專利名稱：圓球桿菌的bioA，bioD，bioF，bioC，bioH基因的克隆、載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及生物素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用DNA重組體的技術(shù)，通過(guò)發(fā)酵制備生物素。
生物素對(duì)于人類，動(dòng)物，植物和某些微生物來(lái)說(shuō)，是一個(gè)必需的維生素。
它可從蛋黃中分離出來(lái)，并可以以游離形式或與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在于啤酒酵母，谷物和各種器官中。
該維生素作為皮膚代謝的調(diào)節(jié)劑，可治療脂溢性皮炎。
除了前述的各種來(lái)源外，可用某些微生物合成生物素，尤其是用桿菌屬的微生物，例如圓球桿菌合成之。


圖1表示了在這類微生物中從庚二酸開始的生物素的生物合成鏈。這種生物合成鏈包括了不同的五個(gè)酶反應(yīng)，其中起作用的基因分別相繼是bioc，bioF，bioA，bioD和bioB。
對(duì)工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中的從庚二酸開始的生產(chǎn)生物素的系統(tǒng)性的研究，已顯示出某些微生物，尤其是屬于圓球桿菌屬的微生物能夠超生產(chǎn)(hyperproduisent)生物素和生物素的同效維生素(人們稱“同效維生素”(“Vitamères”)是指能導(dǎo)致生成生物素的各種中間體)。
對(duì)于這些細(xì)菌，在一些生物素的前驅(qū)當(dāng)中，DTB(脫硫生物素)代表了主導(dǎo)成分。它是大量地，而且比最終成分，即生物素，還要多的量被生產(chǎn)出來(lái)的。
實(shí)際上存在一種強(qiáng)烈的抑制生物素合成的轉(zhuǎn)錄控制，它取決于在培養(yǎng)基中生物素的量，這種阻遏出現(xiàn)在E.Coli(大腸桿菌)和圓球桿菌(Bacillussphaericus)中(下稱球桿菌)。
然而，在E.Coli中每一個(gè)反饋抑制都不調(diào)節(jié)生物素的合成，而且這種控制也從來(lái)沒有在球桿菌中描述過(guò)。
要對(duì)在球桿菌中從庚二酸開始的大量DTB(相對(duì)于較少量的生物素)的生產(chǎn)作出完整的解釋還必需進(jìn)行十分重要的生物學(xué)上分子結(jié)構(gòu)的研究，以及在這種細(xì)菌中生物素合成途徑的調(diào)節(jié)的研究。
初步的研究表明，某些從能生成DTB的球桿菌菌株(Souches)開始的，生物合成的提取物的和半凈制的酶，與已知的在E.Coli中的生物素的酶進(jìn)行比較，并不顯示出明顯的差別。
然而，通過(guò)這種球桿菌菌株的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)生物素(IFO3525，NCLB9370)，如果其生物素產(chǎn)率有所改進(jìn)，則可以與現(xiàn)有的化學(xué)方法相匹敵。為了達(dá)到這個(gè)目的，則應(yīng)使在這些菌株中所有生物合成生物素的基因都取得超表達(dá)(hyperexpression)。
當(dāng)然，人們已經(jīng)敘述過(guò)對(duì)去抑制的(déréprimées)E.Coli菌株的選擇，或是通過(guò)其耐生物素的類似物，如α-脫氫生物素的作用，或是通過(guò)選擇生物素的超分泌作用的突變體實(shí)施之。同樣地，也敘述過(guò)“順式支配”(“Cisdominantes”)的突變，而這種突變?cè)谑顾械纳锼鼗虮粯?gòu)成雙極性操縱子的合成過(guò)程中起了多效作用。同樣也敘述過(guò)反式的突變，除了其消除生物素的基因的轉(zhuǎn)錄控制的能力外，還常常具有多效作用的性質(zhì)，即能在細(xì)胞的生理學(xué)方面起反響。
如果假設(shè)在球桿菌菌株中(Souches)生物素生物合成的分子控制和生物素的基因的總結(jié)構(gòu)與E.Coli中的情況相同。那么，傳統(tǒng)的微生物的選擇方法也將適用于能生產(chǎn)DTB的球桿菌菌株中。
在所有這些假設(shè)中，在大量的工業(yè)發(fā)酵中和連續(xù)的培養(yǎng)中采用突變體菌株時(shí)，就需要選擇一些回復(fù)突變率很小的突變體。這就造成了一個(gè)難題，即在實(shí)際上缺乏在球桿菌中的精細(xì)的基因分析方法。
另有方法可以包括克隆(Cloner)所有的能生成DTB的從球桿菌菌株開始的生物素的生物合成鏈的基因。然后，在試管內(nèi)修飾控制區(qū)域中的5′以便消除轉(zhuǎn)錄控制。
而且，用已知的基因工程技術(shù)，特別采用已知在球桿菌菌株中起作用的強(qiáng)的啟動(dòng)子，在活體外進(jìn)行操作對(duì)這些基因進(jìn)行克隆能探討它們的一般結(jié)構(gòu)，而且能改進(jìn)它們?cè)诨铙w內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。
能夠通過(guò)采用已知的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或結(jié)合遷移等技術(shù)，實(shí)施所有這些超表達(dá)(hyperexprimés)基因的再引入(réintroduct-ion)，這些基因在球桿菌原始菌株中不再受生物素控制了(但是當(dāng)提高溫度或采用不太費(fèi)錢的基質(zhì)(Substrat)時(shí)會(huì)因此受影響而受到誘導(dǎo)控制)。
同樣地，可以把這些基因引入到在食品工業(yè)中可以接受的，而且能經(jīng)受庚二酸影響的許多不同的微生物中去，例如，枯草桿菌，麥酒的酶母屬，或者假單胞菌屬等菌株。
正如在法國(guó)專利8412598中所敘述的那樣，可以通過(guò)質(zhì)粒的自體選擇(autosélection)或者通過(guò)在染色體中的整合作用在這些微生物中實(shí)現(xiàn)基因信息的穩(wěn)定。
日本的專利JP-A-166992/85(1985年7月29日)，JP-A-66532/86(1986年3月25日)和JP-A-95724/86(1986年4月24日)已經(jīng)揭露過(guò)球桿菌的bioB基因的特征和克隆。
