表現(xiàn)出外位點(diǎn)介導(dǎo)的超級(jí)活性的FVIIa-sTF復(fù)合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了二硫鍵連接的包含突變G109C的SEQIDNO:3的可溶性組織因子(sTF)變體和包含突變Q64C和位置M306的引起因子VIIa多肽中的酶原樣構(gòu)象的突變的SEQIDNO:1的FVIIa變體的復(fù)合物。所述復(fù)合物可以用于治療凝血病。
【專(zhuān)利說(shuō)明】表現(xiàn)出外位點(diǎn)介導(dǎo)的超級(jí)活性的FVIla-sTF復(fù)合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及凝血因子Vila多膚和組織因子多膚的促凝復(fù)合物。
[0002] 通過(guò)引用并入序列表 序列表為10. 878字節(jié)，在2012年3月22日創(chuàng)建并通過(guò)引用并入本文。
[000引背景 在具有凝血病的主體中，諸如在具有血友病的個(gè)體中，凝血級(jí)聯(lián)的各個(gè)步驟由于例如 凝血因子的不存在或不足的存在而致使功能障礙。凝血級(jí)聯(lián)的一部分的此類(lèi)功能障礙導(dǎo) 致不足的血液凝固和可能的威脅生命的出血，或?qū)τ趦?nèi)部器官諸如關(guān)節(jié)的損害。具有A和 B型血友病的個(gè)體可W接受凝血因子替代治療諸如分別接受外源因子VIII(FVIII)或因子 IX(FI幻。具有A和B型血友病的個(gè)體可能發(fā)展分別針對(duì)FVIII或FIX的抑制劑（抗體）， 在該種情況下，使用旁路劑化ypassingagents)諸如外源因子Vila(FVIIa)進(jìn)行治療可能 有必要。
[0004] 因子VII(FVII)是主要在肝臟中產(chǎn)生的糖蛋白。成熟蛋白由406個(gè)氨基酸殘基組 成，并且由如通過(guò)同源性限定的四個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。存在N末端Gla結(jié)構(gòu)域，隨后為兩個(gè)表皮 生長(zhǎng)因子（巧GF)-樣）結(jié)構(gòu)域和C末端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。FVII在血漿中作為單鏈分 子循環(huán)。在活化為活化的FVII(FVIIa)后，分子在殘基Argl52和Ilel53之間切割，導(dǎo)致通 過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起的二鏈蛋白。輕鏈含有Gla和EGF樣結(jié)構(gòu)域，而重鏈?zhǔn)堑鞍酌附Y(jié)構(gòu)域。 FVIIa要求與其輔因子組織因子（T巧結(jié)合，W獲得完整的生物學(xué)活性。
[0005]TF是位于血管外膜細(xì)胞上的263個(gè)氨基酸的完整膜糖蛋白受體。其由折疊成兩個(gè) 各被單一二硫鍵穩(wěn)定化的緊湊III型纖連蛋白-樣結(jié)構(gòu)域（1-219)的細(xì)胞外部分、一個(gè)跨 膜區(qū)段（220-242)和一個(gè)短細(xì)胞質(zhì)尾（243-263)組成。它通過(guò)與FVII形成在血管損傷后 可從循環(huán)中被捕獲的緊密Ca2+依賴(lài)復(fù)合物而充當(dāng)凝血的關(guān)鍵引發(fā)劑。TF通過(guò)充當(dāng)分子支 架、通過(guò)為其生理學(xué)底物提供需要的外位點(diǎn)（exosite)相互作用和通過(guò)誘導(dǎo)導(dǎo)致蛋白酶的 活性位點(diǎn)區(qū)域的成熟的FVIIa的蛋白酶結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化而大大增加FVIIa對(duì)其生理學(xué) 底物因子IX和因子X(jué)的蛋白水解活性。由直接蛋白-蛋白相互作用引起的TF對(duì)FVIIa的 活化可在體外通過(guò)用TF的可溶性外結(jié)構(gòu)域諸如sTF(l-219)飽和FVIIa而進(jìn)行模擬。
[0006]EP2007417B1公開(kāi)了包含F(xiàn)VIIa多膚和可溶性TF多膚的復(fù)合物。已經(jīng)顯示該些復(fù) 合物在磯脂膜上表現(xiàn)出非常高的蛋白水解活性，但該種有利特征伴隨著在溶液中的高蛋白 水解活性和對(duì)小膚底物的高醜胺水解活性，W及循環(huán)血漿抑制劑諸如抗凝血酶III(ATIII) 的快速抑制。在體內(nèi)環(huán)境中，此類(lèi)復(fù)合物可被迅速失活，導(dǎo)致短藥代動(dòng)力學(xué)曲線。
[0007] 因此，存在對(duì)于W下包含F(xiàn)VIIa多膚和可溶性TF多膚的復(fù)合物的需要，所述復(fù)合 物在膜表面上表現(xiàn)出高蛋白水解活性W及在溶液中降低的醜胺分解活性和降低的蛋白水 解活性的期望特性。此類(lèi)復(fù)合物是，優(yōu)選地，最小免疫原性的。
