本發(fā)明涉及癌癥診斷檢測用的試劑盒領(lǐng)域，具體為一種用于直腸癌體外診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國的結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例33.1萬人，發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第四位；死亡率則位居癌癥死亡原因第五位。健康的人群，有大量結(jié)腸息肉患者進行結(jié)直腸癌的鑒別診斷，其平均發(fā)病率達到10%。臨床治療發(fā)現(xiàn)，第一期直腸癌治療后的存活率達百分之八十，零期直腸癌治療后的存活率更接近百分之百，因此早期發(fā)現(xiàn)及治療非常重要。

腫瘤標(biāo)志物(tumor markers，TM)是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身合成、釋放，或由機體對腫瘤細胞反應(yīng)而產(chǎn)生的標(biāo)志腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。這些物質(zhì)在正常成人中不存在或者是在癌癥患者中出現(xiàn)的水平顯著高于正常人。目前腫瘤標(biāo)志物檢測技術(shù)被認(rèn)為是早期發(fā)現(xiàn)無癥狀微灶腫瘤的唯一途徑，這一檢測技術(shù)可先于X光片、超聲、CT、MRI或PET-CT等物理檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤?？捎糜诟呶Ｈ巳簮盒阅[瘤的篩查，腫瘤診斷與鑒別診斷，評估治療的效果，預(yù)測或監(jiān)視腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。目前，醫(yī)院出現(xiàn)的直腸癌診斷試劑盒都是檢測一些常見的腫瘤標(biāo)記物，靈敏性及準(zhǔn)確性都偏低。因主要是選定的腫瘤標(biāo)記物單項檢測往往有很大的局限性，難以滿足早期快速診斷的要求。

目前，市場上還沒有針對直腸癌的快速高效診斷試劑盒問世，嚴(yán)重影響到直腸癌早期發(fā)現(xiàn)及治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對以上述現(xiàn)有直腸癌診斷存在的不足，提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強且使用方便高效的用于直腸癌體外診斷試劑盒。

本發(fā)明另一目的是提供一種用于直腸癌體外診斷試劑盒的檢測方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：用于直腸癌體外診斷試劑盒，包括捕獲抗體，所述捕獲抗體是X型膠原蛋白α1制得的單克隆抗體。

所述試劑盒還包括檢測抗體，所述檢測抗體為X型膠原蛋白α1制得的多克隆抗體。

所述捕獲抗體為將X型膠原蛋白α1克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)單克隆抗體。

所述捕獲抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：把X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體。

所述檢測抗體為將X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)多克隆抗體。

所述檢測抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：把X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體。

所述捕獲抗體預(yù)先包被于微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。

用于直腸癌體外診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：將X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被 微量滴定板的孔；②. 封蓋微量滴定板并在 4℃ 下孵育過夜；③. 棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；

（5）封閉和加樣：每孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。

用于直腸癌體外診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：將X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被微量滴定板的孔；

②.封蓋微量滴定板并在 4℃ 下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每個孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

（6）加樣

①.將 100 μl的樣品添加到每個孔，在 37℃孵育60分鐘;要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號。每個酶標(biāo)板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測定或三重測定）和空白樣，以確保準(zhǔn)確性；

②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）；

③.將 100 μl 濃度為 0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個孔；

④.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

⑤.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 標(biāo)記二抗；

⑦.封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

⑧.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

(7)檢測

①.將 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺） 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液，然后在450 nm 處讀取光密度。

②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在 X 軸（對數(shù)標(biāo)度）上，而吸光度標(biāo)在 Y軸（線性標(biāo)度）上。通過內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。

本發(fā)明從眾多的腫瘤標(biāo)記物中，篩選出新腫瘤標(biāo)記物COL10A1(X型膠原蛋白α1) 組成直腸癌快速診斷試劑盒。X型膠原蛋白α1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型膠原，是成片層結(jié)構(gòu)的膠原，它們在細胞外基質(zhì)(ECM)中裝配成片層結(jié)構(gòu)。通常由三條 多肽鏈構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)，在胚胎發(fā)育、組織重建、損傷修復(fù)等過程中，生長因子及分化因子對膠原蛋白基因的表達具有重要的調(diào)控作用。許多疾病與X型膠原的異常有著密切的關(guān)系。最近的研究也證實它是直腸癌的理想標(biāo)記物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：具有靈敏度高準(zhǔn)確性強的特點，其靈敏度達到70%以上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒的原理圖；