本發(fā)明尤其涉及為在這些細(xì)菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產(chǎn)的酶密碼的DNA順序-bioA基因-bioD基因-bioF基因-bioC基因-bioH基因一些據(jù)本發(fā)明的DNA順序與已予先鑒定的bioB基因相連接形成象“一組建筑組群”(“Cluster”)的組合，而該組合包括了大部分的生物素的生物合成鏈。
在這些有關(guān)的DNA順序中，應(yīng)該提及為由下列基因所生產(chǎn)的酶密碼的DNA順序-bioB和bioD，-bioB，bioD和bioA，-bioB，bioD，bioA和bioF，在適當(dāng)?shù)妮d體中使用這種類型的順序能夠從生物素的許多種同效維生素出發(fā)制備所需的生物素。
如下文要敘述的那樣，以上這些也可以通過(guò)使用能表達(dá)為由下列基因所生產(chǎn)的酶密碼的DNA順序-bioF和bioC-bioF和bioH-bioF，bioC和bioH，以及為(除了前述的順序外)下列基因密碼的順序
-bioA-bioA和bioD，或者-bioA，bioB和bioD的載體進(jìn)行發(fā)酵而制備出來(lái)。
盡管前述的DNA順序可以有不同的來(lái)源，但是最好采用來(lái)源于桿菌菌株的順序，特別是來(lái)源于球桿菌菌株的。
正如前述，這些DNA順序宜于沒有能在細(xì)菌中形成生物素的生物合成方法中的酶的轉(zhuǎn)錄控制的天然順序，以便能取消由于生物素的天然調(diào)整，以及能把這些DNA順序置于所選擇的成分的控制下，從而確保它們?cè)谒拗骶曛械挠行мD(zhuǎn)錄。
本發(fā)明特別涉及在圖4至8和圖17至19中所表示的整個(gè)或部分順序，而這些順序?yàn)榍懊嬉咽龅幕蛎艽a。
據(jù)本發(fā)明的DNA順序可以以各種方式加于利用。
這些有關(guān)的DNA順序最好是由一個(gè)質(zhì)粒載體攜帶，而該載體可用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌，而且還包含一個(gè)由幾個(gè)成分所組成，并能表達(dá)相應(yīng)基因的組合整體。
這種質(zhì)?？梢允亲灾餍秃妥泽w復(fù)制型的，或者相反地，可以整合到宿主菌株的染色體中。
實(shí)際上，所實(shí)施的各種技術(shù)是已知的，或者將在實(shí)例中敘述到。
然而，在整合載體的情況下，它至少應(yīng)包含一個(gè)出現(xiàn)在要轉(zhuǎn)化的菌株的基因組中的順序的同源順序，它將確保染色體的整合。它顯然可以涉及到，相應(yīng)于天然的基因順序的同源順序，或者通過(guò)其他的整合的質(zhì)粒載體所引入的同源順序。
當(dāng)載體是自主型和自體復(fù)制型時(shí)，該載體包含一個(gè)在宿主細(xì)胞中的有效復(fù)制的起源(Origine)。
同樣地，依靠要轉(zhuǎn)化的菌株的啟動(dòng)子，這些不同的質(zhì)粒載體可以包含能確保選擇的成分(elements)，例如防抗菌素的基因和/或基因標(biāo)志物。
在這些能起宿主菌株作用的細(xì)胞中，特別應(yīng)該提及以下一些細(xì)菌埃希氏桿菌屬，桿菌屬和假單胞菌屬以及一些酵母，尤其是酵母屬的酵母。
在這些相關(guān)的宿主細(xì)胞中，尤其應(yīng)該提及球桿菌，枯草桿菌和大腸埃希氏桿菌。
用于被據(jù)本發(fā)明的DNA順序所轉(zhuǎn)化的最相關(guān)的菌株應(yīng)該是一些這樣的菌株即它們已經(jīng)被能確保表達(dá)這生物合成過(guò)程中的其它基因的載體所轉(zhuǎn)化。也就是說(shuō)，正如在本專利申請(qǐng)中所敘述的基因F，A，D和B。
在這種條件下，把基因bioC和bioH引入到細(xì)菌中能允許這種細(xì)菌從鏈的第一同效維生素出發(fā)，即庚二酸鹽合成生物素，這在工業(yè)方面具有重要的經(jīng)濟(jì)好處。
在本發(fā)明的領(lǐng)域中，整合的質(zhì)粒載體最好是如下文要提及的質(zhì)粒PTG475，它尤其包含誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
當(dāng)載體包含自主復(fù)制的起源時(shí)，為前述的酶密碼的DNA順序最好是伴隨有一些能確保其在宿主菌株中表達(dá)的控制成分。它尤其涉及5′-末端的一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子，它在所述的菌株中是有效的，而且可能還涉及到其它的成分，例如當(dāng)宿主菌株是酵母或是其它的需要這種順序的微生物時(shí)，是結(jié)尾順序。
本發(fā)明也涉及被本發(fā)明的質(zhì)粒載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在這些細(xì)胞中尤其應(yīng)提及細(xì)菌，特別是桿菌屬，埃希氏桿菌屬或假單胞菌屬，同樣也包括酵母，尤其是酵母屬。
在這些能被這些載體所轉(zhuǎn)化的菌株中，應(yīng)該提及那些已生產(chǎn)生物素或其同效維生素的菌株。
本發(fā)明還涉及制備生物素的方法，其中包括用前面已述的那些細(xì)胞發(fā)酵至少含有庚二酸的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或該生物素的同效維生素，這些細(xì)胞能接受庚二酸或所說(shuō)的生物素的同效維生素的影響，然后回收所生成的生物素。
本發(fā)明的方法可以用不同的變種實(shí)施之。
借助于用本發(fā)明的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以在原位制備同效維生素。特別是含有基因bioF，bioH和bioC的轉(zhuǎn)化菌株可以用于從庚二酸中生產(chǎn)KAPA，然后，用攜帶互補(bǔ)基因D，A和B的菌株使KAPA轉(zhuǎn)化成生物素。
如果同時(shí)使用適合的菌株，那么也可以達(dá)到相繼的發(fā)酵過(guò)程或共發(fā)酵(Co-fermentation)。