[0008] 概述 本發(fā)明涉及二硫鍵連接的（i)包含用切S取代氨基酸殘基Gln64和用另一個(gè)天然存在 的氨基酸殘基取代氨基酸殘基Me口06的SEQIDNO: 1的FVIIa變體和（ii)包含用切S取 代氨基酸殘基Glyl09的SEQIDN0:3的可溶性組織因子（sT巧變體的復(fù)合物。FVIIa變體 多膚可W進(jìn)一步包含氨基酸殘基Asp309的取代。本發(fā)明還涉及包含二硫鍵連接的復(fù)合物 的核酸分子和表達(dá)二硫化物復(fù)合物的細(xì)胞。
[0009] -種制備本發(fā)明的二硫鍵連接的復(fù)合物的方法，包括；（i)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn) 生包含用切S取代氨基酸殘基Gln64和用另一個(gè)天然存在的氨基酸殘基取代氨基酸殘基 Me口06的SEQIDNO: 1的因子Vila變體；（ii)在原核或真核細(xì)胞中產(chǎn)生包含用切S取代 氨基酸殘基Glyl09的SEQIDN0:3的可溶性組織因子變體；（iii)用其中官能團(tuán)之一是半 脫氨酸反應(yīng)性的異雙官能試劑標(biāo)記切S;和（iv)借助所述異雙官能試劑的第二個(gè)官能團(tuán) 將所述可溶性組織因子變體交聯(lián)至因子Vila變體。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的二硫鍵連接的復(fù)合物可W用作藥物，特別是用于治療凝血障礙。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述 圖1 ;FVIIa(Q64C) (M30抓)-sTF佑109C)復(fù)合物中蛋白酶結(jié)構(gòu)域的酶原樣構(gòu)象的證據(jù)。 (參）150nMwt-FVIIa() 10nMwt-FVIIa+ 100nMsTF(▲) 152nMFVIIa(Q64C) (M30抓)-sTF佑109C)的氨甲醜化。將所述種類(lèi)與0. 2MKOCN賠育，并在所示時(shí)間點(diǎn)測(cè)定殘 余活性。發(fā)現(xiàn)FVIIa(Q64C)(M30抓)-sTF佑109C)復(fù)合物具有與游離的FVIIa的氨甲醜化概 況相同的氨甲醜化概況。
[0012] 圖2;在10:90PS:PC囊泡不存在和存在的情況下針對(duì)S-2288生色底物的醜胺水 解活性和針對(duì)巧的蛋白水解酶活性。活性被提供為在相同條件下關(guān)于游離的wt-FVIIa的 相對(duì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)醜胺分解活性增加1.8倍，而發(fā)現(xiàn)在囊泡不存在的情況下蛋白水解活性增加 9倍。在磯脂囊泡存在的情況下，活性增加的^3000倍。
[001引 圖3 ;與FVIIa治療的FVIIIK0小鼠和wt小鼠相比，F(xiàn)VIII敲除化0)小 鼠中復(fù)合物的體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果。星號(hào)標(biāo)記沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的樣品。對(duì)于FVIIa Q64C-STF(1-219)G109C復(fù)合物（Q64C)，看到適度的促凝效果，而對(duì)于兩種劑量的FVIIa Q64CM30抓-sTF(l-219)G109C，看到正?；羨t水平。
[0014] 序列簡(jiǎn)述 SEQIDNO: 1提供了天然（野生型）人因子VII的氨基酸序列（1-406)。H字母標(biāo)記 "GLA"指4-駿基谷氨酸（y-駿基谷氨酸）。
[00巧]SEQIDN0:2提供了天然（野生型）人因子VII的核巧酸序列，包括信號(hào)膚（力口 下劃線）。
[001引SEQIDN0:3提供了天然（野生型）人可溶性組織因子（1-219)的氨基酸序列。
[0017]SEQIDN0:4提供了天然（野生型）人可溶性組織因子（1-219)的核巧酸序列，包 括信號(hào)膚（加下劃線）。
[0018]SEQIDNO;5至12提供了用于構(gòu)建質(zhì)粒的DM寡核巧酸的核巧酸序列，如表1中 、1以/JN〇
[0019] 詳述 本發(fā)明涉及二硫鍵連接的因子VII(a)(FVII(a))多膚和組織因子（T巧多膚的復(fù)合 物。通過(guò)在FVIIa-TF界面中的特定位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)二硫鍵，當(dāng)用TF飽和時(shí)，獲得了具 有與wt-FVIIa的醜胺分解活性相當(dāng)?shù)尼h胺分解活性的復(fù)合物。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"FVII(a)"涵蓋未分裂的酶原、FVII、W及分裂且因 此活化的蛋白酶FVIIa。FVII(a)包括FVII(a)的天然等位基因變體，其可W存在并從一 個(gè)個(gè)體到另一個(gè)個(gè)體中發(fā)生。SEQIDN0:1W及Proc.化tl.Acad.Sci.USA1986; 83:2412-2416中提供了一種野生型人FVII(a)氨基酸序列。
[0021] 本文中的術(shù)語(yǔ)"FVII(a)多膚"是指野生型FVII(a)分子W及FVII(a)變體， FVII(a)衍生物和FVII(a)綴合物。此類(lèi)變體、衍生物和綴合物可W表現(xiàn)出相對(duì)于野生型人 FVIIa基本上相同、降低或改善的生物和/或藥代動(dòng)力學(xué)活性。
