專利名稱：一種抗寄生蟲(chóng)新抗生素及其鹽類(lèi)的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能從微生物培養(yǎng)物中提取抗寄生蟲(chóng)的新抗生物質(zhì)戒臺(tái)霉素(JEITACINS)及其鹽類(lèi)的制造方法。該抗生素及其可作藥用的鹽類(lèi)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
式中R＝異丙基或異丁基已經(jīng)知道，作為抗寄生蟲(chóng)的藥物，在抗生素中，有奧佛麥菌素(AVERMECTIN)、巴龍霉素(PAROMOMYCIN)，在合成藥中，有左旋咪唑(LEVAMISOLE)、氯硝柳胺(NICLOSAMIDE)等。這些藥物作為醫(yī)藥品和動(dòng)物藥被用于治療線蟲(chóng)病、絲蟲(chóng)病等，其效果是肯定的。但是，已知的抗寄生蟲(chóng)藥物具有毒性、副作用或耐藥性等問(wèn)題。
本發(fā)明的目的，是要尋找毒副作用更小的抗寄生蟲(chóng)藥物，以期提供有抗寄生蟲(chóng)活性的物質(zhì)，解決人和動(dòng)物治療中的需求。
本發(fā)明的要點(diǎn)，是以探索新的生物活性物質(zhì)為目標(biāo)，從不同土壤樣品中分離菌種，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了KP-197菌株，在其培養(yǎng)物中含有抑制寄生蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)活性的物質(zhì)。從該菌株的培養(yǎng)物中分離和精制出兩個(gè)抑制寄生蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)活性的純物質(zhì)。研究了這兩個(gè)物質(zhì)的理化特性，測(cè)定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。具有這種化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，尚未見(jiàn)到報(bào)道。這些物質(zhì)統(tǒng)稱為戒臺(tái)霉素(JEITACINS)。結(jié)構(gòu)式中R為異丙基的化合物叫戒臺(tái)霉素A(JEITACINSA)，R為異丁基的化合物叫戒臺(tái)霉素B(JEITACINSB)。戒臺(tái)霉素A和戒臺(tái)霉素B的理化性質(zhì)如下戒臺(tái)霉素A(1)白色粉末(2)元素分析C18H34N2O2計(jì)算值C69.57;H11.04;N9.02%實(shí)驗(yàn)值C70.40;H11.09;N7.68%(3)分子量及分子式戒臺(tái)霉素A的質(zhì)譜，在m/z311處有(M+H)+的分子離子峰;在高分辨率質(zhì)譜分析中，在m/z293處有(M-OH)+的離子峰。由此確定，其分子式C18H34N2O2，分子量是310。
(4)紫外吸收光譜如圖1所示，在228mm處有一個(gè)特征性的吸收峰;在250nm處出現(xiàn)一個(gè)肩峰。
(5)紅外吸收光譜用KBr溶劑法測(cè)定，如圖2所示，其主要吸收極大波數(shù)如下2950、2870、1705、1475、1415、1380、1270、1090、960(cm-1)。
(6)核磁共振譜使用瓦利安XL-400，400MH核磁共振儀，在重氯仿中測(cè)定的1H核磁共振譜如圖3所示。
(7)呈色反應(yīng)對(duì)甲氧基苯甲醛-硫酸陽(yáng)性高錳酸鉀陽(yáng)性硫酸陰性德拉根道夫試驗(yàn)陰性(8)溶解性溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿、己烷、二甲基亞砜。不溶于甲醇、水。
(9)化學(xué)結(jié)構(gòu)上述技術(shù)領(lǐng)域闡明的結(jié)構(gòu)式中，R為異丙基的結(jié)構(gòu)式，是根據(jù)(1)-(9)所列理化性質(zhì)與已知類(lèi)似化合物進(jìn)行比較得到的，它是14-甲基-1-乙烯偶氮氧15-烷-8酮。