同樣地，可以達(dá)到菌株的互補(bǔ)作用，即使這菌株只具有部分的相關(guān)基因，或者還可以轉(zhuǎn)化已經(jīng)生產(chǎn)生物素的菌株，以便能過(guò)多地生產(chǎn)。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將參照如下附圖，并通過(guò)下文要敘述的實(shí)例加以說(shuō)明圖1表示生物素的生物合成鏈，圖2用圖解表示質(zhì)粒PTG1400，圖3用圖解表示質(zhì)粒PTG47.5，圖4表示沒有在其上游密碼的順序LORFn°1，圖5表示順序LORFn°1是基因bioD，
圖6表示順序LORFn°2是基因bioA，圖7表示順序LORFn°3是基因Y，圖8表示順序LORFn°4是基因bioB，圖9用圖解表示對(duì)PTG1400互補(bǔ)作用的探討，圖10用圖解表示不同種質(zhì)粒中間的互補(bǔ)作用的探討，圖11用圖解表示質(zhì)粒PTG1418的結(jié)構(gòu)，圖12用圖解表示PTG1418的互補(bǔ)作用的試驗(yàn)，圖13表示在下列質(zhì)粒中所用的球桿菌的插入的限制作用的圖示，圖14用圖解表示質(zhì)粒PTG1418和PTG1420，圖15用圖解表示質(zhì)粒PTG1422和PTG1435，圖16用圖解表示質(zhì)粒PTG1436和PTG1437，圖17表示順序LORFX，圖18表示順序LORFW，圖19表示順序LORFF，圖20圖解表示質(zhì)粒PTG1440，圖21表示質(zhì)粒PTG1418的插入限制作用的圖示，圖22和圖23表示從用于互補(bǔ)作用試驗(yàn)中的PTG1418所衍生的各種質(zhì)粒。
為了簡(jiǎn)化之，有關(guān)的DNA順序和質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都用附圖表示。盡管如此，它們?nèi)詰?yīng)考慮是本發(fā)明說(shuō)明書的組成部分。
例1球桿菌IFO3525的基因bioA和bioD的互補(bǔ)作用所形成的克隆以及其與bioB的關(guān)系。
a).在大腸桿菌中(E.Coli)
在37℃下用200ml的培養(yǎng)基PAB(抗菌素的DIFCOBacto，介質(zhì)3，17.5g/l)培養(yǎng)球桿菌IFO352517個(gè)小時(shí)，用離心分離回收細(xì)菌，然后用Saito方法(Saito等人BBA1963年，72，619-629)從該細(xì)胞中提取總DNA，制得450μg的純DNA。
把20μg的總DNA用HindⅢ完全限制(3U/μgDNA)，被HindⅢ完全消化以后，用堿性磷酸酶處理PBR322。
在50μl含有30mM Nacl，30mM PH7.5的Tris Hcl，10mM Mgcl2，0.2mM PH8的EDTA，2mM DTT，0.5mM PH7的ATP和0.1mg/ml的反應(yīng)緩沖裝置中使被HindⅢ消化的基因組的DNA(2μg)和用2個(gè)單位的連接酶T4(Boehringer Mannheim)所處理的PBR322(1μg)相混合以制取雜交的重組質(zhì)粒，在14℃下保溫16個(gè)小時(shí)，把連接作用的混合組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(Cohen等人，(1972年)PNAS69，2110-2114)。其中使用了E.Coli菌株C600 r-km+k，并且選擇在介質(zhì)LB中抗氨比西林的(ampicilline)(100μg/ml)菌株。
取抽4個(gè)不同的質(zhì)粒DNA的“樣品”(“Pools”)，每一樣品在轉(zhuǎn)化容器中平均各是104個(gè)克隆。
用這些DNA樣品轉(zhuǎn)化E.Coli的不同的生物變種，這些轉(zhuǎn)化或是根據(jù)在介質(zhì)LB中存在氨比西林的情況下(100μg/ml)，或是在該抗菌素和同時(shí)存在生物素的原始營(yíng)養(yǎng)(Prototrophie)的情況下(介質(zhì)LB+氨比西林100μg/ml+抗生物素蛋白(avidine)0.2U/ml)選擇的。
所測(cè)結(jié)果列于表1中表1E.Coli選擇氨比西林選擇在氨比西林介質(zhì)+基因型轉(zhuǎn)化株/μgDNA抗生蛋白0.2U/ml轉(zhuǎn)化株/μgDNAC268＊ΔbioA，his ＞1033(樣品n°4)(每一樣品)1(樣品n°1)C173＊ΔbioD，his ＞1032(樣品n°4)(每一樣品)＊Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol 112，830。
從選擇氨比西林和抗生蛋白的克隆中分離出質(zhì)粒，并用限制作用的酶分析之。3個(gè)質(zhì)粒(兩個(gè)來(lái)自C268菌株，另一個(gè)來(lái)自C173菌株)都包含4.3Kb的HindⅢ插入體，它有一個(gè)BgⅢ部位和2個(gè)SphⅠ部位，而沒有BamHI，SalⅠ，PstⅠ，EcoRV，PVUⅡ，AVaⅠ部位(Site)。
在這些質(zhì)粒中之一的稱作為PTG1400的質(zhì)粒已在圖2中表示其限制作用的圖示。在抗氨比西林和生物素的原始營(yíng)養(yǎng)的情況下選擇，無(wú)論是C268(ΔbioA)，C173(ΔbioD)，R877(bioD19)菌株(Cleary和Campbell，1972年)或C162(bioB)菌株都能與只用氨比西林的情況下選擇的菌株以平均頻率進(jìn)行重轉(zhuǎn)化(每μg DNA超過(guò)103)。
用PTG1400不可能取得任何一個(gè)菌株R878(bioC23)或R901(ΔbioA-D)(Cleary和Campbell，1972年)的生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷體(auxotrophie)的互補(bǔ)作用。
b)在枯草桿菌中枯草桿菌的生物突變體的互補(bǔ)作用是很難發(fā)生的。因?yàn)楸娝苤?，即在枯草桿菌所慣用的復(fù)制質(zhì)粒中克隆的外來(lái)插入過(guò)程中能發(fā)生頻率很大的缺失。這就是為什么要研制出采用沒有復(fù)制的質(zhì)粒進(jìn)行互補(bǔ)作用試驗(yàn)的根本原因。
如果在基因組DNA和質(zhì)粒之間存在同源的區(qū)域，那么采用枯草桿菌的天然反應(yīng)潛能細(xì)胞就能以足夠高的頻率(大約104轉(zhuǎn)化株/μg DNA)在枯草桿菌的基因組DNA中出現(xiàn)非復(fù)制質(zhì)粒的整合。
第一步包括質(zhì)粒PTG475，其結(jié)構(gòu)已如圖3中所示，在枯草桿菌的各種生物突變體中的整合。