[0022] 在本上下文中，術(shù)語(yǔ)"組織因子多膚"是指包含組織因子的可溶性外結(jié)構(gòu)域即氨 基酸1-219 (下文中被稱(chēng)作sTF或sTF(1-219))或其功能變體或截短形式的多膚。優(yōu)選 地，該組織因子多膚至少包含對(duì)應(yīng)于組織因子的氨基酸序列6-209的片段。特定實(shí)例為 sTF化-209)、sTF(1-209)和sTF(1-219)。
[0023] 上述復(fù)合物的FVII(a)多膚可W是包含用切S取代氨基酸殘基Gln64的SEQID NO: 1的FVII(a)變體。所述復(fù)合物的TF多膚可W是包含用切S取代氨基酸Glyl09的SEQ IDNO: 3的可溶性組織因子（sT巧變體。FVII(a)多膚進(jìn)一步包含廢除TF對(duì)FVIIa的變構(gòu)刺 激的一個(gè)或多個(gè)突變。因此獲得具有FVIIa蛋白酶結(jié)構(gòu)域的酶原樣構(gòu)象的復(fù)合物，導(dǎo)致接 近野生型醜胺分解活性和低程度的抗凝血酶III(ATIII)反應(yīng)性。例如，所述FVIIa多膚可 W進(jìn)一步包含用另一個(gè)天然存在的氨基酸殘基諸如Asp取代氨基酸殘基Met306WiocAe皿 (2001) 40,3251-3256) 〇
[0024] FVIIa多膚可W包含用天然存在的極性氨基酸殘基（即Arg、Asn、Asp、切S、Glu、 Gin、His、Lys、Ser、T虹或Tyr)取代氨基酸殘基Met306。
[00巧]FVIIa多膚可W包含用天然存在的非極性氨基酸殘基（即Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、T巧或Val)取代氨基酸殘基Me口06。
[0026] FVIIa多膚可W包含用天然存在的中性氨基酸殘基（即Ala、Asn、切S、Gin、Gly、 His、lie、Leu、Met、化6、Pro、Ser、1'虹、T巧、Tyr或Val)取代氨基酸殘基Me口06。
[0027]FVIIa多膚可W包含用在中性抑為酸性的天然存在的氨基酸殘基（即Asp或Glu) 取代氨基酸殘基Met306。
[002引 FVIIa多膚可W包含用在中性抑為堿性的天然存在的氨基酸殘基（即Arg、Lys或 化S)取代氨基酸殘基Met306。
[0029] FVIIa多膚可W包含用Asp取代氨基酸殘基Me口06。
[0030]FVIIa多膚可W包含用Ala取代氨基酸殘基Me口06。
[0031] FVIIa多膚可W包含用Arg取代氨基酸殘基Me口06。
[0032]FVIIa多膚可W包含用Asn取代氨基酸殘基Me口06。
[0033]FVIIa多膚可W包含用切S取代氨基酸殘基Me口06。
[0034]FVIIa多膚可W包含用Glu取代氨基酸殘基Me口06。
[00巧]FVIIa多膚可W包含用Gin取代氨基酸殘基Me口06。
[0036]FVIIa多膚可W包含用Gly取代氨基酸殘基Me口06。
[0037] FVIIa多膚可W包含用His取代氨基酸殘基Me口06。
[003引 FVIIa多膚可W包含用lie取代氨基酸殘基Met306。
[0039] FVIIa多膚可W包含用Leu取代氨基酸殘基Me口06。
[0040]FVIIa多膚可W包含用Lys取代氨基酸殘基Me口06。
[0041] FVIIa多膚可w包含用Met取代氨基酸殘基Me口06。
[0042] FVIIa多膚可W包含用Phe取代氨基酸殘基Me口06。
[0043] FVIIa多膚可W包含用Pro取代氨基酸殘基Me口06。
[0044] FVIIa多膚可W包含用Ser取代氨基酸殘基Me口06。
[0045] FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Me口06。
[0046] FVIIa多膚可W包含用T巧取代氨基酸殘基Me口06。
[0047] FVIIa多膚可W包含用Tyr取代氨基酸殘基Me口06。
[0048] FVIIa多膚可W包含用Val取代氨基酸殘基Me口06。
[0049] FVIIa多膚可W包含用Ser取代氨基酸殘基Me口06。
[0050] FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Me口06。
[0051] FVIIa多膚可W包含用Asn取代氨基酸殘基Me口06。
[005引為了使與TF的相互作用不穩(wěn)定，F(xiàn)VIIa多膚可W進(jìn)一步包含用另一個(gè)天然存在的 氨基酸殘基取代位置309的Asp,其可W由核酸構(gòu)建體編碼。
[005引 FVIIa多膚可W包含用天然存在的極性氨基酸殘基（即Arg、Asn、Asp、切S、Glu、 Gin、His、Lys、Ser、T虹或Tyr)取代氨基酸殘基Asp309。
[0054] FVIIa多膚可W包含用天然存在的非極性氨基酸殘基（即Ala、Gly、Ile、Leu、Met、 Phe、Pro、T巧或Val)取代氨基酸殘基Asp309。
[005引 FVIIa多膚可W包含用天然存在的中性氨基酸殘基（即Ala、Asn、切S、Gin、Gly、 His、lie、Leu、Met、化6、Pro、Ser、1'虹、T巧、Tyr或Val)取代氨基酸殘基Asp309。
