即可確定檢測 樣本中有甘蔗斐濟(jì)病毒存在，所說的目標(biāo)電泳條帶是指450堿基對(duì)(bp)處。本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測方法克服了酶聯(lián)免疫吸附 測定、生理生化測定等現(xiàn)有檢測方法花費(fèi)時(shí)間較長，靈敏度、穩(wěn)定性較差，檢 測特異性不強(qiáng)等不足，大大提高了檢測效率和檢測的準(zhǔn)確性。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的方法步驟是a、用Qiagen RNeasy試劑盒提取檢測樣本中的模板RNA:1、 取100mg甘蔗葉組織于研缽；2、 加入液氮2-3提研磨后輕輕轉(zhuǎn)移于1.5ml離心管；3、 加450plRLT緩沖液(Buffer RLT),激烈振蕩；4、 12000 rpm離心2min，棄沉淀；5、 小心轉(zhuǎn)移上清液于另一個(gè)新的1.5ml離心管，加入等倍體積濃度為 96%-100%的乙醇，立即混勻；6、 12000 rpm離心15s， 棄液體；7、 加700jnl RW1緩沖液(Buffer RW"， 12000 rpm離心15s，棄液體；8、 加500plRPE緩沖液(Buffer RPE)， 12000 rpm離心15s,棄液體；9、 加500nlRPE緩沖液(Buffer RPE)， 12000 rpm離心2 min;10、 加50pl無RNA酶水(RNase-free water), 12000 rpm離心lmin，棄液體；11、 加20-200pl滅菌超純水于RNA中，于-2(TC保存?zhèn)溆?。b、用甘蔗斐濟(jì)病毒的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系及參數(shù)反應(yīng)體系總混合物l:引物1: FDV7F(20pM) 0.25^1 引物2: FDV7R(20nM) 0.25pl 滅菌水(H20) 10.50^1 模板(Template) l.Opl 總量Total 12.0^1 總混合物2:5x緩沖液(buffer) 5^1 10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 2.5^1 lOOmM 二硫代蘇糖醇DTT L25pl 100%二甲基亞砜DMSO 1.25pl50/o牛清白蛋白BSA l.Opl 20mM三磷酸脫氧核糖核苷酸(dNTPs)混合液 l.Opl C.Awm聚合酶 l.Ofil 總量(Total) 13.0^11、 總反應(yīng)體積為25^ll;2、 準(zhǔn)備總混合物1，加模板和20pl礦物油，然后加熱到99。C變性RNA 2min; 3、 立即將試管放到O'C以下冰上；4、 保持試管在O'C以下冰上，加總混合物2，立即進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)1 cycle 57°C 30min 1 cycle 95 。C 2min35 cycles 95。C lmin， 57°C lmin， 72°C lmin 1 cycle 72 。C 8minc、反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測用1-2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增檢測，并用凝膠成像分析系統(tǒng) 觀察拍照電泳照擴(kuò)增結(jié)果。
權(quán)利要求
1、 一種甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法，包括以下步驟1) 、用Qiagen RNeasy試劑盒提取檢測樣本中的模板RNA;2) 、用甘蔗斐濟(jì)病毒的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；3) 、反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，目標(biāo)電泳條帶出現(xiàn)即可確定檢測樣本中有甘蔗 斐濟(jì)病毒存在。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法，其特征是進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物為甘蔗斐濟(jì)病毒特異性引物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法，其特征是采用瓊脂糖凝 膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，目標(biāo)電泳條帶出現(xiàn)在450堿基對(duì)(bp)處。
全文摘要
一種甘蔗斐濟(jì)病毒檢測方法，該方法能有效提高甘蔗斐濟(jì)病毒的快速檢測，使檢測更準(zhǔn)確、靈敏，檢測特異性更強(qiáng)，包括以下步驟1.采用Qiagen RNeasy試劑盒提取甘蔗斐濟(jì)病毒檢測樣本中的模板RNA；2.利用甘蔗斐濟(jì)病毒的特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；3.用瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增檢測反應(yīng)產(chǎn)物，出現(xiàn)目標(biāo)電泳條帶即可確定檢測樣本中有甘蔗斐濟(jì)病毒存在，所說的目標(biāo)電泳條帶是指450堿基對(duì)(bp)處；本發(fā)明的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測方法克服了酶聯(lián)免疫吸附測定、生理生化測定等現(xiàn)有檢測方法花費(fèi)時(shí)間較長，靈敏度、穩(wěn)定性較差，檢測特異性不強(qiáng)等不足，大大提高了檢測效率和檢測的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101144793SQ20071006632
公開日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2007年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月29日
發(fā)明者盧文潔, 李文鳳, 范源洪 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所