本發(fā)明涉及青霉素技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡。

背景技術(shù)：

青霉素又被稱為青霉素G、peillin G、 盤尼西林、配尼西林、青霉素鈉、芐青霉素鈉、青霉素鉀、芐青霉素鉀。青霉素是抗菌素的一種，是指分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是由青霉菌中提煉出的抗生素。青霉素屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素,β－內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類、單環(huán)類、頭霉素類等。青霉素是很常用的抗菌藥品。但每次使用前必須做皮試，以防過(guò)敏。

目前大多數(shù)青霉素檢測(cè)都是采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，但這些方法過(guò)于繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)成本較高，不能滿足快速檢測(cè)的要求，為此提供一種青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

（一）解決的技術(shù)問(wèn)題

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡，解決了檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)和檢測(cè)成本高的問(wèn)題。

（二）技術(shù)方案

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種青霉素檢測(cè)卡，包括試劑和儀器，檢測(cè)卡制作包括如下步驟：

S1，青霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的制備，取40-60mg青霉素鈉鹽溶于1.5-2.5ml水中，用8-12ml PB緩沖液（0.1mol/L PH 6.0）溶解40-60mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入0.8-1.2ml 10%戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下攪拌1.5-2.5h，用雙蒸水透析4-6天，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集；

S2，膠體金溶液的制備，取100-200ml去離子水中加入1-2ml 1%檸檬酸三鈉，煮沸后加入1-2ml 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸8-12min，冷卻后，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

S3，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備，取已制備完成的50-150ml膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液將PH調(diào)至到8.0，一邊攪拌上述溶液一邊加入1.0-2.0mg抗青霉素單抗，攪拌20-30min，再逐漸滴入1-3ml 25mol/L聚乙二醇20000，攪拌12-18min，然后上述溶液用20000rpm的高速冷凍離心機(jī)離心15min，棄除上層清液，加入8-12ml PH 7.4PBS緩沖液清洗兩次，用4-6ml含2%BSA的PBS緩沖液溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體在4℃的溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

S4，青霉素檢測(cè)卡的制備，將適當(dāng)濃度的青霉素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，完成后，在37℃的烘干箱內(nèi)干燥7-9h，將適當(dāng)濃度的膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體噴在膠體金結(jié)合墊上，然后再37℃的烘干箱內(nèi)干燥7-9h,在一個(gè)底板上依次粘上硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、檢測(cè)線、控制線和吸水墊。

優(yōu)選的，所述試劑包括青霉素鈉鹽、PB緩沖液、牛血清白蛋白、戊二醛溶液、去離子水、檸檬酸三鈉、氯金酸、碳酸鉀溶液、抗青霉素單抗、聚乙二醇20000、PH7.4PBS緩沖液、PBS緩沖液和羊抗鼠IgG。

優(yōu)選的，所述儀器包括濾膜、酒精燈、高速冷凍離心機(jī)、無(wú)菌過(guò)濾器、儲(chǔ)備箱和烘干箱。

一種青霉素檢測(cè)方法，用待檢驗(yàn)樣品溶液滴入到膠體金結(jié)合墊上，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細(xì)管作用向另一端擴(kuò)散，在擴(kuò)散的過(guò)程中，抗原和抗體會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過(guò)免疫膠體金的顏色現(xiàn)實(shí)出來(lái)，如果樣品溶液中含有青霉素，青霉素先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)唄樣品溶液中的青霉素占據(jù)而無(wú)法與檢測(cè)線上青霉素抗原結(jié)合，當(dāng)樣品中的青霉素含量超過(guò)檢測(cè)卡檢測(cè)最大限度時(shí)，檢測(cè)卡上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至?xí)@示無(wú)色，判定為陽(yáng)性，當(dāng)樣品中青霉素含量較低時(shí)，檢測(cè)卡上檢測(cè)線顯色與控制線相近甚至顯示顏色較深，判定為陰性。