[0056] FVIIa多膚可W包含用在中性抑為酸性的天然存在的氨基酸殘基（即Asp或Glu) 取代氨基酸殘基Asp309。
[0057] FVIIa多膚可W包含用在中性抑為堿性的天然存在的氨基酸殘基（即Arg、Lys或 化S)取代氨基酸殘基Asp309。
[0058] FVIIa多膚可W包含用Asp取代氨基酸殘基Asp309。
[0059] FVIIa多膚可W包含用Ala取代氨基酸殘基Asp309。
[0060] FVIIa多膚可W包含用Arg取代氨基酸殘基Asp309。
[0061] FVIIa多膚可W包含用Asn取代氨基酸殘基Asp309。
[0062] FVIIa多膚可W包含用切S取代氨基酸殘基Asp309。
[0063] FVIIa多膚可W包含用Glu取代氨基酸殘基Asp309。
[0064] FVIIa多膚可W包含用Gin取代氨基酸殘基Asp309。
[0065] FVIIa多膚可W包含用Gly取代氨基酸殘基Asp309。
[0066] FVIIa多膚可W包含用His取代氨基酸殘基Asp309。
[0067] FVIIa多膚可W包含用lie取代氨基酸殘基Asp309。
[0068] FVIIa多膚可W包含用Leu取代氨基酸殘基Asp309。
[0069] FVIIa多膚可W包含用Lys取代氨基酸殘基Asp309。
[0070] FVIIa多膚可W包含用Met取代氨基酸殘基Asp309。
[0071] FVIIa多膚可W包含用Phe取代氨基酸殘基Asp309。
[0072] FVIIa多膚可W包含用Pro取代氨基酸殘基Asp309。
[0073] FVIIa多膚可W包含用Ser取代氨基酸殘基Asp309。
[0074] FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Asp309。
[00巧]FVIIa多膚可W包含用T巧取代氨基酸殘基Asp309。
[0076]FVIIa多膚可W包含用Tyr取代氨基酸殘基Asp309。
[0077]FVIIa多膚可W包含用Val取代氨基酸殘基Asp309。
[0078]FVIIa多膚可W包含用Ser取代氨基酸殘基Asp309。
[0079]FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Asp309。
[0080]FVIIa多膚可W包含用Asn取代氨基酸殘基Asp309。
[0081]FVIIa多膚可W包含用Asp取代氨基酸殘基Met306和用Ser取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0082]FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Ala取代氨基酸殘基Met306和用Ser取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0083]FVIIa多膚可W包含用Ser取代氨基酸殘基Met306和用Ser取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0084]FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Met306和用Ser取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0085] FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Asn取代氨基酸殘基Met306和用Ser取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0086] FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Asp取代氨基酸殘基Met306和用Ala取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0087] FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Ala取代氨基酸殘基Met306和用Ala取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0088]FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Ser取代氨基酸殘基Met306和用Ala取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0089] FVIIa多膚可W包含用T虹取代氨基酸殘基Met306和用Ala取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0090] FVIIa多獻(xiàn)可W包含用Asn取代氨基酸殘基Met306和用Ala取代氨基酸殘基 Asp309〇
[0091] 還可W被取代W進(jìn)一步降低醜胺分解活性、同時(shí)維持相對(duì)高的蛋白水解活 性的FVII(a)蛋白酶結(jié)構(gòu)域的殘基列在Proc.化t.Acad.Sci.USA(1996)，93， 14379-14384 的表 1、BI和BII中。
[0092] 上述復(fù)合物的FVII(a)多膚可W與SEQIDNO: 1代表的FVII(a)多膚至少80%， 諸如至少85%，諸如至少90%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少 98%，諸如至少99 %相同。