戒臺(tái)霉素B(1)無(wú)色油狀物(2)分子式，在高分辨質(zhì)譜分析中，于m/z307處有(M-N)離子峰，由此確定起其分子式為C19H26N2O2，分子量為324。
(3)紫外吸收光譜同戒臺(tái)霉素A(4)紅外吸收光譜同戒臺(tái)霉素A(5)呈色反應(yīng)同戒臺(tái)霉素A(6)溶解性
同戒臺(tái)霉素A(7)化學(xué)結(jié)構(gòu)戒臺(tái)霉素B是戒臺(tái)霉素A的類(lèi)似物，兩者在烷基側(cè)鏈上的炭原子數(shù)不同。
上述技術(shù)領(lǐng)域闡明的結(jié)構(gòu)式中，R是異丁基的結(jié)構(gòu)式，是根據(jù)(1)-(7)所列理化性質(zhì)與已知化合物進(jìn)行比較得到的結(jié)果，它是15-甲基-1-乙烯偶氮氧基16烷-8酮。
能產(chǎn)生戒臺(tái)霉素的微生物屬于鏈霉菌屬，例如在本發(fā)明中分離到的鏈霉菌屬的KP-197菌株，是在本發(fā)明中使用的最有效菌株之一。該菌株的分類(lèi)學(xué)特性如下(1)在各種培養(yǎng)基上的營(yíng)養(yǎng)菌絲發(fā)達(dá)，未觀察到菌絲斷裂。在淀粉無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上，氣生菌絲很稀少，白色，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，孢子絲是直線狀，孢子鏈由20個(gè)以上孢子組成，孢子大小為0.7-1.0×0.7μm，圓柱形，孢子表面光滑，未發(fā)現(xiàn)菌核，孢子囊以及游動(dòng)孢子。
(2)在各種培養(yǎng)基上的特征用塞戈瓦(E.B.SHIRLING和D.G.GOTTLIEB-國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志16卷313頁(yè)，1966年)法研究該產(chǎn)生菌的培養(yǎng)特征，結(jié)果如表所示(見(jiàn)第3頁(yè)表)(3)生理特性黑色素形成陽(yáng)性酪氨酸瓊脂陽(yáng)性蛋白胨酵母膏鐵瓊脂陽(yáng)性葡萄糖蛋白胨明膠培養(yǎng)基(21-23℃)陽(yáng)性胰蛋白胨酵母膏液體培養(yǎng)基陽(yáng)性酪氨酸酶反應(yīng)陽(yáng)性硫化氫的產(chǎn)生陰性硝酸鹽還原陽(yáng)性明膠液化(葡萄糖、蛋白胨、明膠培養(yǎng)基)(21-23℃)陽(yáng)性淀粉水解陽(yáng)性牛奶凝固(37℃)陰性牛奶胨化(37℃)陽(yáng)性生卡溫度范圍15-38℃炭源利用(采用普戈瓦PRIDHOM-GOTTLIEB瓊脂作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基)
利用D-葡萄糖，D-果糖、甘露糖稍利用D-甘露醇，(-阿拉伯糖，D-木糖、蔗糖，不利用L-鼠李糖，I-肌醇、棉子糖、密二糖、水楊酸。
纖維素分解陰性(4)細(xì)胞壁組成細(xì)胞壁的二氨基庚二酸(DAP)是LL-DAP。
綜上所述，該菌株的分類(lèi)學(xué)特征可以歸納如下細(xì)胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子絲的形狀是直線形，孢子鏈，孢子表面光滑，營(yíng)養(yǎng)菌絲為米色，氣生菌絲為白色，形成黑色素。由此可以確定，該菌株屬鏈霉菌屬(STREPTOMYCES)的一種。根據(jù)普柴氏分類(lèi)法(PRIDHAMANDTRESNER)(伯述瓦細(xì)菌分類(lèi)手冊(cè)第八版748-829頁(yè)，1974年)，確認(rèn)該產(chǎn)生的菌株屬于白色系列的一種。
在本發(fā)明中，作為在培養(yǎng)基中的微生物的例子，首先使用了能產(chǎn)生戒臺(tái)霉素的屬于鏈霉菌屬的微生物。然而，只要能產(chǎn)生戒臺(tái)霉素的該菌株的變株，在本發(fā)明中亦可使用。
作為培養(yǎng)基，可以使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基通常含有適于培養(yǎng)放線菌的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽類(lèi)以及適量必要的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