圖2是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒的檢測抗體最佳工作濃度的選擇對比圖；

圖3是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒的對臨床血清標(biāo)本的診斷及鑒別診斷對比說明圖；

圖4是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒敏感性的檢測對比圖；

圖5是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒特異性的檢測對比圖；

圖6是本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒在直腸癌治療前后血中檢測到X型膠原蛋白α1的變化對比圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒進行詳細的描述說明。

用于直腸癌體外診斷試劑盒，包括捕獲抗體，捕獲抗體封閉緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記抗體、洗滌液及顯色液，所述標(biāo)記抗體選用HRP標(biāo)記二抗；所述捕獲抗體是X型膠原蛋白α1制得的單克隆抗體； 其靈敏度及準(zhǔn)確性均達到70%以上。

所述捕獲抗體為將X型膠原蛋白α1克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)單克隆抗體。

所述捕獲抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：通過分子克隆的方法把X型膠原蛋白α1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；所述抗原的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的單克隆抗體為捕獲抗體；所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選小鼠；所述捕獲抗體的制備也可以使用現(xiàn)有常規(guī)方法制備，在此不再累贅。

所述檢測抗體包括X型膠原蛋白α1制得的多克隆抗體。

所述捕檢測抗體為將X型膠原蛋白α1的基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到相應(yīng)的抗原，將所述抗原免疫哺乳動物得到的相應(yīng)多克隆抗體。所述檢測抗體的制備方法包括如下步驟：

（1）抗原的制備：通過分子克隆的方法把X型膠原蛋白α1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到抗原，此抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物，得到相應(yīng)的多克隆抗體為檢測抗體，所述哺乳動物是小鼠及兔子，優(yōu)選兔子。

所述捕獲抗體可以預(yù)先包被于 PVC 材質(zhì)的微量滴定板的孔內(nèi)，可以簡化步驟，提高檢測效率。

用于直腸癌體外診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟：

（1）抗原的制備：通過分子克隆的方法將X型膠原蛋白α1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被于微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在 4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS（磷酸鹽緩沖液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質(zhì)量百分比濃度為0.05%；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每孔添加 200μl 封閉緩沖液（為含1.2％BSA（牛血清白蛋白）的PBS（磷酸鹽緩沖液）），用于封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

用于直腸癌體外診斷試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟：

（1） 抗原的制備：通過分子克隆的方法將X型膠原蛋白α1基因克隆到真核表達載體，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)蛋白的表達，純化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用；

（2）捕獲抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的單克隆抗體，所述單克隆抗體作為本試劑盒的捕獲抗體；

（3）檢測抗體的制備：將上述抗原免疫哺乳動物得到相應(yīng)的多克隆抗體，所述多克隆抗體作為本試劑盒的檢測抗體；

（4）捕獲抗體包被：

①.用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6) 將濃度為 1μg/ml 的捕獲抗體包被 微量滴定板的孔；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在 4℃下孵育過夜；

③.棄去包被液（碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液稀釋的捕獲抗體），并用洗滌液洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入 200 μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液，可以是含0.05%吐溫-20的pH7.4的磷酸鹽緩沖液），在水槽上方輕輕甩動微量滴定板，除去洗滌液，在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4℃環(huán)境中備用；所述洗滌液為PBS（磷酸鹽緩沖液）中加入一定量的Tween 20，所述Tween 20的質(zhì)量百分比濃度為0.05%；

（5）封閉

①.在微量滴定板的每個孔添加 200μl 封閉緩沖液（1.2％BSA/PBS），封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點；

②.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育1小時；

（6）加樣

①.將 100 μl 適當(dāng)稀釋（稀釋20倍）的樣品添加到每個孔，在 37℃ 下孵育 60 分鐘;要得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號。每個酶標(biāo)板都必須測定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測定或三重測定）和空白樣，以確保準(zhǔn)確性；