[0093] 上述復(fù)合物的TF多膚可W與SEQIDN0:3代表的TF多膚至少80%，諸如至少 85%，諸如至少90%，諸如至少95%，諸如至少96%，諸如至少97%，諸如至少98%，諸如至 少99%相同。
[0094] 本領(lǐng)域中已知的術(shù)語(yǔ)"同一性"是指如通過(guò)比較序列確定的兩個(gè)或更多個(gè)多膚的 序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，"同一性"還意指如由兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的串之間 的匹配數(shù)確定的多膚之間的序列相關(guān)性程度。"同一性"測(cè)量了具有通過(guò)特定數(shù)學(xué)模型或 計(jì)算機(jī)程序（即"算法"）解決的缺口比對(duì)（如果有的話）的兩個(gè)或更多個(gè)序列之間中較 小者的相同匹配的百分比。易于通過(guò)已知方法計(jì)算相關(guān)膚的同一性。此類(lèi)方法包括，但不 限于那些在如下文獻(xiàn)中描述的方法；Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.,和Gridin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J., eds. , M. Stockton Press, New York, 1991;和Carillo等人，SIAM J. Applied Math. 48，1073 (1988)。
[0095] 設(shè)計(jì)用于測(cè)定同一性的優(yōu)選的方法，W給出測(cè)試序列之間的最大匹配。測(cè)定同一 性的方法在公開(kāi)可利用的計(jì)算機(jī)程序中描述。用于測(cè)定兩個(gè)序列之間同一性的優(yōu)選計(jì)算 機(jī)程序包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12，387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLAST?>BLASTN 和FASTA (Altschul等人，J. Mol. Biol. 215，403-410 (1990))?？蒞從化tional Center for Biotechnology Information (NCBI)和其它來(lái)源炬LAST Manual, Altschul等 人肥8/化]?/^祖66地63(13，1(1.20894;4113油111等人，同上）公共獲得化451《程序。 眾所周知的Smith waterman算法也可W用于測(cè)定同一'生。
[0096]例如，使用計(jì)算機(jī)算法GAP(GeneticsComputerGroup,Universityof Wisconsin,Madison,Wis.)，對(duì)待測(cè)定百分比序列同一'I"生的兩個(gè)多膚進(jìn)行序列對(duì)比，W達(dá) 到其各自氨基酸的最佳匹配（"匹配的跨度"，如通過(guò)算法測(cè)定的）。缺口開(kāi)放罰分（gap openingpenalty)(計(jì)算為3x對(duì)角線平均值（averagediagonal)對(duì)角線平均值"是所 用比較矩陣的對(duì)角線的平均值；"對(duì)角線"為通過(guò)特定比較矩陣指定各完美氨基酸匹配的評(píng) 分或數(shù)字）和缺口延長(zhǎng)罰分（通常為{分?jǐn)?shù)（l/l〇)}x缺口開(kāi)放罰分）W及比較矩陣，諸如 PAM250或化0SUM62與算法結(jié)合使用。算法還使用標(biāo)準(zhǔn)比較矩陣（參見(jiàn)：用于PAM250 比較矩陣：Dayhoff等人，AtlasofProteinSequenceandStructure,vol. 5,supp. 3 (1978);用于化0SUM62 比較矩陣；Hen化off等人，Proc.化tl.Acad.SciUSA(1992) 89， 10915-10919)。
[0097] 用于膚序列對(duì)比的優(yōu)選參數(shù)包括W下；算法；Needleman等人，J.Mol.Biol. 48，443-453 (1970);比較矩陣；BLOSUM62fromHenikoff等人，PNASUSA89， 10915-10919 (1992);缺口罰分；12，缺口長(zhǎng)度罰分；4，相似性闊值；0。
[0098]GAP程序利用上述參數(shù)是有用的。上述參數(shù)為使用GAP算法進(jìn)行膚對(duì)比（對(duì)末端 缺口而言無(wú)罰分）的默認(rèn)參數(shù)。
[009引術(shù)語(yǔ)"相似性"是相關(guān)的概念，但與"同一性"相比，是指包括相同匹配和保守取 代匹配的序列關(guān)系。如果兩個(gè)多膚序列具有，例如，（分?jǐn)?shù)（10/20))相同的氨基酸，并且 其余都是非保守取代，則百分比同一性和相似性將都是50%。如果，在相同實(shí)例中，多存 在5個(gè)有保守取代的位置，則同一性百分比仍然是50%，但相似性百分比將是75% (分?jǐn)?shù) (15/20))。因此，在存在保守取代的情況下，兩個(gè)多膚之間的相似性程度將比那兩個(gè)多膚之 間的百分比同一性更高。