培養(yǎng)基中的碳源可以使用葡萄糖、甘油、果糖、麥芽糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、淀粉及其水解物等各種碳水化合物，使用濃度通常為0.1-5%。此外還有葡萄糖酸、丙酮酸、乳酸、醋酸等有機(jī)酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸、甲醇、乙醇等醇類(lèi)化合物，以及正鏈烷烴等非芳香族碳?xì)浠衔锘蛘邉?dòng)植物的各種油脂類(lèi)均可使用。
作為氮源，可以使用銨、氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸銨鹽、尿素、蛋白胨、NZ-胺、肉膏、酵母膏、干酵母、玉米漿、酪蛋白水解物、魚(yú)粉或其水解物、大豆粉或其水解物、脫脂大豆或其水解物等含氮有機(jī)物質(zhì)。還有甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸等氨基酸。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)使用各種磷酸鹽、硫酸鹽、食鹽等以及微量的重金屬鹽類(lèi)。
在使用有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的變異株時(shí)，必須在培養(yǎng)基中添加能滿足其營(yíng)養(yǎng)要求的物質(zhì)。這樣的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在使用含有天然物質(zhì)的培養(yǎng)基時(shí)，不須特別添加補(bǔ)充。
發(fā)酵培養(yǎng)，通常是在振動(dòng)或通氣攪拌等好氣條件下進(jìn)行。實(shí)際生產(chǎn)時(shí)是采用深層通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)基的pH值可以是5-8，但一般以中性pH較好。培養(yǎng)溫度可以為20-40℃，但一般在26-32℃較好(理想溫度為27℃左右)。液體培養(yǎng)基時(shí)間通常為3-6日，戒臺(tái)霉素的效價(jià)達(dá)到最高峰時(shí)停止培養(yǎng)。培養(yǎng)基成份、培養(yǎng)溫度、攪拌速度、通氣量等培養(yǎng)條件，根據(jù)使用的菌株和外界條件可適當(dāng)調(diào)整選定，液體培養(yǎng)出現(xiàn)泡沫時(shí)可適當(dāng)選用硅酮樹(shù)脂、植物油等表面活性劑消沫。
用上述方法在培養(yǎng)物中積累的戒臺(tái)霉素，通常存在于培養(yǎng)液中。為了從培養(yǎng)濾液中提取戒臺(tái)霉素，一般采用從微生物培養(yǎng)物中提取代謝產(chǎn)物的方法。這些方法可以單獨(dú)或者隨意結(jié)合或者反復(fù)使用。例如過(guò)濾、離心、透析、濃縮、干燥、冷凍、吸附、洗脫;對(duì)各種溶媒溶解度不同的方法(如沉淀、結(jié)晶、重結(jié)晶、轉(zhuǎn)溶、逆流配布)，層析等方法。
由于戒臺(tái)霉素主要產(chǎn)生在培養(yǎng)液中，因此為了分離、提取該化合物，首先從培養(yǎng)液中除去菌體，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)濾液中提取該物質(zhì)。
為了從培養(yǎng)濾液中提取戒臺(tái)霉素，使用非親水性的有機(jī)溶媒如乙酸乙脂等抽提，或者用活性炭、氧化鋁、多孔性高分子合成樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂等進(jìn)行吸附，再用乙酸乙脂等溶媒洗脫，得到的提取液或洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，再用己烷等提取。這樣得到的粗提物，用通常精制脂溶性物質(zhì)的方法如硅膠或氧化鋁柱層析等進(jìn)行精制。