優(yōu)選的，取1-4ml原奶加入10ml離心管中，再加入60μL 3mol/L HCI溶液，振蕩30-40秒，加入2-6ml乙酸乙酯，劇烈振蕩1-2分鐘，靜置分層，去2-4ml上層溶液到另一離心管中，加入250μL PB緩沖液（0.1mol/L PH 7.4）,振蕩1-2分鐘，靜置分層，吸取80-150μL下層溶液，取出檢測(cè)卡，用滴灌吸取待檢溶液，在硝酸纖維素膜上滴入2-4滴，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3-6分鐘后讀取，其他時(shí)間判斷無(wú)效。

（三）有益效果

本發(fā)明提供了一種青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡，具備以下有益效果：

（1）該青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡，通過(guò)將所需的大部分原料整合到檢測(cè)卡上，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在檢測(cè)卡上快速進(jìn)行，大大縮短了檢樣時(shí)間，且樣品無(wú)需特殊處理，滴樣3-6分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需特殊儀器輔助，普通人員均可操作，不需要專業(yè)培訓(xùn)，極易使用。

（2）該青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡，建構(gòu)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉，檢測(cè)準(zhǔn)確率高，從而可以極大的提高青霉素的檢測(cè)率，以及節(jié)約檢測(cè)成本。

具體實(shí)施方式

基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：一種青霉素檢測(cè)卡，包括試劑和儀器，試劑包括青霉素鈉鹽、PB緩沖液、牛血清白蛋白、戊二醛溶液、去離子水、檸檬酸三鈉、氯金酸、碳酸鉀溶液、抗青霉素單抗、聚乙二醇20000、PH7.4PBS緩沖液、PBS緩沖液和羊抗鼠IgG，儀器包括濾膜、酒精燈、高速冷凍離心機(jī)、無(wú)菌過(guò)濾器、儲(chǔ)備箱和烘干箱，檢測(cè)卡制作包括如下步驟：

S1，青霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的制備，取40-60mg青霉素鈉鹽溶于1.5-2.5ml水中，用8-12ml PB緩沖液（0.1mol/L PH 6.0）溶解40-60mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入0.8-1.2ml 10%戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下攪拌1.5-2.5h，用雙蒸水透析4-6天，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集；

S2，膠體金溶液的制備，取100-200ml去離子水中加入1-2ml 1%檸檬酸三鈉，煮沸后加入1-2ml 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸8-12min，冷卻后，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

S3，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備，取已制備完成的50-150ml膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液將PH調(diào)至到8.0，一邊攪拌上述溶液一邊加入1.0-2.0mg抗青霉素單抗，攪拌20-30min，再逐漸滴入1-3ml 25mol/L聚乙二醇20000，攪拌12-18min，然后上述溶液用20000rpm的高速冷凍離心機(jī)離心15min，棄除上層清液，加入8-12ml PH 7.4PBS緩沖液清洗兩次，用4-6ml含2%BSA的PBS緩沖液溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體在4℃的溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

S4，青霉素檢測(cè)卡的制備，將適當(dāng)濃度的青霉素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，完成后，在37℃的烘干箱內(nèi)干燥7-9h，將適當(dāng)濃度的膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體噴在膠體金結(jié)合墊上，然后再37℃的烘干箱內(nèi)干燥7-9h,在一個(gè)底板上依次粘上硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、檢測(cè)線、控制線和吸水墊。