[0100]FVII(a)-TF復(fù)合物的活性可w使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種方法進(jìn)行測(cè) 試。合適的方法包括實(shí)施例中詳細(xì)描述的體外基于溶液的蛋白水解測(cè)定法、體外醜胺分解 測(cè)定法、凝血彈性描記（TEG)測(cè)定法、氨甲醜化測(cè)定法、抑制測(cè)定法和體外抗凝血酶III抑 制測(cè)定法。
[0101] 如實(shí)施例中所示，本發(fā)明的FVII(a)-TF復(fù)合物在溶液中具有降低的醜胺分解活 性和降低的蛋白水解活性，同時(shí)在膜表面上保留高蛋白水解活性的期望特性。因此受體發(fā) 展彌散性血管內(nèi)凝血的風(fēng)險(xiǎn)盡可能降低。此外，復(fù)合物可W具有延長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間。進(jìn)一步 優(yōu)點(diǎn)是，復(fù)合物僅僅受其外位點(diǎn)特異性控制，該意味著例如蛋白酶活化受體（PARS)的裂解 將是低的。目前復(fù)合物的再進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)是，被引入的突變沒(méi)有表面暴露，因此降低了免疫原 性的風(fēng)險(xiǎn)。
[0102] 本文公開(kāi)的復(fù)合物的FVII(a)中間體可W是使用眾所周知的生產(chǎn)和純化方法血 漿來(lái)源的或重組產(chǎn)生的。本文公開(kāi)的復(fù)合物的TF中間體可W是使用眾所周知的生產(chǎn)和純 化方法重組產(chǎn)生的。糖基化、Y-駿化和其它翻譯后修飾的程度和位置可W根據(jù)選擇的宿 主細(xì)胞和其生長(zhǎng)條件而變化。
[0103] 因子VII多膚和組織因子多膚也可W共表達(dá)于細(xì)菌諸如大腸桿菌中或轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物諸如W0 05/075635中公開(kāi)的那些中。然后可W將FVII(a)和TF中間體交聯(lián)。
[0104] 在一個(gè)特別有趣的變體中，制備該復(fù)合物的方法涉及共表達(dá)因子VII多膚和組織 因子多膚，由此可在細(xì)胞內(nèi)容易建立兩個(gè)多膚之間的共價(jià)連接。
[0105] 一種可W產(chǎn)生二硫化物復(fù)合物的方法包括（a)用（i)包含編碼如本文定義的SEQ IDNO: 1的因子Vila變體的核酸分子和與其可操作連接的表達(dá)控制區(qū)域的表達(dá)載體；和 (ii)包含編碼如本文定義的SEQIDNO: 3的可溶性組織因子變體的核酸分子和與其可操作 連接的表達(dá)控制區(qū)域的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；化）在用于表達(dá)因子VII多膚和組織因子多膚 的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞；C)選擇使用FVII核酸分子的表達(dá)控制區(qū)域穩(wěn)定表達(dá)復(fù)合物的 細(xì)胞，和d)分離表達(dá)的復(fù)合物。
[0106] 蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知在細(xì)胞中的表達(dá)蛋白。在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)， 細(xì)胞通常為真核細(xì)胞，更優(yōu)選建立的真核細(xì)胞系，包括但不限于C冊(cè)（例如，ATCCC化61)、 C0S-1 (例如，ATCCC化1650)、幼倉(cāng)鼠腎炬HK)和肥K293 (例如，ATCCC化1573; Gr址am等人，J.Gen.Virol. 36:59-72，1977)細(xì)胞系。優(yōu)選的BHK細(xì)胞系為tk-tsl3 BHK細(xì)胞系（Waechter和Base;rga,Proc.化1:1.Acad.Sci.USA79:1106-1110, 1982)， 下文中稱(chēng)作BHK570細(xì)胞。該BHK570細(xì)胞系可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也（12301Parklawn Dr.，Rockville,MD20852)獲得，ATCC登錄號(hào)為邸L10314。tk-tsl3BHK細(xì)胞系也可 從ATCCW登錄號(hào)0?L1632獲得。優(yōu)選的CH0細(xì)胞系是可從ATCCW登錄號(hào)CC161獲得的 CH0K1細(xì)胞系。