該化合物可作藥用的鹽類(lèi)如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸、琥珀酸鹽等，使用常規(guī)方法可以制備。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是，用上述方法制備的活性物質(zhì)，其抗寄生蟲(chóng)幕钚員認(rèn)鐘幸┪鍇浚潿拘勻幢認(rèn)鐘幸┪锏?。緡撳实验是疫\(yùn)墑饗叱媯˙URSAPHLENCHUSLIGNICLOUS)作為治療對(duì)象，采用木村等介紹的方法(AGRICULTUREBIOLOGICAICHEMISRY45，249，1981)測(cè)定戒臺(tái)霉素抑制松樹(shù)線蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)活性，其結(jié)果是戒臺(tái)霉素A對(duì)線蟲(chóng)的致死率(%)0.5ug/ml100%0.25ug/ml100%0.125ug/ml99%0.063ug/ml86%戒臺(tái)霉素B對(duì)線蟲(chóng)的致死率(%)0.5ug/ml100%
0.25ug/ml100%0.125ug/ml93%0.063ug/ml80%已知藥物AVERMECTINBLA對(duì)線蟲(chóng)的致死率(%)5ug/ml100%2.5ug/ml100%1.25ug/ml64%0.63ug/ml58%從以上比較試驗(yàn)以看出，戒臺(tái)霉素的抗寄生蟲(chóng)活性比已知藥物強(qiáng)十倍以上，前者療效明顯優(yōu)于后者。
急性毒性試驗(yàn)是用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)腹腔途徑注射戒臺(tái)霉素10mg/kg不致死，用相同方法觀察已知藥AVERMECTINBLA的急性毒形，結(jié)果小鼠死亡?？梢?jiàn)，戒臺(tái)霉素的急性低于已知抗寄生蟲(chóng)藥物。
以上活性及毒性試驗(yàn)表明，本發(fā)明所得到的戒臺(tái)霉素，作為人、動(dòng)物和植物的抗寄生蟲(chóng)藥是有用的。
實(shí)施例在500ml板口瓶中裝入100ml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成份葡萄糖0.1%，馬鈴薯淀粉0.4%，蛋白胨0.5%，肉膏0.3%，酵母膏0.5%，碳酸鈣0.4%，pH7.0)，121℃，15分鐘蒸汽滅菌后，將一白金耳的KP-197的斜面培養(yǎng)物(其成份甘油1.0%，蘋(píng)果酸鈣1.0%，酵母膏0.1%，瓊脂1.5%)種入上述滅菌的培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)搖床上27℃培養(yǎng)三天，將該培養(yǎng)作為種子。備30升的發(fā)酵罐二個(gè)，每個(gè)裝入15升培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基成份甘油2.0%，黃豆粉2.0%，NaCl0.3%，瓜氨酸0.01%，CoCl0.002%，pH7.0)，121℃30分鐘蒸汽滅菌后，往每個(gè)發(fā)酵罐中種入6瓶上述種子，攪拌速度250r.p.m通氣量15升/分，27℃120小時(shí)培養(yǎng)。
培養(yǎng)物離心(10，000r.p.m)，分離菌體和培養(yǎng)液，得到上清液30升，用6NHCl將上述清液的pH值調(diào)至3.0，再離心，得到沉淀物，往沉淀物中加入15升50%丙酮溶液，攪拌，提取，過(guò)濾，得到提取液，將其減壓濃縮至6升，加入3升乙酸乙酯，振動(dòng)提取二次，得到的乙酸乙酯提取液，減壓濃縮，得到油狀粗提物，往粗提物中加入750ml己烷，提取兩次得到己烷提取液，減壓濃縮，得到粗制品4克，粗制品裝入硅膠柱(馬克公司制，ART7734，160克)層析，用己烷-乙酸乙酯溶液(30∶1)溶出，分份收集，各部份用松樹(shù)線蟲(chóng)進(jìn)行生物檢定，活性部份合并，減壓濃縮，得到粗制品30毫克，溶于少量氯仿中，每次取1/20的量進(jìn)樣，用反向分離柱(山村化學(xué)研究所制，AM324(ODS，10×300mm)進(jìn)行高壓液相層析，用60%乙腈水洗出，流速每分鐘2毫升，收集顯示保留時(shí)間18.5分與19.6分的各峰的活性部份，減壓濃縮干燥，分別得到戒臺(tái)霉素A7.2毫克和戒臺(tái)霉素B5毫克。


