來源于甘蔗野生種基因組的莖長相關標志物及其利用的制作方法
【專利摘要】提供禾本科植物的量的性狀中與莖長相關的標志物。禾本科植物莖長相關標志物，包含從由禾本科植物的染色體中的序列號1所示的堿基序列和序列號2所示的堿基序列所夾的區(qū)域中選擇的連續(xù)的核酸區(qū)域。
【專利說明】來源于甘蔗野生種基因組的莖長相關標志物及其利用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及能夠挑選具有甘蔗野生種所特有的莖長的性狀的禾本科植物的莖長 相關標志物及其利用方法。

【背景技術】
[0002] 甘蔗除了為了砂糖的原料、酒類原料等食用而栽培之外，還在包含作為生物燃料 原料的利用的各種產(chǎn)業(yè)領域被利用。在這樣的狀況下，有開發(fā)具有所期望的特性（例如，糖 含量、生長力的增強、新芽形成能力、耐病性和蟲害抵抗性、耐寒性、葉長的增大、葉面積的 增大、莖長的增大等）的甘蔗植物的新品種的需要。另外，對于包含甘蔗的禾本科植物，也 可以全面地在酒類原料和/或生物燃料原料中利用。
[0003] 對于甘蔗和/或稻、玉米等禾本科植物，以現(xiàn)有品種的改良、即具有所期望的性狀 的新品種的制成等為目的的交配廣泛進行。一般地，作為植物品種?系統(tǒng)的識別，有比較 特性數(shù)據(jù)的"特性比較"、在同一條件下栽培而進行比較的"比較栽培"、分析DNA的"DNA分 析"3種方法。利用特性比較和比較栽培的系統(tǒng)識別存在根據(jù)栽培條件的不同而精度低下 和/或需要巨大工時的長時間的農(nóng)場調(diào)查等大量問題。
[0004] 特別是，甘蔗與其他作物相比植物體極大，難以實施利用農(nóng)場調(diào)查的系統(tǒng)識別。另 夕卜，甘蔗的新品種制成，要首先通過交配制作數(shù)萬種的交配種，從中進行種子發(fā)芽生長挑 選、進而階段性地挑選優(yōu)良的系統(tǒng)，最終獲得具有所希望的特性的2?3種新品種。這樣， 甘蔗的新品種制成需要對非常多的系統(tǒng)進行栽培?評價，準備如上所述的溫室和/或農(nóng)場 需要花費巨大的工夫。
[0005]因此，要求開發(fā)使用在基因組中存在的標志物來識別具有所期望的特性的禾本科 植物、特別是甘蔗系統(tǒng)的方法。特別是在使用甘蔗的新品種制成時，如果能夠?qū)τ诟鞣N特性 使用優(yōu)異的標志物，則可以避免如上所述的甘蔗所特有的諸問題，能夠成為非常有效的工 具。然而，甘蔗植物由于為高倍體性、染色體數(shù)多（約1〇〇?130)、標志物技術開發(fā)緩慢。 對于甘蔗，雖然USDA有關于使用SSR標志物的基因型確定的報告（非專利文獻1)，但由于 標志物數(shù)和來自各標志物的多態(tài)性數(shù)少，因而精度低，適用范圍限于美洲、澳大利亞品種， 因此不能在日本國內(nèi)和臺灣、印度等的主要品種和有用的遺傳資源的系統(tǒng)識別中利用。
[0006] 另外，非專利文獻2顯示了通過增加標志物數(shù)、比較、驗證各個標志物的特性關系 來制作甘蔗的基因圖譜的可能性。然而，非專利文獻2中沒有公開充分數(shù)量的標志物，也沒 有發(fā)現(xiàn)與目的特性連鎖的標志物。
[0007] 作為標志物開發(fā)的一例，可列舉例如，如專利文獻1所記載的那樣，開發(fā)甜菜中的 黑根病抵抗性相關標志物。另外，如專利文獻2所示，開發(fā)了在玉米中利用與目的性狀連鎖 的標志物來挑選品種的技術。
[0008] 此外，甘鹿有稱為野生種（學名：Saccharum spontaneum L.)的品種。作為該甘 蔗野生種，已知印度尼西亞等的Glagah、日本國內(nèi)能見到的^七才A于、孟加拉語圈中的 Kash (Kans Grass)等。Glagah、^七才/S'于、Kash均是當?shù)氐母事挂吧N的一般慣稱。此 夕卜，為了指特定的品種?系統(tǒng)，根據(jù)需要，有時使用帶有收集地名和/或各國的收集號等信 息的個別系統(tǒng)名。甘蔗野生種一般具備生長繁殖旺盛且環(huán)境耐性能力高這樣的特征，具有 細而強韌的莖，纖維多，對萎縮病、黃條病等病蟲害的抵抗性優(yōu)異。含糖率一般較低，Glagah 多為1?3%以下，日本國內(nèi)收集的甘蔗野生種也發(fā)現(xiàn)超過10%的個體等，變異的幅度大。
[0009] 通過與這樣的甘蔗野生種的種間雜交和/或?qū)匍g雜交，可以將甘蔗野生種所具有 的優(yōu)異的莖伸長性、多秸性等特性導入制糖用品種和/或除甘蔗以外的禾本科植物品種 中。經(jīng)驗上已知種間雜種中低溫伸長性和/或最終的莖長優(yōu)異的系統(tǒng)多，推定甘蔗野生種 基因組中有制糖用品種中沒有的、帶來莖長的增加的獨特基因。然而，關于甘蔗野生種的各 種特性的標志物完全未被知曉，現(xiàn)狀是為了挑選具有這樣的特性的種間雜種和/或?qū)匍g雜 種，如上所述，只有花費巨大工夫的方法。