一種青霉素檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括如下步驟：取1-4ml原奶加入10ml離心管中，再加入60μL 3mol/L HCI溶液，振蕩30-40秒，加入2-6ml乙酸乙酯，劇烈振蕩1-2分鐘，靜置分層，去2-4ml上層溶液到另一離心管中，加入250μL PB緩沖液（0.1mol/L PH 7.4）,振蕩1-2分鐘，靜置分層，吸取80-150μL下層溶液，取出檢測(cè)卡，用滴灌吸取待檢溶液，在硝酸纖維素膜上滴入2-4滴，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3-6分鐘后讀取，其他時(shí)間判斷無(wú)效，用待檢驗(yàn)樣品溶液滴入到膠體金結(jié)合墊上，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細(xì)管作用向另一端擴(kuò)散，在擴(kuò)散的過(guò)程中，抗原和抗體會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過(guò)免疫膠體金的顏色現(xiàn)實(shí)出來(lái)，如果樣品溶液中含有青霉素，青霉素先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)唄樣品溶液中的青霉素占據(jù)而無(wú)法與檢測(cè)線上青霉素抗原結(jié)合，當(dāng)樣品中的青霉素含量超過(guò)檢測(cè)卡檢測(cè)最大限度時(shí)，檢測(cè)卡上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至?xí)@示無(wú)色，判定為陽(yáng)性，當(dāng)樣品中青霉素含量較低時(shí)，檢測(cè)卡上檢測(cè)線顯色與控制線相近甚至顯示顏色較深，判定為陰性。

實(shí)施例1

一種青霉素檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括如下步驟：

S1，青霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的制備，取40mg青霉素鈉鹽溶于1.5ml水中，用8ml PB緩沖液（0.1mol/L PH 6.0）溶解40mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入0.8ml 10%戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下攪拌1.5h，用雙蒸水透析4天，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集；

S2，膠體金溶液的制備，取100ml去離子水中加入1ml 1%檸檬酸三鈉，煮沸后加入1ml 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸8min，冷卻后，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

S3，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備，取已制備完成的50ml膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液將PH調(diào)至到8.0，一邊攪拌上述溶液一邊加入1.0mg抗青霉素單抗，攪拌20min，再逐漸滴入1ml 25mol/L聚乙二醇20000，攪拌12min，然后上述溶液用20000rpm的高速冷凍離心機(jī)離心15min，棄除上層清液，加入8ml PH 7.4PBS緩沖液清洗兩次，用4ml含2%BSA的PBS緩沖液溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體在4℃的溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

S4，青霉素檢測(cè)卡的制備，將適當(dāng)濃度的青霉素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，完成后，在37℃的烘干箱內(nèi)干燥7h，將適當(dāng)濃度的膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體噴在膠體金結(jié)合墊上，然后再37℃的烘干箱內(nèi)干燥7h,在一個(gè)底板上依次粘上硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、檢測(cè)線、控制線和吸水墊；

取1ml原奶加入10ml離心管中，再加入60μL 3mol/L HCI溶液，振蕩30秒，加入2ml乙酸乙酯，劇烈振蕩1分鐘，靜置分層，去2ml上層溶液到另一離心管中，加入250μL PB緩沖液（0.1mol/L PH 7.4）,振蕩1分鐘，靜置分層，吸取80μL下層溶液，取出檢測(cè)卡，用滴灌吸取待檢溶液，在硝酸纖維素膜上滴入2滴，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在3分鐘后讀取，其他時(shí)間判斷無(wú)效。

實(shí)施例2

一種青霉素檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括如下步驟：

S1，青霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的制備，取50mg青霉素鈉鹽溶于2ml水中，用10ml PB緩沖液（0.1mol/L PH 6.0）溶解50mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入1.0ml 10%戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下攪拌2h，用雙蒸水透析5天，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集；

S2，膠體金溶液的制備，取150ml去離子水中加入1.5ml 1%檸檬酸三鈉，煮沸后加入1.5ml 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸10min，冷卻后，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

S3，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備，取已制備完成的100ml膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液將PH調(diào)至到8.0，一邊攪拌上述溶液一邊加入1.5mg抗青霉素單抗，攪拌25min，再逐漸滴入2ml 25mol/L聚乙二醇20000，攪拌15min，然后上述溶液用20000rpm的高速冷凍離心機(jī)離心15min，棄除上層清液，加入10ml PH 7.4PBS緩沖液清洗兩次，用5ml含2%BSA的PBS緩沖液溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體在4℃的溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