質(zhì)粒PTG475包含為C2.3氧化酶密碼的基因XylE(Zukowski等人(1983年)PNASUSA，80，1101-1105)，它能用作色原的標(biāo)志物(黃色)，它在枯草桿菌的左聚(糖)蔗糖酶的基因的誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下被表達(dá)。該質(zhì)粒同樣包含用于抗氯霉素的基因CAT;基因CAT和XylE是插入到PBR322。
這質(zhì)粒是整合到枯草桿菌的下列菌株的染色體中·bioA菌株JKB3173(bioA173，aroG932;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，·bioB菌株BGSCIA92(bioB141，aroG932SacA32，ArgA2;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，
·bio112菌株JKB3112(bio112;CHPai(1975年)J.Bacteriol.121，1-8)，上述整合是通過(guò)反應(yīng)潛能細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)實(shí)施的(R.J.Boyland(1972年)，J.Bacteriol.110，281-290)，選用TBAB(DIFCOBlood色氨糖(tryptose)瓊脂基質(zhì))和氯霉素3μg/ml。
在轉(zhuǎn)化克隆中實(shí)施各種的控制當(dāng)用蔗糖誘導(dǎo)時(shí)它們就變黃色，而且對(duì)菌株bioA，bioB和bio112進(jìn)行Southern的雜交控制時(shí)能顯示出在左聚蔗糖酶的基因啟動(dòng)子中的簡(jiǎn)單重組作用能使PTG475發(fā)生整合作用。這些枯草桿菌的轉(zhuǎn)化菌株叫作bioATG1，bioBTG2和bio112TG3。質(zhì)粒PTG475攜帶了在枯草桿菌的基因組中的順序PBR322，它由此能夠通過(guò)同源重組作用整合所有的包含相同順序的外來(lái)質(zhì)粒。
第二步驟，在E.Coli中通過(guò)互補(bǔ)作用予先克隆過(guò)的質(zhì)粒PTG1400被用作轉(zhuǎn)化枯草桿菌的菌株bioATG1，bioBTG2和bio112TG3。選用了介質(zhì)LB+抗生物素蛋白0.2U/ml+氯霉素10μg/ml的條件。
在這里能夠發(fā)現(xiàn)，有可能通過(guò)菌株bioATG1和bioBTG2，而不是通過(guò)菌株bio112TG3選擇到極高頻率的生物素的原始營(yíng)養(yǎng)體轉(zhuǎn)化株，而PTG1400卻不能互補(bǔ)bio112突變。
C).PTG1400的HindⅢ插入的最終特征為了檢測(cè)在球桿菌IFO3525的基因組DNA中的相同HindⅢ片段，進(jìn)行了Southern的雜交試驗(yàn)，即PTG1400的插入。
在極端的雜交條件下(50%的甲酰胺，0.6%的Denhardt溶液，0.1%SDS，3×SSC，42℃)，使用通過(guò)在活體外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而標(biāo)記為32P的質(zhì)粒PTG1400(“切口轉(zhuǎn)譯”“nick translation”)(2.5×107Cpm/μgDNA)，經(jīng)過(guò)在-80℃下的6個(gè)小時(shí)放射自顯影，能產(chǎn)生在球桿菌IFO3525的基因組DNA中的4.3Kb的HindⅢ單帶(Seule bande)。人們可以證實(shí)，在這種雜交條件下PBR322沒有與球桿菌IFO3525的基因組DNA進(jìn)行雜交反應(yīng)。在相同的條件下，不可能用作為探查物(Sonde)的PTG1400檢測(cè)出在被HindⅢ處理過(guò)的枯草桿菌BGSCIA289的基因組DNA中和用HindⅢ處理過(guò)的E.Coli C600的基因組DNA中的每一個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)。
用“Shotgun”方法分析了4.3Kb的HindⅢ片段的總DNA順序，也就是說(shuō)用聲處理所得的片段的系統(tǒng)克隆，與低核苷酸-先導(dǎo)物的延伸或“氣旋缺失”(“délétionsCyclones”)。
在“Shorgun”方法中，通過(guò)超聲波處理切斷質(zhì)粒PTG1400。用噬菌體T4的DNA的聚合酶處理DNA片段以后，這些具有自由端的片段移行到低熔點(diǎn)的瓊脂凝膠上，而那些大約300Pb的片段被分離出來(lái)。
在用SmaⅠ消化并且用磷酸酶處理的載體M13中實(shí)現(xiàn)了這些片段的克隆。
那些沒有與PBR322進(jìn)行交叉雜交的空白區(qū)域(Plages)被挑選出來(lái)，并且順序了100個(gè)克隆。用數(shù)字電子計(jì)算機(jī)分析其結(jié)果。
用于取得一組交選克隆(氣旋(Cyclone)體系)的新近方法已經(jīng)被用于DNA的順序(R、M、K.Dale，B、A、McClure，J.P.Houchins(1985)Plasmid13，31-40)。這種方法已經(jīng)與“Shorgun”方法進(jìn)行比較，以便證實(shí)所得的結(jié)果，而且這種方法生產(chǎn)包含有生物基因組或者孤立的生物基因的限定缺失的質(zhì)粒。
PTG1400的HindⅢ片段的完整順序已如圖4，5，6，7和8中所示。
通過(guò)用數(shù)字電子計(jì)算機(jī)分析這種順序顯示出這片段具有為四個(gè)長(zhǎng)范圍的讀碼(Lecture)密碼的能力(LORF)這些可能的轉(zhuǎn)譯的起始部位以及Shine和Dalgarno區(qū)域都在其下部劃著重線予以強(qiáng)調(diào)。在順序的3′末端處用下部著重線強(qiáng)調(diào)了回文區(qū)域(règionPalindromique)，它能顯示轉(zhuǎn)錄的終止部位。
詳細(xì)的互補(bǔ)作用的分析顯示出第一個(gè)區(qū)域LORF(圖5)(具有3個(gè)可能的轉(zhuǎn)譯起始部位)是基因bioD。