[0010] 現(xiàn)有技術文獻
[0011] 專利文獻
[0012] 專利文獻 I :W0 2007/125958
[0013] 專利文獻2:日本特開2010-516236號公報
[0014] 非專利文獻
[0015]非專利文獻 I :Maydica 48 (2003) 319_329"Molecular genotyping of sugarcane clones with microsatellite DNA markers，'
[0016]非專利文獻 2:Nathalie Piperidis et al.，Molecular Breeding, 2008, Vol21, 233-247


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 發(fā)明要解決的課題
[0018] 于是，本發(fā)明的目的在于提供與甘蔗野生種中的莖長特性相關的、來源于甘蔗野 生種基因組的莖長相關標志物及其利用。
[0019] 用于解決課題的方法
[0020] 本
【發(fā)明者】們?yōu)榱私鉀Q上述課題而反復進行了深入研究，結果，準備包含甘蔗野生 種的甘蔗植物中的多種標志物，通過雜交后代系統(tǒng)中的量的性狀與標志物的連鎖分析，從 而發(fā)現(xiàn)了與莖長這樣的量的性狀連鎖的來源于甘蔗野生種的標志物，從而完成了本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明包含以下（1)?（6)。
[0022] (1)禾本科植物莖長相關標志物，包含從由禾本科植物的染色體中的序列號1所 示的堿基序列和序列號2所示的堿基序列所夾的區(qū)域中選擇的連續(xù)的核酸區(qū)域。
[0023] (2)根據(jù)（1)所述的禾本科植物莖長相關標志物，其特征在于，所述核酸區(qū)域包含 序列號1或2所記載的堿基序列或該堿基序列的一部分。
[0024] (3)根據(jù)（1)所述的禾本科植物莖長相關標志物，其特征在于，所述禾本科植物的 一方的親本是甘蔗野生種。
[0025] (4)莖長增大的禾本科植物的制造方法，包括：
[0026] 提取禾本科植物的染色體和/或該禾本科植物的親本的染色體的工序；和
[0027] 測定上述所得的染色體中存在還是不存在上述（1)?（3)的任一項所述的禾本科 植物莖長相關標志物的工序。
[0028] (5)根據(jù)（4)所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，所述禾本科植物是種子 或幼苗，從該種子或幼苗提取染色體。
[0029] (6)根據(jù)⑷所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，還包括：使一方的親本 為甘蔗野生種,通過交配來制作所述禾本科植物的工序。
[0030] 本說明書包含作為本申請的優(yōu)先權基礎的日本專利申請2012-069850號的說明 書和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0031] 發(fā)明的效果
[0032] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供甘蔗等禾本科植物中的量的性狀中與莖長連鎖的新的禾本 科植物莖長相關標志物。通過利用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物，可以鑒定甘蔗等 禾本科植物的交配系統(tǒng)中的莖長。由此，可以非常低成本地識別具有莖長增大的特性的禾 本科植物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是顯示對于實施例中使用的甘蔗品種?系統(tǒng)群進行測量而得的莖長數(shù)據(jù)的特 性圖。
[0034] 圖2是顯示關于莖長的QTL分析的結果（S3-19中的第10連鎖群）的特性圖。
[0035] 圖3是顯示各系統(tǒng)中的S310951的信號值的特性圖。
[0036] 圖4是顯示各系統(tǒng)中的S311375的信號值的特性圖。

【具體實施方式】
[0037]以下，對于本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物及其利用方法、特別是使用禾本 科植物莖長相關標志物的禾本科植物的制造方法進行說明。
