專利名稱：聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用免疫測定法檢測特異性IgM、IgG抗體的層析條及其制備技術(shù)，具體地說，涉及一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)對特異性IgM、IgG抗體進行聯(lián)合檢測的層析條及其制備方法。
背景技術(shù)：
免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)是人或動物體內(nèi)最重要的兩種抗體。一種抗原(細菌或病毒等)進入機體后，最早出現(xiàn)的免疫球蛋白是IgM抗體，之后出現(xiàn)IgG抗體。盡管在某些情況下還可能出現(xiàn)IgA抗體，由于其臨床意義同IgG基本相同，并且IgA含量很低，在臨床檢測中的實際意義不大，因而在臨床檢測中一般不予以區(qū)分。通過檢測機體內(nèi)IgM、IgG抗體的存在，可以診斷人或動物對特定抗原的免疫反應(yīng)狀態(tài)。血清內(nèi)若檢測出特異性IgM抗體，表明有近期感染的發(fā)生，但IgM抗體半衰期較短，IgM的檢測陰性并不能證明機體未受到感染，還需要檢測半衰期較長，含量最高的IgG抗體，以明確診斷。
目前單獨檢測特異性IgM或IgG抗體的方法很多，比如ELISA法、雙抗原夾心法、膠體金免疫層析法等，但還未有通過一次操作過程即可聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的方法。雖然單獨檢測IgM和IgG抗體后，再綜合分析檢測結(jié)果對疾病的診斷并無影響，但操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種膠體金層析條，通過一次操作過程即可聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體，從而簡化操作過程，實現(xiàn)快速檢測的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條，所述層析條在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復(fù)合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復(fù)合物墊為涂覆有抗原-膠體金復(fù)合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體。
本發(fā)明還提供了所述膠體金層析條的制備方法，包括以下步驟(1)制備特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體、抗IgM抗體采用常規(guī)制法制備特異性抗原、與已知抗原相應(yīng)的動物抗體、抗IgM抗體，濃度分別為1mg/ml～4mg/ml、3mg/ml～6mg/ml、0.5mg/ml～4mg/ml；(2)制備抗原-膠體金復(fù)合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入純化的已知抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值為0.5～3，備用；(3)取硝基纖維素膜貼在PVC背板中間，將抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體分開包被在硝基纖維素膜上；將抗原膠體金復(fù)合物涂覆在玻璃纖維素膜上制備復(fù)合物墊；(4)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有桿品墊、復(fù)合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附吸收墊；(5)將PVC背板及其貼附的材料切成適宜寬度的層析條。
所制備的抗IgM抗體可以為單克隆或多克隆抗體。
所述抗原-膠體金復(fù)合物可以噴涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纖維素膜上。
所述硝基纖維素膜在包被抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體后可以進行封閉處理，以減少非特異性反應(yīng)。
所述層析條在制備完成后可以裝入塑料板卡內(nèi)。
本發(fā)明的膠體金層析條，以膠體金作為標(biāo)記物，采用免疫捕獲法原理測定IgM抗體，雙抗原夾心法原理測定IgG抗體，通過一次操作即可聯(lián)合檢測出特異性IgM、IgG抗體，簡化了操作過程，且檢測結(jié)果的總體符合率較高。
具體實施例方式
實施例1檢測人巨細胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗體的膠體金層析條的制備方法具體制備過程如下(1)采用基因重組法制備濃度為3mg/ml的HCMV抗原，動物免疫法制備濃度為5mg/ml的兔抗HCMV抗體，單克隆抗體制備法制備濃度為2mg/ml的鼠抗人IgM單克隆抗體，備用。
(2)制備抗原-膠體金的復(fù)合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照80μg/ml比例加入純化的HCMV抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值2.0，備用；(3)包被鼠抗人IgM單克隆抗體、HCMV抗原、兔抗HCMV抗體取硝基纖維素膜貼于PVC背板中間，設(shè)定劃膜機涂覆參數(shù)為1μl/cm。取5mg/ml的兔抗HCMV抗體1.5ml、3mg/ml的HCMV抗原1.5ml、2mg/ml的鼠抗人lgM單克隆抗體1.5ml，分別接到劃膜機的A、B、C管道接口。將貼有硝基纖維素膜的PVC背板置于劃膜機的往復(fù)運動平臺上。開啟劃膜機，在硝基纖維素膜上涂覆兔抗HCMV抗體、HCMV抗原、鼠抗人IgM單克隆抗體，在37℃干燥2小時。將背板置于1％聚乙二醇溶液中浸泡30分鐘，晾干，37℃干燥2小時。
(4)將抗原-膠體金的復(fù)合物涂覆在玻璃纖維素膜上設(shè)定劃膜機噴涂參數(shù)為25.0μl/cm，將抗原-膠體金復(fù)合物連接到劃膜機的D管道接口。取30cm×12cm的玻璃纖維素膜放置往復(fù)運動平臺上。開啟劃膜機，在玻璃纖維素膜上噴涂抗原-膠體金復(fù)合物制成復(fù)合物墊，37℃干燥2小時。
(5)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼上復(fù)合物墊和樣品墊，另一端貼上吸收墊，將PVC背板及其貼附的材料切成4mm寬層析條。將層析條放入塑料板卡內(nèi)，用壓卡機壓實。
當(dāng)加入被檢測樣品后，通過層析作用，樣品和抗原-膠體金復(fù)合物向吸收墊一端移動。當(dāng)樣品通過鼠抗人IgM單克隆抗體包被線時，其中的IgM抗體與鼠抗人IgM單克隆抗體結(jié)合，如果IgM抗體中含有針對特異性抗原的IgM抗體，則抗原-膠體金復(fù)合物與之結(jié)合，在該處顯示一條紫紅色條帶。如果被檢測樣品中含有針對特異性抗原的特異性IgG抗體時，當(dāng)其移動到特異性抗原包被線時，抗體既與特異性抗原結(jié)合，也與抗原-膠體金復(fù)合物結(jié)合，在此處顯示一條紫紅色條帶?？乖?膠體金復(fù)合物移動到與其相應(yīng)抗體的包被線處，與抗體結(jié)合，顯示一條紫紅色條帶。在抗IgM抗體包被處顯示紫紅色條帶，表明被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgM抗體。在抗原包被處顯示紫紅色條帶，表明被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgG。在少數(shù)情況下可能含有IgA，但其臨床意義同IgG基本相同，在臨床檢測中可以不必區(qū)分IgG或IgA。如果在抗原包被處和抗IgM抗體包被處同時顯示紫紅色條帶，僅判定為被檢測樣品中含有針對特異性抗原的IgM抗體。如果在抗原包被處、抗IgM抗體包被處沒有紫紅色條帶，判定為被檢測樣品中不含有特異性IgG、IgM。在針對特異性抗原的抗體包被處顯示紫紅色條帶，表明該檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果有效；如果該處沒有顯示紫紅色條帶，表明該檢測系統(tǒng)失效，檢測結(jié)果無效。
實施例2檢測人巨細胞病毒(HCMV)IgM、IgG抗體的檢測結(jié)果應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HCMV IgG陽性血清383份和陰性血清1979份進行了檢測，并與間接法ELISA試劑單獨檢測抗HCMV IgG的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表1和表2。
表1膠體金層析條對抗HCMV IgG臨床血清的檢測結(jié)果