圖1，戒臺(tái)霉素A的紫外吸收光譜(在環(huán)己烷中測(cè)定)圖2，戒臺(tái)霉素A的紅外吸收光譜(在KBr溶液中測(cè)定)圖3，戒臺(tái)霉素A的質(zhì)子的核磁共振譜(在重氯仿中測(cè)定)
權(quán)利要求
1.一種能從微生物培養(yǎng)物中提取抗寄生蟲(chóng)的新抗生物質(zhì)戒臺(tái)霉素及其鹽類(lèi)的制造方法，其特征在于它是由從鏈霉菌屬的KP-197菌株中，用非親水性的有機(jī)溶媒提取制備的。
2.按權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征是所說(shuō)的KP-197菌株，其細(xì)胞壁的二氨基庚二酸是LL-DAP，孢子絲的形狀呈直線形，孢子鏈長(zhǎng)，孢子表面光滑，營(yíng)養(yǎng)菌絲為米色，氣生菌絲為白色，能形成黑色素。
3.按權(quán)利要求2所述的制造方法，其特征是所說(shuō)的KP-197菌株，可在合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些培養(yǎng)基通常含有適于培養(yǎng)放線菌的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽類(lèi)的以及適量必要的其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)酵培養(yǎng)，通常是在振動(dòng)或通氣攪拌等好氣條件下進(jìn)行，深層通氣攪拌培養(yǎng)的溫度為20-40℃，PH值5-8，培養(yǎng)時(shí)間為3-6日。
4.按權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征是為從培養(yǎng)濾液中提取戒臺(tái)霉素，使用非親水性的有機(jī)溶媒乙酸乙酯抽提，或者用活性碳、氧化鋁、多孔性高分子合成樹(shù)脂、離子交換樹(shù)脂進(jìn)行吸附，再用乙酸乙酯溶媒洗脫，將得到的提取液或洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，再用乙烷提取，這樣得到的精提物，用通常精制酯溶性物質(zhì)的方法如硅膠或氧化鋁柱層析進(jìn)行精制。
5.按權(quán)利要求1和4所述的制造方法，其特征是該化合物可作藥用的鹽類(lèi)精鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽等，使用常規(guī)方法可以制備。
6.按權(quán)利要求4所述的制造方法，其特征是用此方提取制備的戒臺(tái)霉素A的分子式為C18H34N2O2，分子量為310，戒臺(tái)霉素B的分子式為C19H34N2O2，分子量為324。
7.按權(quán)利要求4所述的制造方法，其特征是用此方法制備的化合物，以松鼠線蟲(chóng)作為治療對(duì)象，用已知藥物AVERMECTIN BLA進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，結(jié)果表明，戒臺(tái)霉素的抗寄生蟲(chóng)活性比對(duì)照組強(qiáng)十倍以上，而其毒性卻比對(duì)照組低，因此，本發(fā)明所得到的戒臺(tái)霉素，作為人、動(dòng)物和植物的抗寄生蟲(chóng)藥物是有用的。
全文摘要
一種抗寄生蟲(chóng)新抗生素及其鹽類(lèi)的制造方法，其特點(diǎn)是，從KP-197菌株培養(yǎng)物中，用溶媒法分離，提取和精制出具有抗寄生蟲(chóng)活性的兩種物質(zhì)。該特質(zhì)的抗寄生蟲(chóng)活性明顯高于已知藥物，而其毒性卻低于已知藥物，故可成為治療人、動(dòng)物和植物寄生蟲(chóng)的有效藥物。
文檔編號(hào)C12P1/04GK1034580SQ8810018
公開(kāi)日1989年8月9日 申請(qǐng)日期1988年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1988年1月27日
發(fā)明者蘇學(xué)惠, 大村智, 田中晴雄, 乙黑一彥, 姚恩泰 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所, 北里研究所