名叫“超長(zhǎng)細(xì)胞”(“maxicellules”)的已知試驗(yàn)已用E.Coli CSR603菌株加以實(shí)現(xiàn)(recAl，phr-1，UvrA6，thr-1，leu-6，thi-1，argE3，lacY1，galk2，ara14，xy115，mt11，ProA2，Str-31，tsx-33，SupE44，F(xiàn)-，Lambda-);這些試驗(yàn)顯示出這個(gè)區(qū)域?yàn)槠浞肿恿看蠹s是25Kd的多肽密碼。
第二個(gè)區(qū)域LORF(圖6)(具有3個(gè)可能的轉(zhuǎn)譯的起始部位)是基因bioA，E.ColiCSR603的“超長(zhǎng)細(xì)胞”試驗(yàn)顯示出其分子量大約是40Kd的多肽，這個(gè)多肽是基因bioA的產(chǎn)物。
目前尚不能確定第三個(gè)順序LORF基因Y(圖7)的作用。但是它的極大的疏水性和在密碼區(qū)域中存在有可能的順序符號(hào)顯示出這個(gè)LORF如果被轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯時(shí)，能夠?yàn)榕c膜相互作用的蛋白質(zhì)密碼。事實(shí)上，這基因Y是與其它的基因bioA，bioD和bioB組成“簇”(“Cluster”)。從而顯示出它能為包含在生物素的新陳代謝中的其它功能密碼。
第四個(gè)區(qū)域LORF(圖8)(具有三個(gè)可能的轉(zhuǎn)譯的起始部位)已經(jīng)被鑒定了，它涉及為基因bioB密碼的區(qū)域、在這里證實(shí)了這個(gè)基因是與基因bioA和bioD相連接成“簇”。
用含有PTG1400的4.3KbHindⅢ插入的亞-克隆(Sous-Clonées)區(qū)域的質(zhì)粒的互補(bǔ)作用的分析清楚地顯示出如同圖9中所示，第一區(qū)域LORF是基因D的產(chǎn)物;而第二區(qū)域LORF是基因A的產(chǎn)物。
例2用球桿菌IFO3525的基因bioF的互補(bǔ)作用進(jìn)行克隆用前述的方法采用前述的球桿菌IFO3525的HindⅢDNA基因組庫(kù)(banque)轉(zhuǎn)化E.Coli的突變體bioF12。
結(jié)果列于表2中
表2E.Coli菌株的選用氨必西林選用氨必西林介質(zhì)+抗生基因型轉(zhuǎn)化株/μgDNA物素蛋白0.2U/ml轉(zhuǎn)化株/μgDNAR874＊bioF12，his ＞1042(樣品n°1)(每個(gè)樣品)2(樣品n°3)4(樣品n°4)＊Cleary和Campbell(1972年)J.Bacteriol.112，830把質(zhì)粒從選用含有氨必西林和抗生物素蛋白的介質(zhì)的克隆中分離出來(lái)，并用限制酶進(jìn)行分析。
其中的兩個(gè)質(zhì)粒包含有大約4.5Kb和0.6Kb的HindⅢ插入，并分別具有SphⅠ，KpnⅠ，HpaⅠ，NdeⅠ，AvaⅠ，ClaⅠ，BgⅠ，XmnⅠ，PvuⅡ，ScaⅠ，StuⅠ部位，而不含有BgⅢ，XbaⅠ，SmaⅠ，PstⅠ，SalⅠ，NruⅠ，BamHⅠ，PvuⅠ，ECORⅠ，HindⅡ，ECoRV，F(xiàn)spⅠ，ApaⅠ，BalⅠ，AatⅡ部位。
其中的一個(gè)質(zhì)粒，PTG1418，在選用抗氨必西林和生物素的原始營(yíng)養(yǎng)時(shí)它可以重轉(zhuǎn)化E.Coli的874菌株(bioF12，his)，它的轉(zhuǎn)化時(shí)的平均頻率與選用氨必西林時(shí)的克隆選擇的頻率相仿(超過(guò)104/μg DNA)。
通過(guò)亞-克隆試驗(yàn)顯示出只有4.5Kb的HindⅢ片段才為KAPA合成酶功能密碼，以確保E.Coli的R874菌株的bioF12突變體的互補(bǔ)作用。
為了檢測(cè)在球桿菌IFO3525的DNA基因組中的4.5Kb HindⅢ片段，并與PTG1418的4.5Kb插入相比較，進(jìn)行了“Southern”試驗(yàn)。其中采用了極嚴(yán)厲的雜交條件(50%甲酰胺，3×SSC，0.1%SDS，0.6%的Denhart溶液，42℃)，并采用了2×106Cpm/μg DNA M13TG1425(含有通過(guò)活體外的聚合作用的放射性核苷酸的并入而被標(biāo)記為32P的4.5Kb HindⅢ插入的噬菌體M13)，經(jīng)過(guò)在-80℃的7個(gè)小時(shí)放射自顯影以后，在球桿菌IFO3525的DNA基因組中能顯示出大約4.5Kb的HindⅢ帶。
在同樣的條件下，無(wú)論在用HindⅢ處理過(guò)的枯草桿菌BGSCIA289的DNA基因組上，或在用HindⅢ處理過(guò)的E.ColiC600的DNA基因組中都沒有檢測(cè)到任何一個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)。
無(wú)論用交迭PTG1400的末端3′的PTG1406的8.3Kb的SphⅠ片段，或用交迭PTG1400的末端5′的PSBOI的8.2Kb的MboⅠ片段，都不能在PTG1400插入和PTG1418插入之間檢測(cè)出交叉反應(yīng)(見圖10)。
已經(jīng)分析出PTG1418插入的限制圖并顯示于圖11中。
通過(guò)“Southern”分析和對(duì)互補(bǔ)作用的研究，證實(shí)了球桿菌IFO3525的bioF基因并沒有與同一微生物的基因bioA，bioD和bioB相結(jié)合(見圖12)。
例3通過(guò)與PTG1418及其各種衍生物的整合轉(zhuǎn)化作用進(jìn)行枯草桿菌的突變體bio112TG3(由JKB3112，bioC/F-112aroG932衍生出來(lái))的互補(bǔ)作用。
枯草桿菌的突變體bio112已通過(guò)營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)加以鑒別，而且在bioF或bioC功能中受影響(C.H、Pai，1975年，J.Bacterial121，1-8)。在這個(gè)突變體中，質(zhì)粒PTG475已經(jīng)通過(guò)前述的方法被整合到SacR-SacB位點(diǎn)上，由此而獲得的新菌株被稱為bio112TG3。
用各種質(zhì)粒(如圖13-16所示的PTG1418，1420，1422，1435，1436和1437)實(shí)施對(duì)菌株bio112TG3的轉(zhuǎn)化作用。其中選用了LB介質(zhì)+氯霉素10μg/ml+抗生物素蛋白500U/l，互補(bǔ)作用的結(jié)果列于表3。其結(jié)果是如同用E.Coli的突變體R874(bioF，his)的交叉試驗(yàn)所得的結(jié)果枯草桿菌的bio112突變體很可能在基因bioF中受影響，通過(guò)對(duì)根據(jù)所用質(zhì)粒所取得的互補(bǔ)作用的分析，有可能把基因bioF以限定于限制部位XmnⅠ和NcoⅠ之間的片段確定置于PTG1418的插入上(見圖21-23)。