[0038] <禾本科植物莖長相關標志物>
[0039] 本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物是在甘蔗等禾本科植物的染色體上存在的 特定區(qū)域，與禾本科植物的莖長這樣的性狀的應答基因（群）連鎖，具有能夠判別禾本科植 物的莖長這樣的性狀的功能。即，在使用已知的甘蔗系統(tǒng)等禾本科植物得到的后代系統(tǒng)中， 通過確認禾本科植物莖長相關標志物存在還是不存在，可以判斷是否是具有莖長的增大這 樣的性狀的系統(tǒng)。
[0040] 另外，本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物，是與莖長增大的性狀連鎖的標志物。 例如，可以判斷，在特定的禾本科植物中，如果存在本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物， 則具有莖長增大的特征。這里，莖長的增大是特別包含生長繁殖初期的莖長的增大的含義， 可以換句話說成生長繁殖初期的莖伸長速度快。莖長在甘蔗的情況下，是指對于株中的最 高莖，從發(fā)芽位置到+1葉（最上展開葉）的肥厚帶的高度。初期的莖長在日本國內(nèi)的情況 下，一般是指從發(fā)芽后開始5個月的期間中的莖長（根據(jù)栽培地域、耕作類型等而期間可以 變化）。
[0041] 這里，對禾本科植物不特別限定，指屬于禾本科的植物。即，本發(fā)明的禾本科植物 莖長相關標志物可以對于分類于禾本科的所有植物使用。此外，禾本科植物進一步分類為 竹亞科、早熟禾亞科、才U 5亞科和黍亞科。
[0042] 詳細地，在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中， 竹亞科包含青籬竹屬（Arundinaria)、簕竹屬（Bambusa)、方竹屬（Chimonobambusa)、丘斯夸竹屬（Chusquea)、牡竹屬（Dendrocalamus)、梨竹屬（Melocanna)、銳藥竹屬 (Oxytenanthera)、剛竹屬（Phyllostachys)、大明竹屬（Pleioblastus)、荼軒竹屬 (Pseudosasa)、赤竹屬（Sasa)、華箬竹屬（Sasamorpha)、業(yè)平竹屬（Semiarundinaria)、倭 竹屬（Shibataea)、唐竹屬（Sinobambusa)、四方竹屬（Tetragonocalamus)的植物。
[0043] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，早熟禾亞科包 含茼草屬（Beckmannia)、短柄草屬（Brachypodium)、凌風草屬（Briza)、雀麥屬（Bromus)、 鴨茅屬（Dactylis)、羊茅屬（Festuca)、甜茅屬（Glyceria)、9 7 A 7 屬（Lamarckia)、 黑麥草屬（Lolium)、臭草屬（Melica)、早熟禾屬（Poa)、堿茅屬（Puccinellia)、天藍草 屬（Sesleria)、三齒稃屬（Triodia)、冰草屬（Agropyron)、披堿草屬屬（Elymus)、大麥 屬（Horudeum)、黑麥屬（Secale)、小麥屬（Triticum)、剪股穎屬（Agrostis)、燕麥草屬 (Arrhenatherum)、燕麥屬（Avena)、發(fā)草屬（Deschampsia)、異燕麥屬（Helictotrichon)、 絨毛草屬（Holcus)、洽草屬（Koeleria)、兔尾草屬（Lagurus)、蘆竹屬（Arundo)、蒲華 屬（Cortaderia)、箱根草屬（Hakonechloa)、麥氏草屬（Molinia)蘆華屬（Phragmites)、 野古草屬（Arundinella)、口 々 ^ 7屬（Loudetia)、苔草屬（Tristachya)、藹草屬 (Phalaris)、米草屬（Spartina)粟草屬（Milium)和針茅屬（Stipa)的植物。
[0044] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，$々9 4 7亞 科（micrairoideae)包含 $ 夕 9 4 9 屬（Micraira)的植物。
[0045] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，畫眉草亞 科包含雙稃草屬（Diplachne)、糝屬（Eleusine)、畫眉草屬（Eragrostis)、亂子草屬 (Muhlenbergia)、鼠尾粟屬（Sporobolus)、草沙蠶屬（Tripogon)、虎尾草屬（Chloris)、狗 牙根屬（Cynodon)、三芒草屬（Aristida)和結縷草屬（Zoysia)的植物。