S4，青霉素檢測(cè)卡的制備，將適當(dāng)濃度的青霉素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，完成后，在37℃的烘干箱內(nèi)干燥8h，將適當(dāng)濃度的膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體噴在膠體金結(jié)合墊上，然后再37℃的烘干箱內(nèi)干燥8h,在一個(gè)底板上依次粘上硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、檢測(cè)線、控制線和吸水墊；

取2.5ml原奶加入10ml離心管中，再加入60μL 3mol/L HCI溶液，振蕩35秒，加入4ml乙酸乙酯，劇烈振蕩1.5分鐘，靜置分層，去3ml上層溶液到另一離心管中，加入250μL PB緩沖液（0.1mol/L PH 7.4）,振蕩1.5分鐘，靜置分層，吸取120μL下層溶液，取出檢測(cè)卡，用滴灌吸取待檢溶液，在硝酸纖維素膜上滴入3滴，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在4分鐘后讀取，其他時(shí)間判斷無(wú)效。

實(shí)施例3

一種青霉素檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括如下步驟：

S1，青霉素與載體蛋白偶聯(lián)物的制備，取60mg青霉素鈉鹽溶于2.5ml水中，用12ml PB緩沖液（0.1mol/L PH 6.0）溶解60mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再緩慢加入1.2ml 10%戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下攪拌2.5h，用雙蒸水透析6天，用濾膜進(jìn)行過(guò)濾，收集；

S2，膠體金溶液的制備，取200ml去離子水中加入2ml 1%檸檬酸三鈉，煮沸后加入2ml 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸12min，冷卻后，在4℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

S3，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體的制備，取已制備完成的150ml膠體金溶液，用0.1mol/L碳酸鉀溶液將PH調(diào)至到8.0，一邊攪拌上述溶液一邊加入2.0mg抗青霉素單抗，攪拌30min，再逐漸滴入3ml 25mol/L聚乙二醇20000，攪拌18min，然后上述溶液用20000rpm的高速冷凍離心機(jī)離心15min，棄除上層清液，加入12ml PH 7.4PBS緩沖液清洗兩次，用6ml含2%BSA的PBS緩沖液溶解，用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體在4℃的溫度下保存?zhèn)溆茫?/p>

S4，青霉素檢測(cè)卡的制備，將適當(dāng)濃度的青霉素載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，完成后，在37℃的烘干箱內(nèi)干燥9h，將適當(dāng)濃度的膠體金標(biāo)記抗青霉素單克隆抗體噴在膠體金結(jié)合墊上，然后再37 ℃的烘干箱內(nèi)干燥9h,在一個(gè)底板上依次粘上硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、檢測(cè)線、控制線和吸水墊；

取4ml原奶加入10ml離心管中，再加入60μL 3mol/L HCI溶液，振蕩40秒，加入6ml乙酸乙酯，劇烈振蕩2分鐘，靜置分層，去4ml上層溶液到另一離心管中，加入250μL PB緩沖液（0.1mol/L PH 7.4）,振蕩2分鐘，靜置分層，吸取150μL下層溶液，取出檢測(cè)卡，用滴灌吸取待檢溶液，在硝酸纖維素膜上滴入4滴，加樣后開始計(jì)時(shí)，結(jié)果應(yīng)在6分鐘后讀取，其他時(shí)間判斷無(wú)效。

其中：冷凍離心機(jī)就是利用離心力使得需要分離的不同物料得到加速分離的機(jī)器，其型號(hào)為GL-20C。

綜上所述，該青霉素檢測(cè)方法及檢測(cè)卡，當(dāng)樣品中的青霉素含量超過(guò)檢測(cè)卡檢測(cè)最大限度時(shí)，檢測(cè)卡上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至?xí)@示無(wú)色，判定為陽(yáng)性，當(dāng)樣品中青霉素含量較低時(shí)，檢測(cè)卡上檢測(cè)線顯色與控制線相近甚至顯示顏色較深，判定為陰性。

需要說(shuō)明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語(yǔ)僅僅用來(lái)將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來(lái)，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒(méi)有更多限制的情況下。由語(yǔ)句“包括一個(gè)......限定的要素，并不排除在包括所述要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素”。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。