[0107] 其它適合的細(xì)胞系包括但不限于大鼠化PI(大鼠肝癌；ATCCC化1600)、大鼠 舶PII(大鼠肝癌；ATCCC化 1548)、TCMK(ATCC(XL139)、人肺細(xì)胞（ATCC皿 8065)、 NCTC1469(ATCC(XL9. 1) ;DUKX細(xì)胞（C冊(cè)細(xì)胞系）（化laub和Chasin,Proc.化tl. Acad.Sci.USA77:4216-4220，1980)值UKX細(xì)胞也被稱(chēng)作DXBll細(xì)胞）和DG44(CHO 細(xì)胞系）（Cell, 33: 405, 1983,和SomaticCellandMolecularGenetics12: 555, 1986)。其它可用的是3T3細(xì)胞、Namalwa細(xì)胞、骨髓瘤W及骨髓瘤和其它細(xì)胞的融合體。在 一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞可為突變或重組細(xì)胞，諸如例如與它們的來(lái)源細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)定性 或定量不同范圍的催化蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的酶類(lèi)（例如，糖基化酶諸如糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖 巧酶，或加工酶諸如前膚）的細(xì)胞。合適的昆蟲(chóng)細(xì)胞系還包括但不限于鱗翅目細(xì)胞系，諸如 草地貪夜蛾（Spodopterafrugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾（Trichoplusiani)細(xì)胞（參見(jiàn)例 如US5,077,214)。
[010引在一些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞能夠在息浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。如本文中 所使用，能夠息浮的細(xì)胞為可W息浮生長(zhǎng)而不會(huì)形成大塊、堅(jiān)實(shí)凝聚物的細(xì)胞，即單分散， 或W松散凝聚物生長(zhǎng)且每個(gè)聚集物中僅包含數(shù)個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞。能夠息浮的細(xì)胞包括但不限 于不需要適應(yīng)或處理即可息浮生長(zhǎng)的細(xì)胞（諸如例如，造血細(xì)胞或淋己樣細(xì)胞）和已經(jīng)通 過(guò)粘附依賴(lài)細(xì)胞（諸如例如，上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞）的逐漸適應(yīng)為息浮生長(zhǎng)而變得能夠 息浮的細(xì)胞。
[0109] 用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞可為粘附細(xì)胞（也被稱(chēng)作銷(xiāo)定依賴(lài)細(xì)胞或粘附依賴(lài)細(xì) 胞）。如本文中所使用，粘附細(xì)胞是需要將自身粘附或銷(xiāo)定至合適表面W繁殖和生長(zhǎng)的細(xì) 胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用的細(xì)胞為粘附細(xì)胞。在該些實(shí)施方案中，繁殖階段和 生產(chǎn)階段兩者都包括使用微載體。使用的粘附細(xì)胞應(yīng)當(dāng)能夠在一個(gè)或多個(gè)繁殖階段過(guò)程中 遷移至載體上（如果使用大孔載體，則進(jìn)入載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)）并當(dāng)被轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)生物反應(yīng) 器時(shí)遷移至新的載體。如果粘附細(xì)胞自身不足W能夠遷移至新載體，則可通過(guò)將含有細(xì)胞 的微載體與蛋白水解酶類(lèi)或EDTA接觸將其從載體釋放。使用的培養(yǎng)基（特別當(dāng)不含動(dòng)物 來(lái)源的組分時(shí)）應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步含有適于支持粘附細(xì)胞的組分；適用于培養(yǎng)粘附細(xì)胞的培養(yǎng)基 可從供應(yīng)商獲得，諸如例如，Sigma。
[0110] 細(xì)胞也可W是息浮適應(yīng)的或能夠息浮的細(xì)胞。如果使用此類(lèi)細(xì)胞，則細(xì)胞繁殖可 在息浮液中進(jìn)行，因此微載體只用于生產(chǎn)培養(yǎng)容器本身中的最終繁殖階段和生產(chǎn)階段。在 使用息浮適應(yīng)的細(xì)胞的情況下，所使用的微載體通常為大孔載體，其中細(xì)胞通過(guò)物理捕獲 的方式附著于載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)內(nèi)。在此類(lèi)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞通常選自CH0、BHK、肥K293 和骨髓瘤細(xì)胞等。