表3枯草桿菌的bio112TG3菌株的整合轉(zhuǎn)化作用在介質(zhì)LB+500U/L抗生物素質(zhì)粒插入蛋白+10μg/ml氯霉素的互補(bǔ)作用PTG14185.1Kb的HindⅢ插入++PTG1422含有bioF和部分LORFW的3.1Kb的ClaⅠ插入++TG1420含有X和部分LORFW的2KbClaⅠ-HindⅢ插入-
表3(續(xù))PTG1436含有基因bioF的1.3Kb的XmnⅠ-NcoⅠ的插入++PTG1437含有基因bioF的1.3Kb的NcoⅠ-XmnⅠ插入++PTG1435含有LORFx的0.6Kb的HpaⅠ-PVUⅡ插入-例4質(zhì)粒PTG1418的4.53Kb的HindⅢ插入的核苷酸順序在多連鎖子(Polylinker)的部位上把HindⅢ插入克隆到M13TG131中。把所謂的“氣旋”(“Cyclone”)方法實(shí)施于質(zhì)粒M13TG1425上，并用數(shù)字電子計(jì)算機(jī)分析其結(jié)果。憑借特種的低核苷酸可以把在順序中的兩股互補(bǔ)的小片段之間的讀碼(lecture)的某些區(qū)別加以澄清。
圖17-19已詳細(xì)圖解這順序。顯然，這種插入包含讀碼的三個(gè)開口的范圍(Cadre)，分別為其分子量是18462，28048和42940道爾頓(daltons)的蛋白質(zhì)(亞單位基)密碼。從讀碼的含義上來(lái)說(shuō)，最后一個(gè)基因是置于被鑒別為bioF的區(qū)域中。其中的枯草桿菌的這種蛋白質(zhì)的分子量是和E.Coli的合成酶KAPA的分子量處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)上(M.A.Eisenberg1973年，adv.Enzymol.38，317-372)。
讀碼的三個(gè)開口范圍的并置，如同在質(zhì)粒PTG1400的插入情況一樣，可以具有操縱子的結(jié)構(gòu)。這里需要指出，人們可以鑒別出在第一個(gè)基因的上游，有一個(gè)15個(gè)堿基對(duì)的順序(在圖17中用下部著重線表示之)同樣出現(xiàn)在質(zhì)粒PTG1400的插入的第一個(gè)基因(bioD)的上游。這種鮮明特征可以顯示出球桿菌的這兩組生物素基因至少是接受共同的調(diào)節(jié)。這個(gè)可以是生物素(或是其衍生物)的控制，如同已述的球桿菌的KAPA合成酶(bioF)的情況一樣(y.yzumi，K.Sato，y.Tani和K.Ogata，1973年，Agric.Biolchem37，1335)。
從順序插入的最后一個(gè)基因的3′側(cè)，可以鑒別出一個(gè)顯示轉(zhuǎn)錄終止子(terminateur)特征的順序(在圖18中用下部著重線表示之)。
例5分別借助于質(zhì)粒PTG1418(1433)和PTG1440的E.Coli突變體R878(bioC，his)和C261(ΔbioFCD，his)的互補(bǔ)作用用質(zhì)粒PTG1418及其各種衍生物實(shí)施E.Coli的生物突變體的互補(bǔ)作用的慣用方法。
用質(zhì)粒PTG1418和PTG1433(見表4)使E.Coli突變體R878(bioc，his)的有能力的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并接著在介質(zhì)LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l上攤開之，經(jīng)過(guò)36個(gè)小時(shí)在37℃溫度下的培養(yǎng)，就能檢測(cè)出生長(zhǎng)情況。在這種介質(zhì)中的轉(zhuǎn)化克隆的出現(xiàn)頻率與在介質(zhì)LB+氨必西林100μg/ml上所測(cè)得的出現(xiàn)頻率是處于同一個(gè)數(shù)量線上。
表4E.Coli突變體R878bio的轉(zhuǎn)化作用.
每μgDNA的轉(zhuǎn)化株數(shù)量質(zhì)粒選用介質(zhì)LB+氨必西選用介質(zhì)LB+氨比西林100μg林(100μg/ml)/ml+抗生物素蛋白(200U/l)PTG1418 103103PetitsPTG1433 103103PetitsPBR322 1030(在36個(gè)小時(shí)在37℃下培養(yǎng)后)在介質(zhì)LC+氨必西林中的正常轉(zhuǎn)化克隆的生長(zhǎng)在沒有生物素的情況下會(huì)減弱(介質(zhì)LB+氨必西林+抗生物素蛋白;最少量的酪蛋白氨基酸，沒有生物素)。當(dāng)它在沒有生物素的介質(zhì)中被各種由PBR322衍生的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化時(shí)，由于完全不存在這同一種突變體的生長(zhǎng)，因此，這種突變體R878bioC的生物素的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)作用是非常意味深長(zhǎng)的。
把質(zhì)粒PTG1400和PTG1418的插入克隆到PBR322中，以便得到質(zhì)粒PTG1440(圖20)。當(dāng)把這種質(zhì)粒PTG1440引入到E.Coli突變體C261(ΔbioFCD，his)時(shí)，就可以選用在介質(zhì)LB+氨必西林100μg/ml+抗生物素蛋白200U/l中的克隆。所得的這種轉(zhuǎn)化頻率與在介質(zhì)LB+氨必西林中所得的頻率完全地相類似。此外，在介質(zhì)LB+氨必西林中的正常轉(zhuǎn)化克隆的生長(zhǎng)在沒有生物素的情況下會(huì)減弱的。根據(jù)這兩種結(jié)果(突變體bioC和bioΔFCD的生物素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)作用)，就能得出清楚的結(jié)論質(zhì)粒PTG1418的插入同樣包含有球桿菌的基因bioC。而這些各種由PTG1418的插入衍生的亞-克隆(圖21-23)并不能得到E.Coli的突變體bioC的互補(bǔ)作用。只有含有這三個(gè)基因的插入(inserts)才能給與E.Coli的突變體bioC的有效互補(bǔ)作用。