表2膠體金與ELISA檢測抗HCMV IgM的結(jié)果比較

由表1數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為362/(362+21)+1977/(2+1977)-1＝0.94，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表2數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(362+1990)/2362×100％＝99.6％，這表明兩種檢測方法檢測IgG具有高度一致性。
應(yīng)用制備的膠體金層析條對臨床診斷明確的抗HCMV IgM陽性血清176份和陰性血清2433份進行了檢測，并與捕獲法ELISA試劑單獨檢測抗HCMV IgM抗體的結(jié)果進行了對比，結(jié)果分別示于表3和表4。
表3膠體金層析條對抗HCMV IgM臨床血清的檢測結(jié)果

表4膠體金與ELISA檢測抗HCMV IgM的結(jié)果比較

由表3數(shù)據(jù)可計算得到約登指數(shù)為159/(159+17)+2430/(3+2430)-1＝0.90，說明檢測結(jié)果與樣品真實情況的總體符合率很高。由表4數(shù)據(jù)可計算得到本發(fā)明檢測結(jié)果與ELISA檢測結(jié)果的總體符合率為(159+2440)/2609×100％＝99.6％，這表明兩種檢測方法檢測IgM具有高度一致性。
以上分析結(jié)果表明，本發(fā)明聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條與單獨檢測IgG或IgM抗體的ELISA試劑具有相似的檢測結(jié)果，本發(fā)明的檢測結(jié)果能夠符合臨床檢測工作的需要。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條，所述層析條在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復(fù)合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復(fù)合物墊為涂覆有抗原-膠體金復(fù)合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條的方法，包括以下步驟(1)制備特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體、抗IgM抗體采用常規(guī)制法制備特異性抗原、與已知抗原相應(yīng)的動物抗體、抗IgM抗體，濃度分別為1mg/ml～4mg/ml、3mg/ml～6mg/ml、0.5mg/ml～4mg/ml；(2)制備抗原-膠體金復(fù)合物采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，在金溶膠中按照20μg/ml～80μg/ml比例加入純化的已知抗原，經(jīng)封閉、離心處理后，取沉淀稀釋至A530值為0.5～3，備用；(3)取硝基纖維素膜貼在PVC背板中間，將抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體分開包被在硝基纖維素膜上；將抗原-膠體金復(fù)合物涂覆在玻璃纖維素膜上制備復(fù)合物墊；(4)在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復(fù)合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附吸收墊；(5)將PVC背板及其貼附的材料切成適宜寬度的層析條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所制備的抗IgM抗體為單克隆或多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述抗原-膠體金復(fù)合物以噴涂、敷涂或浸泡的方式涂覆在玻璃纖維素膜上。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述硝基纖維素膜在包被抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體后還可以進行封閉處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述層析條在制備完成后裝入塑料板卡內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種聯(lián)合檢測特異性IgM、IgG抗體的膠體金層析條及其制備技術(shù)。該層析條以膠體金作為標(biāo)記物，在PVC背板上一端順次相互搭接地貼附有樣品墊、復(fù)合物墊、硝基纖維素膜，另一端貼附有吸收墊；所述復(fù)合物墊為涂覆有抗原－膠體金復(fù)合物的玻璃纖維素膜，其特征在于所述硝基纖維素膜上包含三條包被線，分別包被有抗IgM抗體、特異性抗原、與抗原相應(yīng)的抗體。本發(fā)明的層析條采用免疫捕獲法原理測定IgM抗體，雙抗原夾心法原理測定IgG抗體，通過一次操作即可聯(lián)合檢測出特異性IgM、IgG抗體，簡化了操作過程，且檢測結(jié)果的總體符合率較高。
文檔編號G01N33/532GK101021532SQ20071006489
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月28日
發(fā)明者王健, 陳廷友, 王志新, 翟立偉, 孔祥菊, 畢大偉, 張秀杰 申請人:北京英諾特生物技術(shù)有限公司