[0111] 在其一個(gè)特別有趣的實(shí)施方案中，兩個(gè)多膚通過(guò)特異性連接的方式連接，更具體 而言是通過(guò)直接連接的方式，諸如因子VII多膚和組織因子多膚之間的一個(gè)或多個(gè)二硫 鍵。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備FVII(a)-TF復(fù)合物的方法涉及生產(chǎn)可溶性組織因 子的半脫氨酸變體，隨后用異雙官能試劑（其中官能團(tuán)之一為半脫氨酸反應(yīng)性的）標(biāo)記可 溶性組織因子的半脫氨酸，最后借助該試劑的第二個(gè)官能團(tuán)與因子Vila交聯(lián)。用于在大腸 桿菌中克隆和表達(dá)組織因子的半脫氨酸突變體W及隨后用半脫氨酸特異性試劑標(biāo)記的方 法先前已描述于（Stone等人（1995) Biochem. J., 310, 605-614; Rreskgjkrd等人（1996) Protein Sci.，5，1521-1540; Owenius等人（1999) Biophys. J.，77，2237-2250; 日sterlund等人（2001) Biochemistry, 40, 9324-9328)。使用含有一個(gè)半脫氨酸特異 性和一個(gè)光可激活官能團(tuán)的異雙官能試劑光交聯(lián)連接蛋白已描述于化ang等人（1995) Biochem. Bio地ys. Res. Commun., 217, 1177-1184。特別適合的異雙官能試劑的實(shí)例包 括對(duì)-疊氮楓己醜苯胺、對(duì)-疊氮苯甲醜甲基漠化物和對(duì)-疊氮漠己醜苯胺，
【權(quán)利要求】
1. 二硫鍵連接的復(fù)合物，所述復(fù)合物為（i)包含用Cys取代氨基酸殘基Gln64和用另 一個(gè)天然存在的氨基酸殘基取代氨基酸殘基Met306的SEQ ID N0:1的FVIIa變體和（ii) 包含用Cys取代氨基酸殘基Glyl09的SEQ ID N0:3的可溶性組織因子（sTF)變體的復(fù)合 物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被天然存在的極性氨基酸 殘基取代。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被Asp取代。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被天然存在的非極性氨基 酸殘基取代。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被Ala取代。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被天然存在的中性氨基酸 殘基取代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被Asn、Ser或Thr取代。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Met306被在中性pH為酸性的天 然存在的氨基酸殘基取代。 9. FVIIa多肽可以包含用在中性pH為堿性的天然存在的氨基酸殘基取代氨基酸殘基 Met306〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的二硫鍵連接的復(fù)合物，其進(jìn)一步包含用另一個(gè)天然 存在的氨基酸殘基取代氨基酸殘基Asp309。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的二硫鍵連接的復(fù)合物，其中所述Asp309被Ala或Ser取代。
12. 細(xì)胞，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的二硫鍵連接的復(fù)合物。
13. 制備根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的復(fù)合物的方法， 其包括： (i) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生包含用Cys取代氨基酸殘基Gln64和用另一個(gè)天然存在的 氨基酸殘基取代氨基酸殘基Met306的SEQ ID NO: 1的因子Vila變體； (ii) 在原核或真核細(xì)胞中產(chǎn)生包含用Cys取代氨基酸殘基Glyl09的SEQ ID NO: 3的 可溶性組織因子變體； (iii) 用其中官能團(tuán)之一是半胱氨酸反應(yīng)性的異雙官能試劑標(biāo)記Cys ; (iv) 借助所述異雙官能試劑的第二個(gè)官能團(tuán)將所述可溶性組織因子變體交聯(lián)至因子 Vila變體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的二硫鍵連接的復(fù)合物，其用作藥物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的二硫鍵連接的復(fù)合物，其用于治療凝血病。
【文檔編號(hào)】C12N9/64GK104395465SQ201380016758
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】H.奧斯特加爾德, A.L.尼伊森, O.H.奧爾森 申請(qǐng)人:諾和諾德保健Ag（股份有限公司）