例6E.Coli突變體bioH(PA505MAΔ108，argH，metA，bioH，malA，Strr)的互補(bǔ)作用。
這種突變體起初是描寫成bioB(D.Hatfield，M.Hofnung和M.Schwartz，1969年，J.Bactoriol.98？559-567)。后來(lái)又顯示出不排出任何同效維生素的特征，而且能夠在含有KAPA，DAPA，DTB或者生物素的礦物介質(zhì)中生長(zhǎng)。后來(lái)Eisenberg(1985年，AnnalsNewyorkAcademyofScience447，335-349)建議這種基因?yàn)楦?COA-合成酶的亞單位(Sous-unité)(bioH)密碼。要注意到能過(guò)多地生產(chǎn)生物素的E.Coli的突變體(或者用能生長(zhǎng)E.Coli的營(yíng)養(yǎng)缺陷型bioB的維生素的排泄水平而選擇的，或者用抗α-脫氫生物素而選擇的)已經(jīng)全部進(jìn)行基因鑒別，而且在bioR位點(diǎn)上受影響。這位點(diǎn)為多功能的蛋白質(zhì)密碼(操縱子bioABFCD的信息核糖核酸(RNA)的合成阻遏物(répresseur)和能把生物素固定在具有羧基酶功能的各種脫輔基酶蛋白的細(xì)胞溶素殘基上的合成酶的全酶)。
所有的至今被鑒別的能過(guò)多生產(chǎn)生物素的E.Coli的突變體被放置于為反式活性阻遏物密碼的基因中，而不是被放置于操縱子bioABFCD的操縱基因中，假設(shè)生物素的生物合成的另一個(gè)基因在這個(gè)調(diào)節(jié)下。根據(jù)文準(zhǔn)竊?，基因bioH是較好的上述基因。
PTG1418的插入包含球桿菌的基因bioF和bioC，人們已研究出第三個(gè)基因是bioH。
采用質(zhì)粒PTG1433能有效地取得E.Coli的突變體bioH的互補(bǔ)作用。另外，在這介質(zhì)中所得到的生長(zhǎng)是緩慢的，然而與對(duì)照相比較是非常的有意義的(見表5)。
表5E.Coli突變體bioHPA505MAΔ108的轉(zhuǎn)化作用每μgDNA的轉(zhuǎn)化株數(shù)目質(zhì)粒選用介質(zhì)LB+(100μg選用介質(zhì)LB+(100μg/ml)/ml)氨必西林氨必西林+(200U/l)抗生物素蛋白PBR322 1040PTG1433 103103Petits(在37℃下培養(yǎng)36個(gè)小時(shí)以后)如同突變體bioC的互補(bǔ)作用一樣，突變體biOH的互補(bǔ)作用所需要的足夠條件，是在引入到菌中的質(zhì)粒上同時(shí)存在三個(gè)PTG1418插入的基因(圖21-23)。
與能夠被球桿菌的單獨(dú)基因所互補(bǔ)的枯草桿菌和E.Coli的突變體bioF相反，在沒有生物素的情況下，當(dāng)引入PTG1418的HindⅢ插入的三個(gè)基因的運(yùn)載的重組質(zhì)粒的時(shí)候，才能得到E.Coli的突變體bioC和bioH。由此能夠反映出，其中在球桿菌的庚二酰-COA-合成酶和E.Coli的相對(duì)應(yīng)的酶之間的酶性質(zhì)上的區(qū)別(對(duì)于底物的親和關(guān)系的區(qū)別，特別是多酶結(jié)構(gòu))，或者在E.Coli中球桿菌的庚二酰-COA-合成酶的還原合成(Synthéseréduite)，它限制了向KAPA的庚二酸鹽的代謝通量。
例7bioFCH基因的功能試驗(yàn)借助于從來(lái)源于球桿菌的被分離的4.5KbHindⅢ片段衍生出來(lái)的插入的運(yùn)載重組質(zhì)粒，通過(guò)試驗(yàn)?zāi)軌蜃C明在bioF，bioH和bioC的DNA上存在有E.Coli的突變體bioF，bioH和bioC的互補(bǔ)作用。
然而，有必要通過(guò)從球桿菌的這些克隆基因的產(chǎn)物的活性試驗(yàn)使信息趨于完整化。E.Coli的bioF基因已經(jīng)顯出對(duì)由庚二酰-COA向KAPA轉(zhuǎn)化作用的催化特征(Eisenberg，1968年)。目前，兩個(gè)基因bioC和bioH的產(chǎn)物尚未能清楚地鑒別出來(lái)，在一個(gè)文獻(xiàn)中(Eisenberg，1985年)有人假設(shè)，它們是為包含在庚二酰-COA的生物合成中的蛋白質(zhì)編碼的。人們已經(jīng)作試驗(yàn)以確證順序bioF，C，H是否有效地保證從庚二酸鹽向KAPA的轉(zhuǎn)化作用。
球桿菌的FCH密碼部分的運(yùn)載插入(以連接到PTG1436的SphⅠ-SphⅠ片段的PTG1434的ECORV-SphⅠ片段的相組合的形式加于回收)已經(jīng)融合到抗四環(huán)素的PBR322基因啟動(dòng)子中以產(chǎn)生質(zhì)粒PTG1446，以便能獲得與基因bioF，C，H有關(guān)的蛋白質(zhì)有意義的表達(dá)。
接著把這個(gè)質(zhì)粒引入到與E.Coli的bioH菌株匹配的細(xì)胞中。接著把這個(gè)重組菌株在加有100μg/ml氨必西林和0.5mg/ml的PH7.5的庚二酸鹽的GP培養(yǎng)基中(每一升中20g甘油，30g
蛋白胨，5g不含維生素的酪蛋白氨基酸，1gK2HPO4，0.5gKcl，0.5gMgSO4-5H2O，0.01gFeSO4-7H2O，0.001g PH6.8-7的MnSO4-4H2O，20μg鹽酸硫胺素)在37℃下，培養(yǎng)48個(gè)小時(shí)。
接著把5μl的殘存試樣在硅石板上進(jìn)行色層分離(色譜溶劑是正丁醇(60)，醋酸(15)，水(25)，容積/容積，溶劑的遷移10cm)以便分離同效維生素和生物素這兩個(gè)產(chǎn)物。
在對(duì)每個(gè)同效維生素進(jìn)行遷移以后，采用其保存號(hào)為ATCC7754的麥酒酵母屬的菌株，估算出KAPA的生物劑量數(shù)。
在這些跫攏嗣悄芄徊饉慍鱸諉縨l的殘存培養(yǎng)物中KAPA的繁殖量是85μg(用生物素當(dāng)量表示之)。
在同樣條件下，進(jìn)行含有質(zhì)粒PBR322的同樣菌株的培養(yǎng)的對(duì)照試驗(yàn)。在這種情況下，沒有任何一個(gè)突出的KAPA能被檢測(cè)出來(lái)。
然而，在這里顯示出PTG1418的插入是為在由庚二酸鹽轉(zhuǎn)化為KAPA中的足夠的和必需的一些酶功能編碼的，即基因bioC，H和F的產(chǎn)物。