[0046] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，稻亞科包含假 稻屬（Leersia)、稻屬（Oryza)和菰屬（Zizania)的植物。
[0047] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，才U 9亞科包 含才y 7屬（Ollyra)、夕y 7。卜夕口 7屬（Cryptochloa)和囊稃竹屬（Leptaspis)的植物。
[0048] 在能夠使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物中，黍亞科包含 臂形草屬（Brachiaria)、馬唐屬（Digitaria)、稗屬（Echinochloa)、黎屬（Panicum)、雀 稗屬（Paspalum)、狼尾草屬（Pennisetum)、狗尾草屬（Setaria)和柳葉箬屬（Isachne)、 須芒草屬（Andropogon)、裂稃草屬（Schizoachyrium)、草草屬（Arthraxon)、孔穎草屬 (Bothriochloa)、香茅屬（Cymbopogon)、鱅茅屬（Dimeria)、油芒屬（Eccoilopus)、鹿茅屬 (Erianthus)、蜈般草屬（Eremochloa)、金茅屬（Eulalia)、牛鞭草屬（Hemarthria)、白茅屬 (Imperata)、鴨嘴草屬（Ischaemum)、莠竹屬（Microstegium)、芒屬（Miscanthus)、束尾草 屬（Phacelurus)、金發(fā)草屬（Pogonatherum)、甘鹿屬（Saccharum)、高粱屬（Sorghum)、菅屬 (Themeda)、薏該屬（Coix)和玉米屬（Zea)的植物。
[0049] 本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物可以適用于分類于這些亞科的全部禾本科 植物。即，例如，通過對于這些禾本科植物的后代系統(tǒng)檢測本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標 志物存在還是不存在，可以對于該后代系統(tǒng)判斷是否具有莖長增大的性狀。
[0050]特別是作為適合使用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物的禾本科植物，優(yōu)選甘 蔗屬所歸屬的黍亞科的植物和來自該植物的后代系統(tǒng)。尤其對于通過以至少一方親本為甘 蔗的交配而獲得的后代系統(tǒng)，優(yōu)選利用本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物來判斷關于莖 長的性狀。此外，甘蔗屬的植物與例如芒、高粱、蔗茅等植物的"種?屬間交配"可以通過現(xiàn) 有公知的方法來實施。
[0051] 此外，甘蔗是指屬于禾本科甘蔗屬的植物。另外，甘蔗是包含所謂高貴種（學名： 甘鹿（Saccharum officinarum))和野生種（學名：甜根子草（Saccharum spontaneum))、細 桿甘鹿種（Saccharum barberi)、竹鹿種（Saccharum sinense)、作為高貴種的祖先種的大 莖野生種（Saccharum robustum)的任一者的含義。作為已知的甘鹿品種?系統(tǒng)不特別限 定，是包含日本國內(nèi)可使用的所有品種?系統(tǒng)、日本以外的國家使用的品種?系統(tǒng)等的含 義。例如，作為甘蔗的日本國內(nèi)育成品種不特別限定，可列舉Nil、NiN2、NiF3、NiF4、NiF5、 Ni6、NiN7、NiF8、Ni9、NiTnl0、Nill、Nil2、Nil4、Nil5、Nil6、Nil7、NiTnl9、NiTn20、Ni22 和 Ni23等。另外，作為甘蔗日本國內(nèi)主要品種不特別限定，可列舉NiF8、Ni9、NiTnlO和Nil5 等。進而，作為甘蔗日本國內(nèi)主要引入品種不特別限定，可列舉F177、Nc 〇310和F172等。 另外，作為甘鹿野生種不特別限定，可列舉Glagah Kloet、Glagah 1286、Mandalay、SES14、 US56-15-8 和 JW599 等。