②.棄去樣品，并洗滌微量滴定板三次，每次在微孔中加入 200μl PBST（磷酸鹽吐溫緩沖液）；

③.將 100 μl濃度為 0.5μg/ml的檢測抗體添加到每個孔；

④.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育 1小時；

⑤.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

⑥.添加 100 μl 標(biāo)記二抗，其在使用前便已在PBS中稀釋10000倍（1：10000），所述標(biāo)記二抗可以為HRP標(biāo)記羊抗兔；

⑦.用粘合塑料制品封蓋微量滴定板并在37℃孵育 1小時；

⑧.用 PBST 洗滌微量滴定板四次；

(7)檢測

①.將 TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺） 溶液添加到每個孔，孵育 15-30 分鐘，添加等體積的終止液 (2 M H₂SO₄)，然后用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 處讀取光密度；

②.由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在 X 軸（對數(shù)標(biāo)度）上，而吸光度標(biāo)在 Y軸（線性標(biāo)度）上，通過內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。

本發(fā)明用于直腸癌體外診斷試劑盒把X型膠原蛋白α1升高作為診斷早中期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn),檢測原理如圖1所示；X型膠原蛋白α1下降作為直腸癌治療效果評估的標(biāo)準(zhǔn)。可以用于臨床上通過檢測血中腫瘤標(biāo)記物水平的高低對直腸癌的治療效果進行動態(tài)評估。另外還可以用于臨床上對直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷的應(yīng)用；也可用于直腸癌診斷。

試驗效果說明

雙抗體夾心 ELISA最佳實驗條件的選擇

包被鼠抗X型膠原蛋白α1單抗最佳工作濃度的選擇 ：根據(jù)方陣法確定包被濃度為1ug/mL時，單克隆抗體的OD值為1.05，所以其最佳包被濃度為1ug/mL。如圖2所示， 兔抗X型膠原蛋白α1多抗最佳工作濃度的選擇：隨著單抗稀釋倍數(shù)的增加，待測直腸癌病例血清和正常人血清 OD值有遞減的趨勢，當(dāng)抗體濃度為 1：200時，陽性對照 (陽性對照 OD值減去空白對照 OD值 )與正常對照 (正常對照 OD值減去空白對照 OD值 )A450nm之比 (簡稱 P／N值 )較高，故選擇兔抗人抗體最佳工作濃度為 1：200。血清摸索的最佳工作濃度為 1：25。封閉液摸索最佳工作溶度為 1.2％BSA。

臨床血清標(biāo)本檢測

共檢測了50份血清標(biāo)本，以醫(yī)院經(jīng)病理確診為直腸癌患者血清為陽性對照組（34例（其中早期直腸癌15例，晚期直腸癌19例）），非直腸癌患者包括直腸息肉、正常人群血清為陰性對照組（85例（正常50例，直腸息肉35例）） ，PBST為空白對照，通過上述雙抗夾心ELISA法進行定性及定量檢測臨床血清標(biāo)本。如圖2所示，以 P／N值 >2為雙抗夾心ELISA陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，以病理診斷為標(biāo)準(zhǔn)對臨床血清標(biāo)本進行檢測, 圖3說明直腸癌患者血清中X型膠原蛋白α1的水平顯著高于正常人（P<0.01）。早期直腸癌結(jié)果檢測靈敏性（SN）為 58％（9/15），晚期直腸癌檢測靈敏性（SN）為 73％（14/19）；正常人檢測特異性（SP）為 72％（36/50），直腸息肉患者檢測特異性（SP）為 61％（21/35）。見圖4-5.

臨床對直腸癌的治療效果進行動態(tài)評估

為確定本試劑盒能否用于對直腸癌的治療效果進行動態(tài)評估，我們收集了27份直腸癌患者治療前后的血清。27個患者的檢測結(jié)果參見圖6，結(jié)果顯示直腸癌患者治療前后的血清中X型膠原蛋白α1的水平有顯著差異（P<0.05）。有效治療后血清中X型膠原蛋白α1的水平會大大下降，提示本試劑盒能用于對直腸癌的治療效果進行動態(tài)評估。