本發(fā)明的代表菌株的儲(chǔ)藏E.ColiC600PTG1400和R874PTG1418的菌株，于1986年9月26日，以寄存號(hào)為n°1-608和1-609儲(chǔ)藏在巴斯德(Pasteur)研究院的國(guó)家微生物培養(yǎng)保藏中心，其地址是法國(guó)，巴黎，28rueduDocteur-Roux-75724ParisCédex15。
權(quán)利要求
1.為在細(xì)菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產(chǎn)的酶編碼的DNA順序，bioA基因；bioD基因；bioF基因；bioC基因；bioH基因。
2.據(jù)權(quán)利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioB和bioD所生產(chǎn)的酶編碼。
3.據(jù)權(quán)利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioD，bioA和bioB所生產(chǎn)的酶編碼。
4.據(jù)權(quán)利要求1的DNA順序，其特征是它為基因bioD，bioA，bioB和bioF所生產(chǎn)的酶編碼。
5.為在細(xì)菌中的生物素的生物合成鏈的由下列基因中之一所生產(chǎn)的酶編碼的DNA順序，·bioF和bioC，·bioF和bioH，·bioF bioC和bioH。
6.據(jù)權(quán)利要求5的DNA順序，其特征是它還至少為下列基因中之一所生產(chǎn)的酶編碼，·bioA;bioA和bioD。
7.據(jù)權(quán)利要求5或6中之一的DNA順序，其特征是它為由基因bioD，bioA和bioB所生產(chǎn)的酶編碼。
8.據(jù)權(quán)利要求1至7中之一的DNA順序，其特征是它沒有天然的順序，而該順序是確保在原始細(xì)菌中生物素的生物合成方法中的酶的轉(zhuǎn)錄控制。
9.DNA順序，它是在圖4至8和圖17至19中所述的整個(gè)或部分順序。
10.據(jù)權(quán)利要求1至9中之一的DNA順序，其特征是它來(lái)源于桿菌菌株(Souche)。
11.據(jù)權(quán)利要求10的DNA順序，其特征是它來(lái)源于球桿菌菌株。
12.至少包含一個(gè)據(jù)權(quán)利要求1至11的順序的質(zhì)粒載體。
13.據(jù)權(quán)利要求12的載體，其特征它是包含能整合到宿主菌株的染色體中的DNA順序。
14.據(jù)權(quán)利要求13的載體涮卣魎遼侔桓齟嬖謨諞木甑幕蜃櫓械模⒛芙姓獻(xiàn)饔玫乃承虻耐此承頡
15.據(jù)權(quán)利要求14的載體，其特征該同源順序是天然的基因組的順序。
16.據(jù)權(quán)利要求14的載體，其特征該同源順序是一個(gè)依靠整合的質(zhì)粒載體而已被整合到基因組中的順序。
17.據(jù)權(quán)利要求16的載體，其特征是該特定的質(zhì)粒載體至少包含一個(gè)防抗生素的基因和一個(gè)從屬于欲轉(zhuǎn)化的菌株的啟動(dòng)子的基因標(biāo)志物。
18.據(jù)權(quán)利要求17的載體，其特征是該啟動(dòng)子是誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
19.據(jù)權(quán)利要求18的載體，其特征是該整合的質(zhì)粒載體是質(zhì)粒PTG475。
20.據(jù)權(quán)利要求12的載體，其特征是它包含自主復(fù)制的起源(Origine)。
21.據(jù)權(quán)利要求20的載體，其特征是它是一個(gè)桿菌菌株，或是大腸埃希氏菌菌株的自主復(fù)制起源。
22.據(jù)權(quán)利要求20或21中之一的載體，其特征是為生物素的生物合成鏈的酶密碼的DNA順序是伴陪有能在宿主菌株中表達(dá)的成分(element)。
23.據(jù)權(quán)利要求22的載體，其特征是在這些能表達(dá)的成分中包括了在宿主菌株中有效的啟動(dòng)子和終止密碼子。
24.被據(jù)權(quán)利要求12至23中之一的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
25.據(jù)權(quán)利要求24的細(xì)胞，其特征它是選自桿菌屬，埃希氏菌屬或假單胞菌屬的細(xì)菌。
26.據(jù)權(quán)利要求24的細(xì)胞，其特征它是酵母菌屬的酵母。
27.據(jù)權(quán)利要求25的細(xì)胞，其特征它是選自球桿菌，枯草桿菌和大腸埃希氏桿菌。
28.據(jù)權(quán)利要求24至27中之一的細(xì)胞，其特征該轉(zhuǎn)化細(xì)胞是生產(chǎn)生物素或其同效維生素的細(xì)胞。
29.制備生物素的方法，其特征把至少含有庚二酸或該生物素的同效維生素的培養(yǎng)基用據(jù)權(quán)利要求24至28中之一的，并能接受庚二酸或所說(shuō)的同效維生素影響的細(xì)胞進(jìn)行發(fā)酵，并由此回收所生成的生物素。
30.據(jù)權(quán)利要求29的方法，其特征該生物素的同效維生素是通過(guò)用生產(chǎn)該同效維生素的據(jù)權(quán)利要求24至28中之一的細(xì)胞對(duì)至少含有庚二酸的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵而制得的。
31.據(jù)權(quán)利要求30的方法，其特征是實(shí)施據(jù)權(quán)利要求24至28中之一的兩個(gè)細(xì)胞菌株的共發(fā)酵(co-fermentation)，其中之一是用于從庚二酸出發(fā)生產(chǎn)生物素的同效維生素，另一個(gè)是用于發(fā)酵該同效維生素以制備生物素。
全文摘要
本發(fā)明涉及DNA(脫氧核糖核酸)順序，它是下列的在細(xì)菌中的生物素的生物合成鏈的基因之一bioA，bioD，bioF，bioC和bioH基因。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1031111SQ8710780
公開日1989年2月15日 申請(qǐng)日期1987年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1986年9月30日
發(fā)明者里米·格洛克霍爾姆, 迪尼斯·斯彼克, 維斯·利莫恩 申請(qǐng)人:特朗斯吉恩有限公司