[0052] 特別是對于通過以具有初期的莖長優(yōu)異這樣的性狀的甘蔗野生種和/或該野生 種的后代系統(tǒng)（例如，S3-19)作為一方親本的交配而得的后代系統(tǒng)，優(yōu)選利用本發(fā)明的禾 本科植物莖長相關標志物來判斷關于莖長的性狀。本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物與 來源于具有初期的莖長優(yōu)異這樣的性狀的甘蔗野生種Glagah的系統(tǒng)S3-19的染色體區(qū)域 對應，與該野生種所具有的莖長的性狀相關。因此，通過檢測本發(fā)明的禾本科植物莖長相關 標志物存在還是不存在，可以確認檢查對象的后代品種是否繼承了初期的莖長優(yōu)異這樣的 性狀。
[0053] 此外，后代系統(tǒng)既可以是母本和父本兩方都是甘蔗品種?系統(tǒng)的同種交配的系統(tǒng)， 也可以是任一方是甘鹿品種?系統(tǒng)、另一方是親緣的斑茅（Erianthus arundinaceus)那樣 的雜交系統(tǒng)。另外，后代品種可以通過所謂回交來獲得。
[0054] 本發(fā)明的禾本科植物莖長相關標志物是由NiF8、S3-19和雜交后代214系統(tǒng)的 信號數(shù)據(jù)，通過使用包含來源于NiF8的9, 485個標志物和來源于S3-19的11，238個標 志物的基因連鎖圖譜與莖長數(shù)據(jù)的QTL(數(shù)量性狀位點，Quantitative Trait Loci)分 析而新鑒定的。此外，莖長被認為與多個基因相關，是采取連續(xù)分布的量的性狀。QTL分 析使用遺傳分析軟件 QTL Cartographer (Wang S.，C.J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5.Department of Statistics, North Carolina State University，Raleigh，NC)，應用 Composite interval mapping(復合區(qū)間作圖法，CIM)法。 此外，由甘蔗的染色體獨自獲得的來源于NiF8的9, 485個標志物和來源于S3-19的11，238 個標志物，可以使用具有通過日本特開2011-120558號公報和W02011/074510號公報所公 開的方法設計的探針的DNA微陣列。
[0055] 具體地，通過上述的QTL分析，在上述基因連鎖圖譜中發(fā)現(xiàn)了優(yōu)勢對數(shù)分值（L0D score)為規(guī)定的閾值（例如2. 5)以上的區(qū)域。即，在S3-19的第10連鎖群的約93. 72cM(分 摩爾根）的位置特定了包含約5.38cM的區(qū)域作為莖長相關QTL區(qū)域。這里，"摩爾根（M) " 是相對地顯示染色體上的基因間的距離的單位，是將交叉值作為百分數(shù)而得的值。在甘蔗 的染色體上，IcM相當于約2000kb。此外，顯示該峰位置或其附近存在使S3-19和/或作為 其親本的野生種Glagah中的莖長增大的性狀的應答基因（群）。
[0056] 上述約5. 38cM的區(qū)域是由表1所示的標志物S310951和S311375所夾入的區(qū)域。
[0057]表1
[0058]

【權利要求】
1. 禾本科植物莖長相關標志物，包含從由禾本科植物的染色體中的序列號1所示的堿 基序列和序列號2所示的堿基序列所夾的區(qū)域中選擇的連續(xù)的核酸區(qū)域。
2. 根據(jù)權利要求1所述的禾本科植物莖長相關標志物，其特征在于，所述核酸區(qū)域包 含序列號1或2所記載的堿基序列或該堿基序列的一部分。
3. 根據(jù)權利要求1所述的禾本科植物莖長相關標志物，其特征在于，所述禾本科植物 的一方的親本是甘蔗野生種。
4. 莖長增大的禾本科植物的制造方法，包括： 提取禾本科植物的染色體和/或該禾本科植物的親本的染色體的工序；和 測定上述所得的染色體中存在還是不存在權利要求1?3的任一項所述的禾本科植物 莖長相關標志物的工序。
5. 根據(jù)權利要求4所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，所述禾本科植物是種 子或幼苗，從該種子或幼苗提取染色體。
6. 根據(jù)權利要求4所述的禾本科植物的制造方法，其特征在于，還包括：使一方的親本 為甘蔗野生種,通過交配來制作所述禾本科植物的工序。
【文檔編號】C12N15/09GK104321440SQ201380016777
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月26日 優(yōu)先權日:2012年3月26日
【發(fā)明者】島田武彥, 榎宏征, 西村哲, 木村達郎, 水藤百江, 石川葉子, 寺內(nèi)方克, 服部太一朗, 境垣內(nèi)岳雄 申請人:豐田自動車株式會社