技術(shù)特征：

1.一種微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)將微小隱孢子蟲卵囊反復(fù)凍融和超聲波裂解后，離心，上清液作為檢測性抗原，沉淀作為免疫性抗原；

(2)用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制備兔抗微小隱孢子蟲血清抗體IgG，并用鹽析法純化IgG；

(3)用免疫性抗原免疫健康產(chǎn)蛋雞，制備抗微小隱孢子蟲卵黃抗體IgY，并用水稀釋硫酸銨鹽析法純化IgY；

(4)以IgG為捕獲抗體，IgY為檢測抗體的夾心ELISA檢測步驟：

a.IgG包被：用包被液將純化后的IgG稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃下包被1h后，4℃下過夜，棄去包被液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

b.封閉：每孔加200μL封閉液，37℃下封閉1h后，棄去封閉液，用洗滌液洗滌3次，拍干；

c.加抗原：將步驟(1)制備的檢測性抗原用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下反應(yīng)lh后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

d.加IgY：將IgY用0.01M PBS稀釋，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩棄液體，用洗滌液洗滌3次，拍干；

e.加酶標(biāo)抗體：加用0.01M PBS稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗雞的酶標(biāo)抗體，100μL/孔，37℃下作用45min后，甩棄液體，洗滌液洗板3次，拍干；

f.加底物顯色：加TMB顯色液，100μL/孔，室溫避光作用10min；

g.終止反應(yīng)：加入終止液，50μL/孔，用酶標(biāo)儀測OD₄₅₀值，計(jì)算出P/N值，P/N＝(待檢樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)/(陰性樣品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值)，若P/N≥2.1，判為陽性，若P/N<2.1，判為陰性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：步驟(1)中所述微小隱孢子蟲卵囊為用微小隱孢子蟲感染犢牛進(jìn)行傳代，大量收集糞便并純化后獲得的卵囊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的c步驟中，檢測性抗原稀釋后的濃度為2.5μg/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的a步驟中，用包被液將純化后的IgG稀釋800倍。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的d步驟中，將IgY稀釋100倍。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的e步驟中，HRP標(biāo)記的羊抗雞的酶標(biāo)抗體稀釋5000倍。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中，包被液由無水碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2.93g，加蒸餾水定容至1000mL而得；

洗滌液由氯化鈉8.0g，氯化鉀0.2g，磷酸二氫鉀0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，吐溫-20 0.5mL，加蒸餾水1000mL而得；

封閉液由牛血清蛋白1g，加包被液100mL而得；

終止液由濃硫酸11.1mL，加蒸餾水88.9mL而得；

PBS由NaCl8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄·12H₂O 2.9g，加蒸餾水定容至1000mL而得。

8.如權(quán)利要求1所述的微小隱孢子蟲的夾心ELISA檢測方法在檢測待檢測糞便中微小隱孢子蟲中的應(yīng)用，其特征在于：所述待檢測糞便先用飽和蔗糖溶液漂浮法進(jìn)行處理，再反復(fù)凍融和超聲波裂解后，離心，得到的上清液作為檢測性抗原使用，再用所述步驟(4)中的夾心ELISA方法對檢測性抗原進(jìn)行檢測，以確定待檢測糞便中是否已感染微小隱孢子蟲。